Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57390
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Horticultural Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

מאמר זה מדגים טכניקות הרומן שפותחו עבור משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA (dsRNA) דרך הרקמות וסקולריים הצמחים עבור התערבות RNA (RNAi) מהצינורות האכלה חרקים.

Abstract

שיפה וצמח sap האכלה חרקים לפלוש השלמות של גידולי פירות כדי לאחזר חומרים מזינים, תוך כדי פגיעה גידולי מזון. חרקים hemipteran בחשבון מספר מזיקים מבחינה כלכלית משמעותית של צמחים לגרום נזק לצמח על ידי ניזון מהצינורות. החרק המסריח חום marmorated (BMSB), Halyomorpha האליס (פשפשים: Pentatomidae), את אסיה הדרים psyllid (ACP), Kuwayama Diaphorina קמחית (פשפשאים: Liviidae) מזיקים חרקים hemipteran הציג בצפון אמריקה, היכן הם הם של הדברה חקלאיים פולשנית מיוחדים בעלי ערך גבוה, שורה, ואת היבולים סיכות פירות הדר, כמו גם נודניק מטרד כאשר הם מצטברים בתוך הבית. עמידות חרקים מינים רבים הובילה לפיתוח שיטות חלופיות של אסטרטגיות ניהול בפשט. זוגיות-גדילי RNA (dsRNA)-RNA בתיווך הפרעה (RNAi) הוא גן להשתיק מנגנון פונקציונלי גנומית מחקרים כי יש יישומים פוטנציאליים ככלי לניהול של חרקים מזיקים. DsRNA exogenously מסונתז או RNA קטנים מפריעות (siRNA) יכולה לעורר יעילים ביותר ג'ין להחרשת דרך ההשפלה של RNA אנדוגני, אשר זה הומולוגי ל מוצג. יעיל וסביבתי השימוש RNAi בתור biopesticides המולקולרי עבור הייצור של חרקים hemipteran דורש ויוו המסירה של dsRNAs באמצעות האכלה. כאן נוכל להדגים שיטות מסירת dsRNA חרקים: טעינה של dsRNA לתוך שעועית ירוקה על ידי טבילה, וקליטת של גנים ספציפיים dsRNA עם משלוח אוראלי דרך בליעה. לנו יש גם המתוארים צמח שאינו הטרנסגניים גישות משלוח באמצעות תרסיסים בריסוס, שורש הירטבות, תא המטען זריקות וכן קליי בגרגרים, אשר עשוי להיות חיוני לשחרור מתמשכת של dsRNA. משלוח יעיל על ידי ingested dsRNA אושר כמו מינון יעיל לזירוז ירידה משמעותית בביטוי של יישוב גנים, כגון חומצה הורמון נעורים O-methyltransferase (JHAMT), vitellogenin (Vg). שיטות חדשניות אלה מייצגים אסטרטגיות עבור משלוח של dsRNA להשתמש בהגנת הצומח, להתגבר על אתגרים סביבתיים על ההדברה.

Introduction

חרקים hemipteran מהווים חלק המזיקים ביותר מבחינה כלכלית משמעותית של agriculturebecause יכולתם להשיג גידול האוכלוסייה מוגברות ולהפיץ מחלות בצמחים. BMSB, ח' האליס פלדה, הוא המזיק פולשני זה הוצג בטעות עם גילויו הראשון דיווחה בשנת 19961בחצי הכדור המערבי ב אלנטאון פנסילבניה מאסיה (סין, טייוואן, קוריאה ויפן). מאז השקתו, BMSB זוהה 43 מדינות, עם האוכלוסיות הגבוהה ביותר באוקיינוס האטלנטי (דה, MD, הרשות הפלסטינית, NJ, אמפר, ו WV), כמו גם בקנדה ובארצות אירופה, והוא מייצג איום פוטנציאלי על החקלאות2. כמו מטרד רב, BMSB יכול לעורר נזק למארחים כ 300 צמחים מוכרים, כולל ערך גבוה גידולים כגון תפוחים, ענבים, צמחי נוי, זריעה, סויה, תירס. נזק נגרם בעיקר בשל המצב של האכלה המכונה lacerate, סומק שם החיה מפלח את היבול מארח עם שלו stylet דמוי מחט כדי לקבל גישה אל החומרים המזינים רקמות וסקולריים2,3. BMSB הוא גם המזיק מקורה כמו הם עשויים למצוא מגורים באזורי מגורים כגון בתי ספר, בתים במהלך סתיו חורף2. כימיקלים, aeroallergens שפורסמו על ידי BMSB דווחו על תגובה אלרגית איליקיט עובדים חיתוך פירות. BMSB עשוי גם לתרום למחלות אלרגיות שמוביל ממגע, דלקת הלחמית דלקת אנשים רגישים4,5. עוד חרק hemipteran, ACP, קמחית ד Kuwayama (פשפשאים: Liviidae), היא מטרד רציני של פירות הדר, ומעבירה את החיידקים שיפה מוגבל (טיריה LiberibacterCandidatus ) גורמת Huanglongbing (HLB), הידוע יותר כמו מחלת ירוק הדר6,7. HLB דווחה לראשונה מסין הדרומית, התפשט 40 שונים אסיה אפריקה, האוקיאנית, דרום, צפון אמריקה מדינות7. ירוק הדר היא בעיה ברחבי העולם עם איום כלכלי הפסדים בשל אובדן פרי הדר; לפיכך, הנהלת ACP נחשב בעל חשיבות עליונה כדי למנוע ולשלוט HLB.

