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फ्लोएम और संयंत्र-एसएपी-खिला Hemipteran कीड़ों में आरएनए हस्तक्षेप प्रेरित करने के लिए डबल-असहाय आरएनए मौखिक वितरण विधियों

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57390
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Horticultural Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

यह लेख फ्लोएम में आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) के लिए पौधों की संवहनी ऊतकों के माध्यम से डबल-कतरा आरएनए (dsRNA) के मौखिक वितरण के लिए विकसित उपन्यास तकनीकों को प्रदर्शित करता है कीड़े खिला.

Abstract

फ्लोएम और पौधों को खिलाने वाले कीड़ों फसलों और फलों की अखंडता पर आक्रमण करने के लिए पोषक तत्वों को पुनः प्राप्त, खाद्य फसलों हानिकारक प्रक्रिया में । Hemipteran कीड़ों पौधों की आर्थिक रूप से पर्याप्त कीट है कि फ्लोएम एसएपी पर खिलाने से फसलों को नुकसान के कारण के लिए खाते । ब्राउन marmorated बदबू बग (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) और एशियाई खट्टे psyllid (एसीपी), Diaphorina सिट्री Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) hemipteran कीट कीट उत्तरी अमेरिका में शुरू कर रहे हैं, जहां वे उच्च मूल्य विशेषता, पंक्ति के एक इनवेसिव कृषि कीट हैं, और स्टेपल फसलों और खट्टे फल, साथ ही साथ एक उपद्रव कीट जब वे कुल घर के भीतर । कई प्रजातियों में कीटनाशक प्रतिरोध कीट प्रबंधन रणनीतियों के वैकल्पिक तरीकों के विकास के लिए प्रेरित किया है । डबल-कतरा आरएनए (dsRNA)-मध्यस्थता आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन है कि कीट कीट के प्रबंधन के लिए एक उपकरण के रूप में संभावित अनुप्रयोगों के लिए एक जीन मुंह बंद करने तंत्र है । Exogenously संश्लेषित dsRNA या छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) अंतर्जात आरएनए के क्षरण के माध्यम से अत्यधिक कुशल जीन मुंह बंद करने को ट्रिगर कर सकते हैं, जो कि प्रस्तुत करने के लिए मुताबिक़ है. hemipteran कीटों के नियंत्रण के लिए आणविक जैव कीटनाशकों के रूप में RNAi के प्रभावी और पर्यावरणीय उपयोग की आवश्यकता है vivo डिलीवरी के माध्यम से dsRNAs की फीडिंग में । यहां हम कीड़ों को dsRNA के वितरण के लिए तरीकों का प्रदर्शन: हरी सेम में विसर्जन द्वारा dsRNA की लोडिंग, और जीन की अवशोषित घूस के माध्यम से मौखिक प्रसव के साथ विशिष्ट dsRNA । हम भी पत्तियों स्प्रे, जड़ सराबोर, ट्रंक इंजेक्शन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्ले granules, सभी जिनमें से dsRNA के निरंतर जारी करने के लिए आवश्यक हो सकता है का उपयोग कर गैर ट्रांसजेनिक संयंत्र वितरण दृष्टिकोण रेखांकित किया है । मौखिक रूप से घूस dsRNA द्वारा कुशल प्रसव एक प्रभावी खुराक के रूप में इस तरह के किशोर हार्मोन एसिड ओ-methyltransferase (JHAMT) और vitellogenin (वी. पी.) के रूप में लक्षित जीन की अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण कमी पैदा करने के लिए पुष्टि की थी । इन अभिनव तरीकों dsRNA के वितरण के लिए फसल संरक्षण में उपयोग और कीट प्रबंधन के लिए पर्यावरणीय चुनौतियों से उबरने के लिए रणनीतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Introduction

Hemipteran कीटों में सबसे अधिक जनसंख्या वृद्धि और पौधों में फैलने वाली बीमारियों को प्राप्त करने के लिए उनकी क्षमता के agriculturebecause के आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण कीट शामिल हैं । BMSB, एच halys Stål, एक आक्रामक कीट है कि गलती से Allentown में पश्चिमी गोलार्द्ध में शुरू किया गया था, एशिया से पेंसिल्वेनिया (चीन, ताइवान, कोरिया, और जापान) पहली sighting के साथ १९९६1में सूचना दी । अपनी शुरूआत के बाद से, BMSB ४३ राज्यों में पाया गया है, मध्य अटलांटिक में सबसे अधिक आबादी के साथ (DE, एमडी, फिलीस्तीनी अथॉरिटी, एनजे, VA, और वेस्ट वर्जीनिया), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कनाडा और यूरोप में, और कृषि के लिए एक संभावित खतरे का प्रतिनिधित्व करता है2। एक polyphagous कीट के रूप में, BMSB उच्च मूल्य फसलों जैसे सेब, अंगूर, सजावटी पौधे, बीज फसलों, सोयाबीन, और मकई सहित लगभग ३०० की पहचान की संयंत्र मेजबान को नुकसान भड़काने कर सकते हैं । नुकसान मुख्य रूप से रुखा और फ्लश के रूप में जाना जाता है जहां पशु अपनी सुई की तरह stylet के साथ मेजबान फसल संवहनी ऊतकों2,3से पोषक तत्वों का उपयोग करने के लिए लाभ के रूप में जाना जाता खिला की विधा के कारण होता है । BMSB भी एक इनडोर कीट के रूप में वे ऐसे स्कूलों और घरों में सर्दियों के माध्यम से शरद ऋतु के दौरान2के रूप में रहने वाले क्षेत्रों में निवास मिल सकता है । BMSB द्वारा जारी रसायनों और aeroallergens फलों की फसल श्रमिकों में अवैध एलर्जी की प्रतिक्रिया को सूचित किया गया । BMSB भी संवेदनशील व्यक्तियों4,5में जिल्द की सूजन, नेत्रश्लेष्मलाशोथ, और rhinitis के लिए अग्रणी एलर्जी रोग के लिए योगदान कर सकते हैं । एक अन्य hemipteran कीट, एसीपी, डी. सिट्री Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), खट्टे फलों का एक गंभीर कीट है, और फ्लोएम सीमित जीवाणुओं (कैंडिडेटस Liberibacter asiaticus) के कारण Huanglongbing (HLB) को पहुंचाता है, बेहतर ज्ञात खट्टे हरियाली रोग के रूप में6,7. HLB पहले दक्षिणी चीन से सूचित किया गया था और ४० विभिंन एशियाई, अफ्रीकी, Oceanian, दक्षिण और उत्तर अमेरिकी देशों के7में फैल गया है । खट्टे हरियाली खट्टे फल हानि के कारण आर्थिक और वित्तीय घाटे की धमकी के साथ एक विश्वव्यापी समस्या है; इसलिए, एसीपी के प्रबंधन को रोकने और HLB को नियंत्रित करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण माना जाता है ।

इन कीट कीट के प्रभावी नियंत्रण के लिए उपाय आमतौर पर रासायनिक कीटनाशकों के आवेदन की आवश्यकता होती है जो अपेक्षाकृत कम रहते हैं । रासायनिक कीटनाशक नियंत्रण रणनीतियों अक्सर सुरक्षित पर्यावरण प्रबंधन रणनीतियों की कमी है या कीट आबादी8,9में कीटनाशक प्रतिरोध के कारण संवेदनशीलता में कमी आई है । इसलिए, आणविक जैव कीटनाशकों के साथ कीट के जैविक नियंत्रण एक संभावित विकल्प है, लेकिन इसके उपयोग विश्व स्तर पर मामूली बनी हुई है, और परजीवी की विभिन्न प्रजातियों (जैसे, Trisolcus japonicus) भी प्रभावी हो सकता है के रूप में प्राकृतिक जैविक नियंत्रण. RNAi आणविक जैव कीटनाशकों के साथ इनवेसिव कीट कीट के प्रबंधन के लिए एक संभावित उभरती हुई प्रौद्योगिकी है10। RNAi एक अच्छी तरह से वर्णित जीन विनियामक तंत्र है कि अंतर्जात के प्रभावी posttranscriptional जीन मुंह बंद करने की सुविधा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक अनुक्रम में dsRNAs हमला विशेष तरीके से, कि अंततः mRNA में जीन अभिव्यक्ति के विनियमन की ओर जाता है तर११,१२. संक्षेप में, जब exogenous dsRNA एक कोशिका यह siRNAs में bidentate nuclease RNase III superfamily के एक सदस्य द्वारा संसाधित किया जाता है में आंतरिक है, Dicer कहा जाता है, जो कीड़े में संरक्षित evolutionarily है, मक्खियों, पौधों, कवक, और स्तनधारियों13, 14 , 15. ये 21-25 न्यूक्लियोटाइड सिरना डुप्लेक्स तब जख्मी और एकीकृत आरएनए-प्रेरित मुंह बंद करने कॉम्प्लेक्स (RISC) में मार्गदर्शक RNAs के रूप में हैं । यह RISC-आरएनए कॉम्प्लेक्स वाट्सन-क्रिकेटरों आधार को पूरक लक्ष्य mRNA में बाँधने की अनुमति देता है; यह अंततः Argonaute प्रोटीन, एक बहु डोमेन एक RNase एच-डोमेन, जो इसी mRNA नीचा और प्रोटीन अनुवाद कम कर देता है, जिससे posttranscriptional जीन मुंह बंद करने के लिए अग्रणी युक्त प्रोटीन द्वारा दरार की ओर जाताहै 16 , 17 , 18.

कीट प्रबंधन के लिए RNAi हित के जीन मौन करने के लिए vivo में dsRNA के परिचय की आवश्यकता है, जिससे सिरना मार्ग को सक्रिय. विभिंन तरीकों कि कीड़ों और कीट कोशिकाओं को dsRNA वितरण के लिए इस्तेमाल किया गया है प्रणालीगत RNAi10,19, भिगोने20,21, microinjection22, वाहकों जैसे liposomes खिला शामिल 23, और अंय तकनीकों24। RNAi पहले Caenorhabditis एलिगेंस में unc-22 आग और मेलो25द्वारा जीन अभिव्यक्ति, frizzled Drosophila26में melanogaster जीन की अभिव्यक्ति में पछाड़ना द्वारा पीछा प्रदर्शन किया गया । प्रारंभिक कार्यात्मक अध्ययन dsRNA कीड़ों में उद्धार करने के लिए उपयोग microinjection, जैसे कि Apis अफ्रिकन22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29, एच halys30, और lepidopteran कीड़े (Terenius एट अल द्वारा समीक्षित । 31). Microinjection कीट में ब्याज की साइट के लिए एक सटीक और सटीक खुराक देने के लिए लाभप्रद है । हालांकि इस तरह के सेप्टिक पंचर प्रतिरक्षा संबंधित जीन की अभिव्यक्ति को३२आघात के कारण, इसलिए, कृषि जैव कीटनाशक विकास में अपनी व्यावहारिकता सत्तारूढ़ बाहर निकाल सकते हैं ।

dsRNA vivo में पहुंचाने की एक और विधि भिगोने द्वारा है, जो dsRNA युक्त extracellular माध्यम में आम तौर पर पशुओं या कोशिकाओं के निलंबन के द्वारा घूस या dsRNA के अवशोषण शामिल है । भिगोने के लिए कुशलतापूर्वक Drosophila S2 ऊतक संस्कृति कोशिकाओं में RNAi प्रेरित इस्तेमाल किया गया है के बहाव को बाधित-Raf1 (DSOR1) mitogen-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे कळेनासे (MAPKK)20, के रूप में अच्छी तरह के रूप में सी. एलिगेंस में मौन करने के लिए पीओएस-1 जीन३३। हालांकि, dsRNA भिगोने का उपयोग कर दिया कम कुशल है RNAi प्रेरित करने के लिए microinjection20की तुलना में । एक चबाने कीट में RNAi मध्यस्थता मुंह बंद करने पहले पश्चिमी मकई rootworm (WCR)(Diabrotica virgifera virgifera) में एक कृत्रिम आगरआहार10 में dsRNA को infusing द्वारा दिखाया गया था । इससे पहले रिपोर्टों को संक्षेप में प्राकृतिक आहार में संचार dsRNA देने के लिए arthropods३४के लिए विशिष्ट है । इन वितरण विधियों को आगे की डिलीवरी के कृत्रिम साधन के लिए तुलना में प्रभावी होना निर्धारित किया गया; जैसे tsetse मक्खी के मामले (Glossina morsitans morsitans), जहां एक प्रतिरक्षा से संबंधित जीन के बराबर पछाड़ना मनाया जब dsRNA या तो रक्त भोजन या microinjected३५के माध्यम से दिया गया था । इसी प्रकार, हल्के भूरे रंग के सेब मोठ (Epiphyas postvittana)३६, diamondback मोठ (Plutella xylostella) लार्वा३७में बूंदों के माध्यम से dsRNA का वितरण, साथ ही शहद मधुमक्खियों का३८,३९ प्रेरित कुशल RNAi । hemipteran में सबसे प्रभावी RNAi प्रयोगों dsRNA४० के इंजेक्शन का उपयोग किया है क्योंकि hemipteran कीड़ों में dsRNA के मौखिक प्रसव के बाद से यह मेजबान संयंत्र के संवहनी ऊतकों के माध्यम से दिया जाना चाहिए दुरूह है । प्रभावी RNAi भी एसीपी और ग्लास्ड निशानची लीफ़हॉपर (GWSS), Homalodisca vitripennisमें मनाया गया था: dsRNA खट्टे और दाखलताओं कि जड़ सराबोर, dsRNA के माध्यम से संवहनी ऊतकों में पत्तियों अवशोषित था के माध्यम से दिया गया था काटने के द्वारा स्प्रे, ट्रंक इंजेक्शन, या अवशोषण४१,४२,४३,४४,४५,४६। यह भी एसीपी (२०१६, यूएस २०१७०२११०८२ A1) के खिलाफ dsRNA के लिए पहले पेटेंट के परिणामस्वरूप । सिरना और dsRNA के वितरण जैसे नैनोकणों और liposomes प्रदान स्थिरता के रूप में वाहक का उपयोग कर, और बढ़ा dsRNA प्रभावकारिता में वृद्धि तेजी से उभरते हैं23,४७,४८,४९ ,५०. nanoparticle के एक नए वर्ग के लिए इन विट्रो में न्यूक्लिक एसिड के लिए और vivo है कि विशेष रूप से चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए संक्षेप में उपयुक्त वितरण वैक्टर५१के रूप में अपार क्षमता प्रदान कर सकते है के लिए वितरण वाहनों पर आधारित है । dsRNA के लिए एक प्रसव के वाहन के रूप में नैनोकणों घुलनशीलता, hydrophobicity, या सीमित५२संचय सहित नुकसान हो सकता है, लेकिन एक उपयुक्त बहुलक सहायता वितरण इन नुकसान भरपाई कर सकते हैं । स्व-आफ्ना न्यूक्लियोटाइड का विकास और उपयोग भी ' antisense oligonucleotides ' नामक उभरते हैं, जो एकल कतरा आरएनए/डीएनए डुप्लेक्स४६हैं ।