האמצעים לבקרה יעילה של מזיקים חרקים אלו בדרך כלל דורש היישום של הדברה כימית קצרות יחסית חי. הדברה כימית אסטרטגיות שליטה לעיתים קרובות חוסר אסטרטגיות ניהול הסביבה בטוח או פחתו הרגישות עקב עמידות לחומרי הדברה הדברה אוכלוסיות8,9. לפיכך, הדברה ביולוגית של מזיקים עם biopesticides מולקולרית היא חלופה אפשרית, אבל השימוש בה באופן גלובלי נשאר צנוע, מינים שונים של צירעת האפידיוס (למשל, Trisolcus ג'אפוניכאס) יכול להיות גם יעיל כמו ביולוגית טבעית פקדים. RNAi הוא פוטנציאל המתעוררים טכנולוגיות לניהול פולשנית חרקים מזיקים עם biopesticides מולקולרית10. RNAi היא מנגנון רגולטורי ג'ין תיאר היטב מקלה את יעילות posttranscriptional ג'ין להחרשת של אנדוגני כמו גם פולשים dsRNAs באופן ספציפי רצף, שמוביל בסופו של דבר בקרת גנים ב mRNA רמה11,12. בקצרה, כאשר dsRNA אקסוגני הוא הפנימו לתא שזה שהוא מעובד siRNAs על-ידי חבר superfamily RNase השלישי נוקלאז bidentate, נקרא לטעמים, אשר אבולוציונית כולו בתולעים זבובים, צמחים, פטריות, יונקים13, 14 , 15. אלה דופלקסים siRNA נוקלאוטיד 21-25 ואז לשחרר ממנו, משולב בתוך המתחם שתיקה RNA-induced (RISC) כמו מדריך RNAs. מתחם RISC-RNA זה מאפשר זיווג הבסיס של ווטסון-קריק ל משלימים היעד mRNA; זה מוביל בסופו של דבר המחשוף של החלבון Argonaute, תחום רב חלבון המכיל תחום RNase H דמוי, אשר מדרדרת את ה-mRNA המתאימים ומפחית תרגום החלבון, ובכך מוביל ג'ין posttranscriptional להשתיק16 , 17 , 18.

RNAi לניהול הדברה מחייבת המבוא של dsRNA ויוו להשתיק את הגן של עניין, ובכך הפעלת מסלול siRNA. שיטות שונות בהן השתמשו למסירה dsRNA חרקים, חרקים תאים לזירוז RNAi מערכתית כוללת האכלה10,19, טבילה20,21, microinjection22, נשאים כגון ליפוזומים 23, טכניקות אחרות24. RNAi היה הראשון הפגינו Caenorhabditis elegans להשתיק unc-22 גנים מאש מלו25, ואחריו נוקאאוט ביטוי של גנים עלי דרוזופילה melanogaster26. מחקרים ראשוניים פונקציונלי מנוצל microinjection כדי לספק dsRNA חרקים, כגון בומבוס22,27, Acyrthosiphon אפון28, במיוחד גרמנית29, האליס ה30, וחרקים lepidopteran (נבדקה על ידי. Terenius et al. 31). microinjection יש יתרון לספק מנה ומדויקים לאתר של עניין החרק. אמנם דקירות ספיגה כזה עשוי להפיק ביטוי של גנים הקשורים החיסון עקב טראומה32, לפיכך, שוללים את המעשיות שלה בפיתוח חקלאי biopesticides.