arthropods में Vitellogenesis प्रजनन को नियंत्रित करने और किशोर हार्मोन (जैक् सन) या ecdysone द्वारा विनियमित एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है, जो शरीर में वसा द्वारा वी. आर. के संश्लेषण की प्रमुख उत्प्रेरणा हैं; वी. जी. वी. द्वारा अंततः विकासशील oocyte द्वारा ली गई है वीजी रिसेप्टर endocytosis५३मध्यस्थता के माध्यम से । वी. जी. polypeptides संश्लेषित extraovarially के एक समूह है, जो प्रमुख अंडे की जर्दी प्रोटीन के विकास के लिए आवश्यक है, vitellin५४,५५, और इसलिए, यह प्रजनन और उंर बढ़ने५६में महत्वपूर्ण है । वी. पी. वी.५७ सूत्रकृमि में सफलतापूर्वक मौन किया गया है के रूप में अच्छी तरह के रूप में हनी मधुमक्खी (Apis अफ्रिकन) में जहां RNAi की मध्यस्थता कमी वयस्कों और अंडे22में मनाया गया था । RNAi मध्यस्थता posttranscriptional वी पी के जीन मुंह बंद करने परीक्षण किया गया था क्योंकि यह सोचा था कि इसकी कमी कम प्रजनन और fecundity के रूप में एक चौकस phenotypic प्रभाव को बढ़ावा मिलेगा, संभावित BMSB नियंत्रण में सहायता के लिए । JHAMT जीन है कि encodes एस-एडेनोसिल-एल-methionine (सैम)-निर्भर जैक् स एसिड O-methyltransferase, catalyzes के अंतिम चरण में जैक् प संश्लेषण मार्ग५८। इस मार्ग में farnesyl pyrophosphate (FPP) क्रमिक रूप से farnesol से बदल जाता है, farnesoic द्वारा जैक् farnesoate के रूपांतरण के बाद एसिड के लिए JHAMT द्वारा । इस मार्ग के कीड़ों और arthropods में विशेष रूप से कायापलट, एक प्रक्रिया है कि विकास के हार्मोन५९,६०,६१द्वारा विनियमित है के लिए संरक्षित है । बी. मोरीमें, JHAMT जीन अभिव्यक्ति और कॉर्पोरा allata में जैक् स की कृत्रिम गतिविधि का सुझाव है कि JHAMT जीन का transcriptional दमन जैक् स के संश्लेषण५८की समाप्ति के लिए महत् वपूर्ण है । इसलिए, JHAMT और वीजी जीन लक्षित RNAi का उपयोग कर कमी के लिए चुना गया । RNAi भी एसीपी और GWSS के नियंत्रण के लिए खट्टे पेड़ों में परीक्षण किया गया था । खट्टे पेड़ों जड़ सराबोर के माध्यम से dsRNA के साथ इलाज किया गया, स्टेम नल (ट्रंक इंजेक्शन), साथ ही कीट विशिष्ट arginine कळेनासे के खिलाफ dsRNAs के साथ पत्तियों स्प्रे (एके) टेप४२,४४। dsRNA के सामयिक आवेदन सभी खट्टे पेड़ों के चंदवा पर पता चला था, पौधों संवहनी ऊतकों के माध्यम से कुशल वितरण का संकेत है, और एसीपी और GWSS में वृद्धि हुई मृत्यु के परिणामस्वरूप४१,४२, ४५.

वर्तमान अध्ययन में, हम ऐसे dsRNA के रूप में उपचार के लिए एक प्राकृतिक आहार वितरण विधि की पहचान की है । इस नए विकसित तकनीक बाद में BMSB अप्सराओं में जीन विशिष्ट dsRNAs का उपयोग कर के रूप में पहले६२का प्रदर्शन JHAMT और वी पी mRNA मुंह बंद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इन नए वितरण प्रोटोकॉल का प्रदर्शन यहां पारंपरिक आरएनए वितरण प्रणालियों कि सामयिक स्प्रे या microinjections का उपयोग वृथा । सब्जियों और फलों, स्टेम नल, मिट्टी हीनों, और में मिट्टी शोषक dsRNA, जो जैव कीटनाशक कीट और रोगज़नक़ प्रबंधन के निरंतर विकास के लिए महत्वपूर्ण है की डिलीवरी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

१. BMSB पाहिजे

  1. मानक प्रयोगशाला अभ्यास के अनुसार रियर BMSB कीड़े और पहले से वर्णित६३।
  2. एक glasshouse (22 डिग्री सेल्सियस) और प्राकृतिक प्रकाश में खट्टे macrophylla पर एसीपी (डी. सिट्री) कीड़े उठाएं । वयस्क एसीपी का प्रयोग करें, लगभग 5-7 दिनों के बाद eclosion ।

2. जीन क्षेत्रों का चयन और इन विट्रो dsRNA के संश्लेषण में

  1. पहले से प्रकाशित transcriptome प्रोफाइल३२से BMSB के लिए विशिष्ट जीन चुनें ।
  2. सुनिश्चित करें कि चयनित ब्याज के क्षेत्र २०० से ५०० आधार जोड़े के बीच भिंन हैं ।
  3. जीनोमिक डीएनए से ब्याज की चयनित जीन के साथ जुड़े टुकड़े उत्पन्न करने के लिए नीचे वर्णित शर्तों का उपयोग पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का प्रदर्शन. जीन-विशिष्ट oligonucleotides के लिए तालिका 1 देखें ।
    1. पीसीआर रिएक्शन: ०.२५ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में, 10x पीसीआर बफर के 5 µ एल गठबंधन, dNTP मिश्रण के 4 µ l (२.५ मिमी प्रत्येक), dna टें पलेट के 2 µ l (५० एनजी/µ l), २.५ µ l प्रत्येक की प्राइमरी 1 और 2 (10 µ m), ०.२५ µ l की डीएनए पोलीमरेज़ (5 U/µ l) , और DNase/RNase मुक्त जल को ५० µ l तक
    2. पीसीआर कंडीशन: ९५ डिग्री सेल्सियस पर ब्याज के क्षेत्र को बढ़ाना करने के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया चक्र 10 एस के लिए ९८ ° c के 30 चक्र के बाद 3 मिनट के लिए, ५५ ° c 30 s के लिए, 72 ° c के लिए 1 min. एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए ७२ ° c पर प्रतिक्रिया की मशीन । पीसीआर रिएक्शन को शुद्ध करें शुद्धि किट ।
  4. प्राप्त पीसीआर टुकड़े आगे बढ़ाना जीन विशिष्ट प्राइमरों के साथ T7 आरएनए पोलीमरेज़ प्रमोटर अनुक्रम (5 '-गाा TTA ata CGA सीटीसी एक्ट ata GGG आगा-3 ') के रूप में पहले६२उल्लेख के साथ पार्श्व ।
  5. RNAi के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण (नकली) के रूप में LacZ जीन का प्रयोग करें ।
    नोट: LacZ एक जीन है कि encodes β-galactosidase Escherichiacoli जीनोमिक डीएनए से प्रवर्धित (प्राइमरों का इस्तेमाल किया 1 तालिकामें सूचीबद्ध हैं) ।
  6. इन विट्रो में प्रतिलेखन dsRNA उपज के रूप में पहले६२वर्णित करने के लिए ।
  7. भंग और १५० µ एल DNase में परिणामी dsRNA reसस्पेंड/RNase मुक्त पानी, एकाग्रता को मापने, और भविष्य के उपयोग के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर दुकान.

3. हरी बीन्स का उपयोग करके dsRNA का वितरण

  1. प्रारंभिक 4गु instar BMSB अप्सराएं एक ही अंडा मास से रची गई और उंहें dsRNA खिलाने से पहले 24 घंटे के लिए भूखे रहने का चयन करें ।
  2. चुनें पतला प्रमाणित कार्बनिक हरी बीन्स (Phaseolus L.) और 5 मिनट के लिए ०.२% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान के साथ धो लें ।
    नोट: पतला हरी सेम का चयन किया गया ताकि सेम आसानी से 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में शामिल किया जा सकता है ।
  3. ddH2O के साथ 3 बार धोएं और हवा को सूखने दें ।
  4. calyx अंत से ७.५ सेमी की एक कुल लंबाई के लिए हरी सेम ट्रिम एक साफ उस्तरा ब्लेड का उपयोग ।
  5. एक टोपी में धोया और छंटनी हरी सेम-कम 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब नियंत्रण समाधान के ३०० µ एल युक्त (एक 1:10 ग्रीन खाद्य रंग के कमजोर पड़ने (सामग्री: जल, Propylene ग्लाइकोल, एफडी और सी पीला 5, एफडी और सी ब्लू 1, और Propylparaben के रूप में परिरक्षक)).
  6. के कमजोर पड़ने बनाने के इन विट्रो संश्लेषित LacZ, JHAMT, या वी. पी. dsRNAs द्वारा कमजोर 5 µ जी या 20 µ जी में ३०० µ एल के RNase/DNase मुफ्त पानी की अंतिम सांद्रता उपज के लिए ०.०१७ µ g/µ l या ०.०६७ µ g/µ l, क्रमशः ।
  7. एक टोपी कम 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में धोया और छंटनी की हरी बीन्स विसर्जित dsRNA समाधान के ३०० µ l युक्त (३.६ कदम से) ।
  8. लपेट और microcentrifuge ट्यूबों के किनारों को सील डूबे सेम dsRNA समाधान के वाष्पीकरण से बचने के लिए और microcentrifuge ट्यूब में प्रवेश करने से जानवरों को रोकने के लिए ।
  9. 3 ज के लिए कमरे के तापमान पर एक ईमानदार तरीके से इन ट्यूबों की स्थिति dsRNA समाधान की अनुमति के लिए केशिका कार्रवाई से हरी बीन भर में लोड किया जा करने के लिए ।
  10. साफ संस्कृति वाहिकाओं (के) में इन ट्यूबों प्लेस । स्थान तीन भूखे 4गु instar BMSB अप्सराओं में संस्कृति वाहिकाओं ।
  11. संस्कृति पोत प्रत्येक हरी खाद्य रंग या dsRNA समाधान के साथ तीन हरी सेम युक्त प्रति तीन पशुओं का इलाज । 25 डिग्री सेल्सियस और ७२% सापेक्ष आर्द्रता पर कीड़ों को बनाए रखने, एक 16L के तहत: 8D photoperiod एक मशीन में ।
  12. कीड़े हरी सेम पर फ़ीड करने के लिए अनुमति दें (डूबे और dsRNA के साथ अवशोषित) 5 दिनों के लिए लेकिन dsRNA उपचार हरी मोतियों की ताजा आहार के साथ भरपाई 3 दिनों के बाद.

4. वास्तविक समय मात्रात्मक (qPCR) जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण निम्न RNAi मध्यस्थता मुंह बंद करने में BMSB

  1. qPCR द्वारा प्रतिलिपि अभिव्यक्ति के स्तर पर RNAi के प्रभाव को मापने ।
  2. dsRNA इलाज जानवरों से कुल आरएनए को अलग और सीडीएनए६२संश्लेषित ।
  3. सेटअप एक वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली और तालिका 1में सूचीबद्ध प्राइमरों का उपयोग qPCR प्रतिक्रियाओं । निंनलिखित qPCR सायक्लिंग शर्त का प्रयोग करें: ९५ ° c 10 के लिए ९५ ° c के ४० चक्र के बाद मिनट के लिए 15 एस, ६० ° c 1 मिनट के लिए, सहित पृथक्करण कदम के लिए ९५ ° c के लिए 15 s, ६० ° c 1 मिनट के लिए, ९५ ° c 15 s के लिए , और 15 एस के लिए ६० ° c
  4. qPCR मानकों का निर्धारण: ठहराव के लिए एक संदर्भ मानक के रूप में एक सामान्य जानवर से अलग कुल आरएनए से तैयार सीडीएनए के धारावाहिक कमजोर पड़ने का उपयोग करें.
  5. ३२ऊतकों से आरएनए वसूली में अंतर के लिए सही करने के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में BMSB 18s आरएनए का उपयोग करें ।

5. बड़े कमरों में खट्टे पेड़ों और अंकुरों में पत्तियों स्प्रे आवेदन

नोट: खट्टे फसल 'Carrizo' citrange (खट्टे sinensis XPoncirus trifoliata, रूटेसी) के पौधे, एक glasshouse में प्राकृतिक प्रकाश और तापमान के तहत बनाए रखा, १.२ एल कंटेनरों में उगाया गया । पौधों लगातार नए पत्तियों शूटिंग के विकास को बढ़ावा देने के लिए, ' फ्लश ' कहा जाता था । एसीपी को खिलाना पसंद है और खट्टे६४के नए विकास पर oviposition ।

  1. पौधों या अंकुर का चयन करें और उंहें 2-3 दिन के लिए पानी नहीं करने से पहले मिट्टी को नम लेकिन पूरी तरह से शुष्क नहीं सूखी उपयोग करते हैं ।
  2. एक हाथ पंप स्प्रे बोतल का उपयोग dsRNA समाधान (०.५ mg/एमएल) के निचले चंदवा (चित्रा 4a) के लिए २०० मिलीलीटर लागू होते हैं ।
    नोट: DNase/RNase मुफ्त पानी में उपर्युक्त dsRNA समाधान तैयार करें ।
  3. पोस्ट-स्प्रे आवेदन, लागू dsRNA समाधान पूरी तरह से पत्तियों द्वारा अवशोषित करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: खट्टे पेड़ लागू dsRNA अवशोषित, और फिर या तो नए विकास या शाखाओं कि आवेदन करने से पहले कवर किया गया था से पत्ते, निकाले गए; dsRNA qPCR का उपयोग कर detectable था और पेड़ के ऊपर चंदवा में प्रणालीगत आंदोलन दिखाया 3-4 एच में४४,४५,४६।
  4. चार शाखाओं के सुझावों से लगभग 10 पत्तियों को एकत्रित करके 25-40 दिनों के बाद पहले से अव्वल पेड़ों से नए विकास का नमूना लें । कुल आरएनए निकालें और लागू dsRNA तालिका 1 में सूचीबद्ध प्राइमरों का उपयोग कर ट्रिगर की उपस्थिति के लिए रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर (आरटी-पीसीआर) और qPCR द्वारा इसका विश्लेषण और पहले वर्णित विधियों४६।
    नोट: नमूना संग्रह, कुल आरएनए अलगाव, आर टी-पीसीआर, और qPCR पहले वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया गया४६।
  5. इसी तरह, एक अंकुर या छोटे कमरों का पेड़ पत्ते के निचले क्षेत्र में सामयिक छिड़काव 10 मिलीलीटर dsRNA ।
    नोट: Hemipteran कीड़े (एसीपी और GWSS) 24 एच, नई वृद्धि पर पोस्ट उपचार (पत्तियों) जो सीधे छिड़काव नहीं किया गया था, या जो सप्ताह बाद, या पूरे संयंत्रों में आम तौर पर पहुंच खिला दिया गया । यह उत्पादित कीड़े जो 3, 6 पर dsRNA के लिए सकारात्मक परीक्षण किया है, और 10 दिन, पोस्ट खिला ।

6. मिट्टी/बड़े या छोटे कमरों का खट्टे पेड़ और अंकुर में सराबोर आवेदन

  1. पौधों या अंकुर का चयन करें और उंहें 2-3 दिन के लिए पानी नहीं करने के लिए मिट्टी बाहर नम लेकिन पूरी तरह से शुष्क नहीं करने का उपयोग करें (यह हवा के लिए तरल समाधान पकड़ बनाने के लिए लागू किया जा स्थान बनाता है) ।
  2. dsRNA समाधान (०.२ मिलीग्राम/एमएल) के 1 एल जोड़ें बड़े कमरों का पौधों की मिट्टी (लगभग २.५ मीटर) और 1 ज के बाद पानी की 1 l (चास) जोड़ें ।
  3. आंशिक रूप से सूखी मिट्टी में 1 मीटर लंबा कमरों का पेड़ की मिट्टी के लिए १०० मिलीलीटर dsRNA समाधान (१.३३ मिलीग्राम/एमएल) लागू करें ।
  4. छोटे अंकुर के लिए, शंकु में मिट्टी या नंगे जड़ों (चित्रा 4B, सी) के लिए 10 मिलीलीटर dsRNA समाधान (1 मिलीग्राम/
  5. अनुमति पौधों है कि dsRNA समाधान प्राप्त एक मिट्टी के रूप में लागू करने के लिए भिगोना सराबोर 30 मिनट । तो जड़ों से अवशोषण सहायता करने के लिए सादे पानी ही उपचार लागू करें (पीले कंटेनरों में पौधों के लिए 20 मिलीलीटर, या १०० मिलीलीटर अगर बड़ा संयंत्र बर्तन हैं > 1 गैलन).
    नोट: सामयिक रूप से पत्ते को लागू dsRNA 3-6 एच पद उपचार के भीतर शाखाओं के सबसे बाहर युक्तियों पर पता लगाने के परिणामस्वरूप, पेड़ों के माध्यम से प्रणालीगत आंदोलन दिखा । नई विकास शाखाओं 60-90 दिनों के बाद उपचार पर dsRNA के लिए सकारात्मक परीक्षण किया । काटने एक dsRNA खिला परख४४में कीड़ों (एसीपी और GWSS) के लिए प्रदान की जाती हैं ।