שיטה נוספת להעברת dsRNA ויוו היא למסמס, אשר כרוך בליעה או קליטה של dsRNA מאת השעיה של חיות או תאים בדרך כלל במדיום חוץ-תאית שמכילה dsRNA. השריית שימש לזירוז ביעילות RNAi בתאים תרביות רקמה דרוזופילה S2 לעכב במורד הנחל-של-Raf1 (DSOR1) מופעל mitogen חלבון קינאז קינאז (MAPKK)20, כמו גם ב- C. elegans להשתיק את pos-1 ג'ין33. אולם, dsRNA מועברת באמצעות השריית היא פחות יעילה לזירוז RNAi בהשוואה microinjection20. RNAi בתיווך מצרי להשתיק בחרק הלעיסה הוצג לראשונה rootworm תירס המערבי (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) על ידי הלוגיסטים של dsRNA לתוך דיאטה אגר מלאכותי10. דו חות קודמים יש סיכם שיטות לאספקת dsRNA חדורים בתזונה טבעית ספיציפית פרוקי רגליים34. שיטות משלוח אלה נקבעו עוד יותר יעיל וזהובה באמצעים מלאכותיים מסירה; כמו במקרה של זבובים (Glossina morsitans morsitans), שבו שווה נוקאאוט הגנים הקשורים החיסון נצפתה כאשר dsRNA נמסרה או באמצעות ארוחת דם או microinjected35. באופן דומה, משלוח של dsRNA דרך טיפות תפוח חום בהיר עש (Epiphyas postvittana)36, הזחלים diamondback עש (Plutella xylostella)37, כמו גם דבש דבורים38,39 המושרה RNAi יעיל. ניסויים RNAi היעילה ביותר hemipteran נעזרו הזרקה של dsRNA40 כי משלוח אוראלי של dsRNA בחרקים hemipteran מפרך מאז שצריכים להישלח דרך רקמות וסקולריים של הצמח הפונדקאי. RNAi יעיל נצפתה גם ACP, צלף מזוגגות-כנף leafhopper (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA נמסר דרך הדרים וגפנים שקלטה dsRNA לרקמות וסקולריים דרך השורש הירטבות, בריסוס תרסיסים, תא המטען זריקות או הספיגה על ידי ייחורים41,42,43,44,45,46. זה הביא גם הפטנט הראשון על dsRNA נגד ACP (2016, לנו 20170211082 A1). משלוח של siRNA ו dsRNA באמצעות נשאים כגון חלקיקים, ליפוזומים מקנה יציבות, העלאות dsRNA ונמסרו יעילות במהירות מתגלים23,47,48,49 ,50. מחלקה חדשה של כלי רכב מבוססי ננו-חלקיק משלוח עבור חומצות גרעין במבחנה , ויוו היה מסוכם במיוחד עבור יישומים טיפוליים שעשוי להקנות פוטנציאל עצום כמו צורת המשלוח המומנט51. חלקיקים כרכב משלוח עבור dsRNA אולי חסרונות כולל מסיסות, hydrophobicity או bioaccumulation מוגבלת52, אבל משלוח עזר פולימר מתאים עשוי לפצות את החסרונות. פיתוח ושימוש עצמי להעברת נוקלאוטידים מתגלים גם בשם 'antisense oligonucleotides', אשר בודד נטושים RNA/DNA דופלקסים46.