7. स्टेम नल (पेड़ ट्रंक इंजेक्शन) आवेदन बड़े कमरों में खट्टे पेड़ और अंकुर

  1. का चयन करें खट्टे अंकुरों, नए, या लगभग ३.५ साल पुराने पौधों dsRNA इंजेक्शन के लिए स्टेम नल (ट्रंक इंजेक्शन) विधि का उपयोग कर ।
  2. खट्टे पौधों में ड्रिल छेद एक ड्रिल और एक 10 मिमी ड्रिल बिट का उपयोग कर, ध्यान में रखते हुए 2 सेमी से अधिक नहीं है, या के बारे में आधा स्टेम व्यास ।
  3. टिप के पास रिसाव को रोकने के लिए फिल्म सील की एक ०.६ सेमी (¼ इंच) चौड़ी पट्टी के साथ एक इंजेक्टर 4-6 बार के तांबे टिप लपेटें ।
  4. DNase/RNase मुक्त पानी में पतला dsRNA समाधान के 6 मिलीलीटर (१.७ मिलीग्राम/एमएल) के साथ पेड़ ट्रंक इंजेक्टर भरें (रंगीन समाधान के रूप में यहां चिह्नित) ।
  5. पेड़ के ट्रंक में समाधान सुई और 6-10 एच के लिए ट्रंक में इंजेक्टर छोड़ने के लिए dsRNA समाधान के अवशोषण की अनुमति है । कीड़े के इलाज के पेड़ से काटने पर 3, 10, और 30 दिनों के बाद उपचार फ़ीड करने के लिए अनुमति दें ।
    नोट: dsRNA ट्रंक इंजेक्शन विधि का उपयोग कर इंजेक्शन 30-60 दिन४१,४२,४४की अवधि के लिए पेड़ों में बनी । RNAi के लिए मांयता qPCR द्वारा प्रदर्शन किया गया प्राइमरों तालिका 1में सूचीबद्ध का उपयोग कर ।

8. dsRNA मिट्टी के माध्यम से कीड़ों को प्रसव के लिए इलाज क्ले granules

  1. एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब में बाहर मिट्टी शोषक डालो करने के लिए ३५ मिलीलीटर चिह्न (लगभग 30 ग्राम मिट्टी शोषक के) ट्यूब पर ।
  2. सभी शोषक गीला करने के लिए ट्यूब में DNase/RNase मुफ्त पानी (१०० µ g/एमएल) में पतला dsRNA समाधान के 20 मिलीलीटर डालो । शंकु ट्यूब कैप, टिप हवा को दूर करने में मदद करने के लिए ट्यूब, और टोपी ट्यूब ।
  3. ट्यूब ईमानदार प्लेस और यह मिट्टी के लिए समाधान अवशोषित कणों के लिए 1-2 मिनट के लिए खड़े हो जाओ ।
  4. मिट्टी के मिश्रण में पर्याप्त dsRNA-लथपथ मिट्टी जोड़ें एक 1 गैलन पॉट को भरने के लिए ।
  5. मिट्टी में dsRNA-भीगे मिट्टी को अच्छी तरह मिलाने के लिए हाथ से मिट्टी को मिलाएं और मोड़ें ।
  6. dsRNA उपचार के लिए चयनित रिपोट अंकुरों के लिए इस मिट्टी का प्रयोग करें ।
  7. dsRNA बिना सादा पानी के २०० मिलीलीटर के साथ मिट्टी का पानी । 1 घंटे के लिए 30 मिनट के बाद, सादे पानी की १०० मिलीलीटर के साथ पालन करें । 24 घंटे के बाद, एक सामांय पानी अनुसूची पर संयंत्र रखो ।
  8. परीक्षण 4-6 मिट्टी शोषक और dsRNA प्रत्येक महीने dsRNA के लिए नए संयंत्र के विकास के सबसे शिखर पत्तियों को इकट्ठा करने के बाद उपचार के साथ पॉटी पौधों का इलाज किया ।
    नोट: इन इलाज संयंत्रों से पौधों या काटने 24 घंटे के बाद उपचार के बाद किसी भी समय कीड़ों को खिलाया जाता है और कीड़े (अप्रकाशित डेटा) के लिए एक साल तक के लिए प्रसव RNAi करने में सक्षम है ।

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Representative Results

BMSB में खिला के माध्यम से वनस्पति मध्यस्थता dsRNA प्रसव 4th instar अप्सराओं आक्रामक कीट कीट के लिए RNAi का उपयोग कर आणविक जैव कीटनाशकों के विकास के लिए परीक्षण किया गया था । BMSBs एक रुखा और फ्लश, जो फसलों को काफी नुकसान का कारण बनता है के रूप में जाना जाता तंत्र द्वारा अपने सुई की तरह stylets का उपयोग कर फ़ीड । पतला कार्बनिक हरी बीन्स, पी एल, vivo में 3खिलाने के माध्यम से BMSB करने के लिए पोषक तत्वों या dsRNA वितरित किया जा सकता है अगर परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया । हरी बीन्स के सेगमेंट में DNase/RNase फ्री वॉटर या BMSB (चित्र 1a) में डिलीवरी का परीक्षण करने के लिए पानी और हरे रंग के खाने का एक घोल डूब गया था. ग्रीन खाद्य रंग dsRNA नकल करने के लिए एक दृश्य संकेत के रूप में इस्तेमाल किया गया था । हरी सेम के संवहनी ऊतक फ्लोएम के माध्यम से हरी रंग का समाधान के प्रवाह के कारण रंग भरने वाली हरी खाद्य के साथ संतृप्त किया गया केशिका कार्रवाई६२। हरी बीन्स के संवहनी ऊतकों में अपने stylets को डालने के द्वारा BMSB अप्सराओं को हरी बीन्स के खंडों पर खिलाते देखा गया (चित्र 1b) । हरे रंग की मलमूत्र बूंदों 2 और कीड़ों है कि सेम पर खिलाया गया था कि हरी खाद्य वितरित सामग्री का संकेत रंग के साथ संतृप्त किया गया था के बाद मनाया गया और उत्सर्जन से पहले आंत के माध्यम से पारित (चित्रा 1C, डी ).

बाद में हम परीक्षण अगर लक्षित जीन अभिव्यक्ति की महत्वपूर्ण कमी BMSB में घूस के माध्यम से BMSB विशिष्ट dsRNA की हरी बीन मध्यस्थता वितरण का उपयोग कर पूरा किया गया था. हरी बीन खंडों डूब गया और या तो ०.०६७ µ g/µ एल (20 µ जी में ३०० µ एल के DNase/RNase मुफ्त पानी) या ०.०१७ का एक समाधान अवशोषित µ g/µ l (5 µ g म ३०० µ l के DNase/RNase इव पानी) के इन विट्रो संश्लेषित dsRNA BMSB और वी. के. क्रमशः. हरी बीन्स भी अकेले पानी में डूब गए थे, ०.०६७ µ g/µ l या ०.०१७ µ g/µ l LacZ dsRNA (मॉक) संबंधित नियंत्रणों के रूप में । प्रतिलिपि स्तर का संकेत है कि JHAMT और वी. पी. mRNA की अभिव्यक्ति काफी vivo में लगभग ४.५-और २.२ गुना, क्रमशः (चित्रा 2a, बी) द्वारा कम था qPCR का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया । नतीजतन, परिणाम संकेत मिलता है कि dsRNA हरी सेम के संवहनी ऊतकों के माध्यम से दिया जा सकता है सफल RNAi प्रेरित ।

एक अंय hemipteran कीट, रिक्त (एचबी) (Murgantia histrionica), कि कोल फसलों को नुकसान का कारण बनता है भी परीक्षण किया गया अगर पोषक तत्वों या dsRNA उपचार के सफल वितरण सब्जी मध्यस्थता वितरण का उपयोग कर दिया जा सकता है । 4गु instar एचबी अप्सराओं को शिशु कॉलर्ड साग (Brassica oleracea varपर फीड करने की अनुमति दी गई । viridis) या तो पानी में डूबे या हरे रंग के भोजन के साथ पानी का समाधान । परिणाम ने संकेत दिया कि एचबी फेड और ग्रीन खाद्य रंग है, जो उनके हरे रंग मलमूत्र से स्पष्ट किया गया था, के रूप में एचबी की तुलना में है कि पानी में डूबे सब्जियों, जो स्पष्ट मलमूत्र था (चित्रा 3) ।