Vitellogenesis של פרוקי רגליים הוא מפתח תהליך השליטה רבייה ומוסדרת על ידי הורמון נעורים (JH) או ecdysone, אשר הם inducers מפתח של סינתזה Vg מאת שומן הגוף; Vg הוא נלקח בסופו של דבר על ידי oocyte לפתח דרך Vg-קולטן בתיווך מצרי-אנדוציטוזה-53. Vg היא קבוצה של polypeptides מסונתז extraovarially, שהיא הכרחית להתפתחות של החלבון חלמון ביצה גדולה,54,vitellin55, לכן חשוב רבייה, הזדקנות56. Vg הושתקה בהצלחה בנמטודות57 , כמו גם בדבורת הדבש (בומבוס) איפה RNAi בתיווך מצרי דלדול של Vg נצפתה מבוגרים וביצים22. RNAi בתיווך posttranscriptional ג'ין להחרשת Vg נבדקה מכיוון שהאמינה שדלדול שלה יוביל אפקט פנוטיפי הנצפה כגון מופחתת פוריות ופריון, פוטנציאל לסייע בשליטה BMSB. הגן JHAMT מקודד את S-adenosyl-L-מתיונין (SAM)-תלוי JH חומצה O-methyltransferase, מזרז את השלב הסופי של מסלול ביוסינטזה JH58. ב- farnesyl מסלול זה רב-תכליתי (FPP) ברצף כשהופכים מן farnesol, חומצה farnesoic, ואחריו ההמרה של מתיל farnesoate JH על-ידי JHAMT. מסלול זה כולו חרקים, פרוקי רגליים במיוחד עבור מטמורפוזה, תהליך התפתחותי מוסדר על ידי הורמונים-59,-60,-61. ב מורי דרב, ביטוי גנים JHAMT ואת הפעילות biosynthetic הוחלף נגזר JH allata הקורפוסים מראים כי הדיכוי תעתיק של הגן JHAMT הוא קריטי עבור הסיום של JH ביוסינטזה58. לכן, הגנים JHAMT ו- Vg נבחרו עבור דלדול ממוקד באמצעות RNAi. RNAi נבחנה גם עצי הדר על השליטה ACP ו- GWSS. עצי הדר שטופלו dsRNA דרך השורש הירטבות, הגבעול הקשה (המטען זריקות), כמו גם בריסוס תרסיסים עם dsRNAs נגד חרקים ארגינין ספציפי קינאז (אי קאי) תעתיקים42,44. יישום אקטואלי של dsRNA זוהה על החופה של עצי הדר, המציין משלוחים יעיל דרך הרקמות צמחים עילאיים, וכתוצאה תמותה מוגברת ACP, GWSS41,42, 45.

במחקר הנוכחי, זיהינו שיטת משלוח דיאטה טבעית עבור טיפולים כגון dsRNA. טכניקה זו פיתח שימש לאחר מכן להשתיק את JHAMT ואת Vg mRNA באמצעות גנים ספציפיים dsRNAs ב BMSB נימפות כמו הפגינו קודמות62. פרוטוקולים אלה-משלוח חדש המודגמות כאן מחליף קונבנציונאלי מערכות אספקה RNA המשתמשות תרסיסים אקטואלי או microinjections. ירקות, פירות, גזע הקשה אדמה קפה, ופעולות חימר. סופגים ב עשוי לשמש עבור משלוח של dsRNA, אשר הינה קריטית להמשך התפתחותו של המזיק biopesticide וניהול הפתוגן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. BMSB לגידול

  1. חרקים BMSB האחורי לפי תרגול מעבדה סטנדרטיים ו שתואר לעיל63.
  2. העלאת ACP (קמחית ד) חרקים הדרים מאכרופילה החממה (22 מעלות צלזיוס), אור טבעי. השתמש ACP למבוגרים, כ 5-7 ימים פוסט וגיחתו.

2. מבחר של ג'ין אזורים, ב חוץ גופית סינתזה של dsRNA

  1. בחר גנים ספציפיים כדי BMSB transcriptome שפורסמו בעבר פרופילי32.
  2. ודא האזורים של הריבית שנבחר משתנות בין 200 עד 500 בסיסים.
  3. לבצע תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) באמצעות התנאים המתוארים להלן כדי ליצור קטעים הקשורים עם הגן שנבחר עניין מ- DNA גנומי. ראה טבלה 1 oligonucleotides הגן הספציפי.
    1. תגובת ה-PCR: בשפופרת PCR 0.25 mL, לשלב 5 µL של 10 X מאגר ה-PCR, µL 4 של dNTP תערובת (2.5 מ מ כל אחד), 2 µL של תבנית ה-DNA (50 ng/µL), 2.5 µL כל של צבעי יסוד 1 ו-2 (10 מיקרומטר), µL 0.25 של ה-DNA פולימראז (U 5/µL) , ומים DNase/RNase חינם µL עד 50.
    2. תנאי ה-PCR: מחזור התגובה PCR כדי להגביר את האזור של הריבית ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ולאחריו מחזורים של 98 ° C עבור 10 s, 55 ° C ל 30 s, 72° C עבור 1 מינימלית Incubate התגובה ב-72 מעלות עבור נוספים 10 דקות Purify באמצעות תגובת ה-PCR ערכת טיהור.
  4. להגביר את השברים PCR שהושג נוסף עם גנים ספציפיים תחל תמר מוקף עם הרצף יזם T7 RNA פולימראז (5'-גה TTA אתא CGA CTC מעשה אתא GGG אגא-3') כפי שצוין קודם62.
  5. השתמש LacZ ג'ין כפקד שלילי (מעושה) עבור RNAi.
    הערה: LacZ הוא גן מקודד β-galactosidase מוגבר מן Escherichiacoli הדנ א הגנומי (צבעי יסוד בשימוש מוצגים בטבלה1).
  6. לבצע תמלול במבחנה להניב dsRNA כפי שתואר קודם62.
  7. להמיס resuspend של dsRNA וכתוצאה מכך מים חינם DNase/RNase µL 150, מודדים את הריכוז ו לאחסן ב- 80 ° C לשימוש עתידי.