पौधे के ऊतकों के सभी६५,६६में dsRNA dsRNA में छिड़काव या जड़ मिट्टी भिगोने के परिणाम के क्षणिक प्रसव के लिए अतिरिक्त तकनीक । छिड़काव RNAi आधारित उत्पादों के विकास में है और जल्द ही लंबित स्वीकृति उपलब्ध हो सकती है । खेतों में dsRNA का वितरण स्प्रे या जड़ सराबोर प्रयोग इनवेसिव कीड़े४२,६७के प्रबंधन में सहायता कर सकते हैं । पूर्ण आकार खट्टे पेड़ और अंकुर या तो पत्तियों स्प्रे, या मिट्टी या नंगे रूट हीनों द्वारा dsRNA को उजागर किया गया, क्रमशः (चित्रा 4) । परिणाम संकेत दिया है कि dsRNAs या तो स्प्रे या मिट्टी/नंगे जड़ से सराबोर खट्टे पौधों में पता लगाया जा सकता है (२.५ मीटर लंबा) 7 सप्ताह के लिए dsRNA४२के 2 जी के एक एकल जोखिम पोस्ट. psyllid dsRNA के वितरण और घूस-एके (20 एनजी/µ एल) 30-45% (चित्रा 4d)४२द्वारा psyllid मृत्यु दर में वृद्धि हुई ।

इन विट्रो में लिखित dsRNA कुशलता से polyphagous कीड़ों के लिए दिया जा सकता है स्टेम नल (ट्रंक इंजेक्शन) जीन विशिष्ट dsRNA के संवहनी ऊतकों में सीधे संयंत्र, जो कीड़ों जब ऐसे पौधों पर शिकार द्वारा प्राप्त किया जा सकता है४४ (चित्रा 5). खट्टे पेड़ों कि ट्रंक इंजेक्शन द्वारा dsRNA को उजागर किया गया के लिए, dsRNA वृद्ध खट्टे पौधों में पाया जा सकता है (लगभग 1 मीटर लंबा) के लिए 7 सप्ताह के बाद एक एकल प्रदर्शन के 6 मिलीलीटर का उपयोग कर dsRNA के १.७ मिलीग्राम/एमएल के समाधान में DNase/RNase मुफ्त पानी (चित्रा 5 ए , ख). फ्लोएम-खिला hemipteran कीड़ों तो dsRNA के साथ इलाज इन मेजबान पौधों पर फ़ीड की अनुमति दी गई । यह माना जाता है कि dsRNA सफलतापूर्वक संचार किया गया था और एसीपी द्वारा घूस के लिए खट्टे पौधों की संवहनी प्रणाली के माध्यम से ले जाया गया, जो dsRNA पर खिलाया जब मृत्यु दर-एके४२।

२००८ से २०१२ के लिए विकसित की परख, कमरों का पौधों की एक विस्तृत विविधता भर में जांच की गई है और एक तरह से जो पौधों को अवशोषित और प्रणालीगत dsRNA प्रसार के लिए dsRNA translocate कर सकते है में dsRNA वितरण प्रदान दिखाया४१,४२ . एक विधि मिट्टी मैट्रिक्स में dsRNA सोखना के साथ एक मिट्टी शोषक घटक का उपयोग करता है; इस clays की एक विस्तृत विविधता शामिल है, फुलर पृथ्वी, जिओलाइट, और दूसरों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंय शोषक सामग्री, फाइबर, agars, प्लास्टिक, आदि क्ले कणों धूल मुक्त न्यूक्लिक एसिड वाहक है कि सक्रिय सामग्री देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इस तरह के रूप में dsRNA संयंत्र के लिए मिट्टी के लिए और अंत में कीड़ों (चित्रा 6) के लिए प्रसव । मिट्टी परिसर में भी रासायनिक विशिष्ट पीएच या ईओण शर्तों के तहत dsRNA जारी विंयस्त किया जा सकता है । मिट्टी के पौधों में dsRNA के वितरण तरीकों के लिए कमरों में खट्टे पेड़ों में dsRNA प्रदान दिखाया गया है, और 14 से अधिक महीनों के लिए अंय पौधों (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इस वितरण प्रणाली इस तरह के फूल रंग, पौधे की ऊंचाई (बौना), या दूसरों के रूप में संयंत्र लक्षण, बदलने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वर्तमान में, इस विधि का प्राथमिक उपयोग एक प्रभावी कीट कीट और रोगज़नक़ (वायरस) नियंत्रण या प्रबंधन के विकास के लिए है । दृष्टिकोण नर्सरियों और homeowners के लिए लागत प्रभावी हो सकता है, और एक गैर ट्रांसजेनिक विधि है ।

Figure 1
चित्र 1 . हरी बीन्स के माध्यम से पोषक तत्वों या dsRNA का वितरण । (a) पतला कार्बनिक हरी सेम के खंडों डूब गए और एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में समाधान अवशोषित कर रहे थे या तो ddH2हे अकेले या ddH2के साथ हरे रंग का खाना, 3 एच के लिए µ एल । तीन 4गु instar BMSB अप्सराएं 24 ज के लिए भूखे थे और पोत के प्रति 3 हरी बीन्स के साथ साथ संस्कृति वाहिकाओं में रखा गया था । (ख) हरी बीन्स के खंडों पर BMSB फीड को अपने stylets के साथ पोषक तत्वों तक पहुँचाने के लिए हरी फलियों के माध्यम से भेदी द्वारा पानी में डुबोया जाता है. (ग) BMSB खिला परख के दिन 2, तीर मलमूत्र निरूपित । (D) दिन 3; वृद्धि हुई BMSB मलमूत्र (तीर द्वारा चिह्नित) हरी सेम के माध्यम से ddH2O और हरी खाद्य रंग का एक समाधान के पद घूस मनाया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . मात्रात्मक आरटी-पीसीआर विश्लेषण RNAi के बाद प्रतिलिपि के स्तर को मापने के लिए JHAMT और BMSB में वी पी की मध्यस्थता घट । कुल आरएनए ३ तास BMSB ४th instar अप्सरा फेड ऑन JHAMT (A) 20 µ g (०.०६७ µ g/µ l), और वी . पी (बी) 5 µ जी (०.०१७ µ g/µ l) dsRNAs में ३०० µ एल के ddH2ओ हरी बीन्स के खंडों के माध्यम से वितरित, अलग था और प्रतिलिपि स्तर qPCR द्वारा मापा गया । LacZ dsRNA (मॉक) ने नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया । BMSB 18s आरएनए ऊतकों से आरएनए वसूली में अंतर के लिए सही करने के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया था । रिपोर्ट परिणाम तीन जैविक प्रतिकृति से कर रहे हैं, और त्रुटि सलाखों SEM संकेत मिलता है । डेटा के सांख्यिकीय महत्व, p < ०.०००१ के लिए परीक्षण करने के लिए प्रसरण (ANOVA) का एक-तरफा विश्लेषण किया गया था । परिणाम घोष एट अल से reproduced । ६२ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . रिक्त (एम. आई. सी. में उपचार की मौखिक डिलीवरी । histrionica ) बेबी कॉलर साग का उपयोग करना । कार्बनिक बेबी कॉलर साग ०.२% सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ धोया गया, छंटनी की, और एक 2 मिलीलीटर टोपी कम microcentrifuge ट्यूब युक्त ३०० µ के समाधान के एल में डूबे (a) DNase/RNase free ddH2ओ, या (B) DNase/RNase इव ddH2 3 एच की अवधि के लिए ग्रीन खाद्य रंग के साथ ओ समाधान, । तीन 4 instar एचबी देवियां 24 घंटे के लिए भूखे थे और फिर संस्कृति वाहिकाओं में रखा और 3 दिनों के लिए इन कॉलर साग पर फ़ीड की अनुमति दी । सफेद तीर मलमूत्र 3 दिन खिला के बाद मनाया संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . पत्तियों स्प्रे और खट्टे पेड़ और अंकुर में जड़ सराबोर आवेदन । चयनित पौधों या अंकुरों का उपयोग करने से पहले 2-3 दिन के लिए पानी नहीं है करने के लिए मिट्टी बाहर नम लेकिन पूरी तरह से सूख जाने । (क) पेड़ पहले सबसे ऊपर थे और २०० मिलीलीटर dsRNA समाधान (०.५ mg/DNase/RNase में नि: शुल्क पानी हाथ पंप स्प्रे बोतल से निचले चंदवा के लिए लागू किया गया था । (B) १०० मिलीलीटर की dsRNA (1 mg/एमएल) DNase/RNase में आंशिक रूप से सूखी मिट्टी में अंकुरित मिट्टी के लिए मुफ्त पानी लागू किया गया । (ग) १०० मिलीलीटर की dsRNA (1 mg/एमएल) DNase/RNase में लगभग 3 ज के लिए अंकुरों के नंगे जड़ों के लिए मुफ्त पानी लागू किया गया था । (घ) dsRNA कि नंगे जड़ों से अवशोषित किया था अंकुर पर खिला, एसीपी मृत्यु दर में वृद्धि दिखाई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . खट्टे अंकुर पेड़ ट्रंक इंजेक्शन । खट्टे अंकुरों लगभग 1 मीटर लंबा dsRNA के १.७ मिलीग्राम/एमएल के साथ इंजेक्शन थे । (क) खट्टे अंकुर में ड्रिल छेद एक 10 मिमी व्यास ड्रिल बिट का उपयोग करने के लिए संयंत्र के स्टेम में इंजेक्टर डालें । प्रत्येक इंजेक्टर के उजागर तांबे टिप एक ०.६ सेमी (¼ इंच) के रिसाव को रोकने के लिए फिल्म सील की व्यापक पट्टी के साथ लपेटा गया था । (ख) रंग समाधान के 6 मिलीलीटर से भरा इंजेक्टर अंकुरों के स्टेम (ट्रंक) पर लागू किया गया । इंजेक्टर समाधान के पूरा करने के लिए लगभग 6-10 एच के लिए जगह में छोड़ दिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 . मिट्टी मिट्टी के माध्यम से पौधों में dsRNA का मृदा संशोधन वितरण । सामग्री पहुंचाने की एक नई लाइन: क्ले है कि एक धूल मुक्त ऐसे पौधों में और अंततः कीड़ों में के लिए मिट्टी को dsRNA के रूप में सक्रिय सामग्री देने में उपयोग के लिए न्यूक्लिक एसिड वाहक है । (क) अनसेंकना मिट्टी और (ख) पके हुए मिट्टीकाचित्रण जल सहिष्णुता/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

संभावित एच halys लक्ष्य जीन
विलय आकार जीन नाम समरूपता/
xp_ 014293026.1 ४९१ Vitellogenin-A1-लाइक Vg) (संभावित isoforms: vitellogenin-2-जैसे isoform X1 xp_ 014291483.1; vitellogenin-2-जैसे isoform X2 xp_ 014291484.1) ।
xp_ 014290953.1 ५४५ जुवेनाइल हार्मोन एसिड ओ-methyltransferase-लाइक (JHAMT) (संभव homolog: जुवेनाइल हार्मोन एसिड ओ-methyltransferase xp_ 014283772.1).
प्राइमरों
पीसीआर
जीन नाम समरूपता/ प्राइमरी का नाम अनुक्रम
Vg BMSB Vitellog P2 च CAATTTGATCCACCGACTGTT
Vg BMSB Vitellog P2 आर CCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB जैक् P1 F GGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB जैक् P1 आर GTATAGGATTGCCATTTTGG
T7 पीसीआर
Vg T7 BMSB Vitellog P2 ४२६३ च GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCAAAGTTGGAAGGGAATGA
Vg T7 BMSB Vitellog P2 ४७५३ आर GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB जैक् T7 P1 च GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB जैक् T7 P1 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATAGGATTGCCATTTTGG
LacZ T7 LacZ RNAi च GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGAAAGCTGGCTACAGGA
LacZ T7 LacZ RNAi R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGGCTTCTGCTTCAAT
एके dsAK-च TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
एके dsAK-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
एके dsAK ५०-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
एके dsAK ५०-R TAATACGACTCACTATAGGGAGTGAAGCCCTTGTGGTAGTC
एके dsAK ३०-एफ TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGGACTCTGGAGTAGG
एके dsAK 30-आर TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
GFP dsGFP-च TAATACGACTCACTATAGGGAGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTT
GFP dsGFP-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGTAATGGTTGTCTGGTAAAAGGA
qPCR
Vg भ Vitellog P2 च TTGATAGTTGTTTGGATTTTGAAGGT
Vg भ Vitellog P2 आर TCTTACTTGATCAGCGCTCAGAA
JHAMT BMSB जैक् भ P1 च AGGAAAACCCAAAATGGCAAT
JHAMT BMSB जैक् भ P1 R ATGTATTCTTCTTTTGGATCTTTTCTTGAG
18S BMSB 18S F3 ATGCCCCCGCCTGTCCTTATT
18S BMSB 18S R3 TGAAAGCAGCCTGAATAGTGG
GFP GFP-च GGTAAAAGGACAGGGCCATC
GFP GFP-R TCAAGGAGGACGGAAACATC
एके एके क्वांट-च CGGACTTGAGGGAGAACTGA
एके एके क्वांट-आर GTGGTAGATACCGCGACCAG
a-टब a-टब-F GCGTCTCTTCGGTTTGACGG
a-टब a-टब-R CACTTCACCATCTGGTTGGC

तालिका 1. RNAi के लिए Oligonucleotide जुगाड़ । सूचीबद्ध जीन और oligonucleotides पीसीआर टुकड़े पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया, dsRNA, और qPCR प्राइमरों प्रतिलिपि स्तर का विश्लेषण कर रहे हैं ।

अनुपूरक वीडियो 1: Agars और जैल के रूप में वितरण और dsRNA के निरंतर रिलीज के लिए शोषकों । हाइड्रेटेड सिंथेटिक या प्राकृतिक agars और dsRNA समाधान है कि विभिंन arthropods के लिए चारा या आहार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ जैल । इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

RNAi जीन जैविक समारोह और विनियमन की खोज के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित किया है, महान क्षमता के साथ कीट कीट के प्रबंधन के लिए उपयोग किया जा करने के लिए19,६८,६९,७०, ७१. एक दिया कीट प्रजातियों में मुंह बंद करने के लिए एक उपयुक्त जीन (ओं) के डिजाइन और चयन और इसी dsRNA (ओं) को कीट के वितरण की विधि अत्यंत महत्व के हैं । एक कीट में dsRNA देने के लिए इष्टतम विधि empirically निर्धारित किया जाना चाहिए, वितरण के लिए रिश्तेदार खुराक चयन के साथ, के रूप में कुछ तरीकों लाभ और अंय सीमाओं की पेशकश कर सकते हैं । एक आणविक जैव कीटनाशक कि अंततः पर्यावरण रिहाई, एक व्यवहार्य, कुशल और लाभप्रद वितरण पद्धति के लिए उपयुक्त हो सकता है के विकास के लिए आवश्यक है । उदाहरण के लिए, सामयिक लागू dsRNA खट्टे और दाखलताओं के लिए कीट नियंत्रण के लिए dsRNA वितरण के लिए प्रभावी होना दिखाया गया है४२,४४। ऐसे प्रलोभन के उपयोग के रूप में अभिनव रणनीतियों, सुक्रोज समाधान, खमीर या प्रत्यक्ष घूस के लिए बैक्टीरियल dsRNA उत्पादन, पौधों पर dsRNA के सामयिक आवेदन, या संशोधित ट्रांसजेनिक संयंत्रों द्वारा विशिष्ट dsRNAs के उत्पादन, के विकास को उंनत किया है प्रभावी RNAi-आधारित नियंत्रण19,७२।

dsRNA (चित्रा 1 और चित्रा 2) विशेष रूप से प्रभाव और वैश्विक महत्व के एक कीट कीट को कम करने के लिए बनाया गया है उद्धार करने के लिए हरी बीन्स के उपयोग के साथ एक अच्छा उदाहरण यहां का प्रदर्शन किया है । नव विकसित सब्जी मध्यस्थता dsRNA वितरण हरी सेम के खंडों का उपयोग कर प्रोटोकॉल डूबे और dsRNA के साथ संतृप्त प्रभावी ढंग से BMSB में लार्वा विकास के लिए विशिष्ट जीन को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हरी बीन्स कई सब्जियों कि BMSB द्वारा चुग रहे हैं और इसलिए इन dsRNA देने के लिए एक माध्यम के रूप में इस्तेमाल किया गया है में से एक हैं । dsRNA वितरण के अंय माध्यमों का परीक्षण किया गया (डेटा नहीं दिखाया गया है), लेकिन BMSB के लिए पोषण की आपूर्ति संभवतः संवहनी बनावट में मतभेद के कारण में असफल रहे थे । इसलिए, हम हरी सेम के खंडों का इस्तेमाल किया इन विट्रो BMSB अप्सराओं को संश्लेषित dsRNA में देने के लिए । न्यूक्लिक एक संयंत्र या सब्जी मध्यस्थता तकनीक के माध्यम से दिया एसिड संभावित रूप से पसंद के कीट में RNAi प्रेरित करने में सक्षम हो सकता है के रूप में यहां मनाया के रूप में JHAMT और वी . जी. BMSB में जीन (चित्रा 2)६२।

इस सब्जी मध्यस्थता dsRNA वितरण प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है न केवल BMSB में RNAi प्रेरित करने के लिए, लेकिन यह भी एचबी में कॉलर्ड साग का उपयोग (चित्रा 3), हालांकि वितरण रणनीतियों और तरीकों प्रत्येक जीन और कीट के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. इसलिए, यह अनुशंसित है कि विभिंन तरीकों के वितरण के लिए परीक्षण के रूप में अच्छी तरह के रूप में ब्याज के कई जीन व्यक्तिगत रूप से लक्षित या कम दो dsRNAs स्टैकिंग के क्रम में बेहतर phenotypic penetrance प्राप्त करने के लिए । 13,22, भिगोने७३,७४, microinjection७५, और अंय तकनीकों७६ के लिए इस्तेमाल किया सहित कीड़ों और कीट कोशिकाओं को dsRNA वितरण के लिए कई तरीकों संक्षेप किया गया है dsRNA प्रणालीगत RNAi प्रेरित करने के लिए । dsRNA के मौखिक वितरण के लिए नए तरीकों इलाज गैर ट्रांसजेनिक पौधों पर घूस से अंय कीड़ों में RNAi प्रेरित करने के लिए भी पता लगाया गया है (चित्रा 4, चित्रा 5, और चित्रा 6) । खट्टे पेड़ों जड़ों के माध्यम से या तो dsRNAs को अवशोषित करने के लिए प्रदर्शन किया गया है, स्टेम नल (ट्रंक इंजेक्शन), या पत्तियों स्प्रे४२,४४। पहले, खट्टे पेड़ और परिपक्व दाखलताओं दोनों एसीपी और GWSS में एके जीन के लिए इसी कीट विशिष्ट dsRNA के साथ इलाज किया गया है । इन पौधों का इलाज दोनों एसीपी और समय के विभिंन लंबाई के लिए GWSS के लिए मृत्यु दर में वृद्धि हुई४१,४५। एक साथ इन परिणामों का प्रदर्शन है कि dsRNA अध्ययन कीड़ों में विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति में बाधा कर सकते हैं ।

चुनौतियां है कि जीन अभिव्यक्ति के सफल मुंह बंद करने को प्रभावित dsRNA nucleases (dsRNases) के अद्वितीय समूहों में मुख्य रूप से कीड़े और लार स्राव, या पेट पीएच जो, dsRNA ४७ के क्षरण के लिए जिंमेदार हो सकता है की आंत ऊतक में व्यक्त शामिल ,७७,७८. हालांकि, इस तरह के क्षरण को दूर करने के लिए, प्रणालीगत RNAi dsRNA और/या के उच्च सांद्रता का उपयोग करके कीड़ों में कुशलतापूर्वक प्रेरित किया जा सकता है जीन विशिष्ट dsRNA के मौखिक प्रसव के लिए आहार में खूंटी का प्रयोग ऐसे क्षरण को दूर करने के लिए६२, ७९. डिलिवरी और dsRNA के ऊपर भी वाहक अणुओं की मदद से स्थिर किया जा सकता है, जैसे नैनोकणों८० जैसे Chitosan४८, liposomes जैसे Lipofectamine २००० और Metafectene७६, पॉलीथीन ग्लाइकोल७९, क्ले nanosheets८१, और कार्बन क्वांटम५०डॉट । अनुसंधान के लिए dsRNA के प्रभावी वितरण में सुधार करने के लिए जारी है आगर और जेल जीन विशिष्ट dsRNA के साथ संचार टुकड़े का उपयोग कर (डेटा नहीं दिखाया गया है, पूरक वीडियो देखें 4) । इस तकनीक का उपयोग चींटियों को dsRNA की एक प्रभावी खुराक के वितरण के लिए किया जा सकता है कि dsRNA संचारित राल या आगर भोजन के रूप में घोंसला करने के लिए ले जा सकते हैं ।

dsRNA की स्थिरता के अलावा, संयंत्र के ऊतकों में dsRNA के दीर्घकालिक हठ महत्व का है, विशेष रूप से कृषि फसलों के लिए । dsRNA पौधों, फलों, या सब्जियों के संवहनी ऊतकों के माध्यम से वितरित जाइलम में जमा हो सकता है और फ्लोएम में कम एंजाइम गतिविधि से पहले कीड़ों द्वारा किया जा रहा करने के लिए RNAi तंत्र प्रेरित । यह कुछ अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हो सकता है dsRNA एक छोटी अवधि के लिए बनी रहती है, जैसे कि हरे सेम या अब में 6 दिनों के लिए, मिट्टी में ३६ h के लिए६२,८२ ताकि वातावरण में न्यूक्लिक एसिड का संचय की संभावना नहीं हो जाता है । हालांकि, नीना एट अल प्रदर्शन किया है कि nanosheets समय से पहले क्षरण से बड़े dsRNAs की रक्षा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मध्यस्थता पर उनकी निरंतर रिलीज की अवधि में कम से कम 30 दिन८१के एक समय पर ।

कुल मिलाकर यहां dsRNA वितरण रणनीतियों पर चर्चा कीट प्रबंधन के लिए कीट विशिष्ट जीन मौन किया जा सकता है । सिंचाई के पानी के माध्यम से पौधों को dsRNA की आपूर्ति, जड़ से सराबोर, या ट्रंक इंजेक्शन कीट कीड़ों के लिए एक प्रभावी रणनीति, ऐसे रूट भक्षण के रूप में, जिसके लिए कोई कुशल नियंत्रण विधि वर्तमान में उपलब्ध है हो सकता है । dsRNA की डिलिवरी एक वाहक या मिट्टी या आगर के रूप में स्थिर माध्यम का उपयोग सीधे पौधों द्वारा ऊपर उठाने के लिए मिट्टी में जोड़ा जा सकता है । RNAi मध्यस्थता आणविक जैव कीटनाशकों के विकास में धीमी प्रगति के लिए मुख्य कारणों में से एक कुशल मौखिक वितरण तकनीकों की कमी के लिए कुशल RNAi और पर्यावरण की स्थिति के तहत स्थिरता शुरू कर दिया गया है८३। मौखिक प्रसव के तरीकों यहां उल्लिखित भविष्य में कर सकते है न्यूक्लिक एसिड मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने उपचार वितरित करने के लिए संयंत्र के रूप में अच्छी तरह से कीड़े चबाने के लिए वैश्विक खाद्य उत्पादन में कीट नुकसान को कम करने और टिकाऊ पर्यावरण कीट विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा प्रबंधन.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक आभार डोनाल्ड वेबर और मेगन Herlihy (USDA, ARS Beltsville, प्रबंध निदेशक) BMSB और प्रयोग के लिए एचबी और बनाए रखने के लिए प्रदान करने के लिए स्वीकार करते हैं; और मारिया टी गोंजालेज, साल्वाडोर पी लोपेज, (USDA, ARS, फोर्ट पियर्स, fl) और जैकी एल मेट्ज़ (फ्लोरिडा के विश्वविद्यालय, फोर्ट पियर्स, fl) कॉलोनी रखरखाव, नमूना तैयारी, और विश्लेषण के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMSB (H. halys) insects  USDA
ACP (D. citri) insects  USDA
organic green beans N/A
Citrus plants USDA
sodium hypochlorite solution J.T. Baker
green food coloring  McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers  Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture) Sigma
Primers  IDT DNA
SensiMix SYBR Bioline
qPCR ABI 7500 Applied Biosystems 
Spray bottle N/A
Parafilm American Can Company
TaKaRa Ex Taq Clontech
QIAquick Qiagen

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