3. מסירת dsRNA שימוש שעועית ירוקה

  1. בחר 4 מוקדםth לחלל BMSB נימפות בקעו מן הדבר ביצה בנפח גדול ולהרעיב את אותם עבור 24 שעןת לפני dsRNA האכלה.
  2. בחרו ודק מוסמך אורגני שעועית ירוקה (מצויה ל'), לשטוף עם 0.2% נתרן תת-כלורי פתרון עבור 5 דקות.
    הערה: שעועית ירוקה דקיקה נבחרו כך השעועית בקלות ניתן לאכלס את החצוצרות שלה microcentrifuge 2 מ"ל.
  3. לשטוף 3 פעמים עם ddH2O ויאפשר לאוויר יבש.
  4. חתוך את השעועית הירוקה מהקצה גביע כדי באורך כולל של 7.5 ס מ בעזרת סכין גילוח נקי.
  5. לטבול את השעועית הירוקה שטף, החתוך צינור microcentrifuge קאפ-פחות 2 מ"ל המכיל 300 µL של פתרון שליטה (1:10 לדילול צבע מאכל ירוק (מרכיבים: מים, פרופילן גליקול, Fd & C 5 צהובים, Fd & C כחול 1 ו Propylparaben כמו חומר משמר)).
  6. להפוך דילולים של ה במבחנה מסונתז dsRNAs LacZ, JHAMT או Vg המדללת µg 5 או 20 µg ב 300 µL של מים חינם RNase/DNase להניב ריכוזים הסופי של 0.017 µg/µL או µg 0.067/µL, בהתאמה.
  7. לטבול את השעועית הירוקה שטף, החתוך צינור microcentrifuge קאפ-פחות 2 מ"ל המכיל 300 µL של dsRNA פתרון (מתוך שלב 3.6).
  8. לעטוף, לאטום את הקצוות של הצינורות microcentrifuge תוחמת את השעועית שקוע כדי למנוע אידוי של הפתרון dsRNA וכדי למנוע את החיות מלהיכנס הצינור microcentrifuge.
  9. הצב הצינורות האלה בצורה זקופה בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות לאפשר את הפתרון dsRNA ייטענו ברחבי שעועית ירוקה על ידי נימיות.
  10. מניחים צינורות אלה בכלי נקי תרבות (פוליפרופילן). שלוש נימפות BMSB לחללה 4 בכלי תרבות ברעב
  11. שלוש חיות שונים מתייחסים לכל תרבות כלי שכל אחד מהם מכיל שלושה שעועית ירוקה עם אוכל ירוק צביעה או dsRNA פתרון. לשמור על החרקים-לחות יחסית 25 ° C ו- 72%, תחת photoperiod L 16: 8D באינקובטור.
  12. לאפשר את החרקים ניזונים את השעועית הירוקה (שקוע ולא נספג עם dsRNA) במשך 5 ימים אך לחדש עם דיאטות טריים של dsRNA טיפול ירוק חרוזים לאחר 3 ימים.

4. בזמן אמת כמותי (qPCR) ניתוח של ג'ין הביטוי הבא RNAi בתיווך מצרי להחרשת ב- BMSB

  1. למדוד את השפעת RNAi על רמות הביטוי תורגם על ידי qPCR.
  2. לבודד את הרנ א הכולל מהחיות dsRNA מטופלים ולסינתזה של cDNA62.
  3. תוכנית ההתקנה את התגובות qPCR באמצעות מערכת ה-PCR בזמן אמת, את תחל המפורטים בטבלה1. להשתמש בתנאי רכיבה על אופניים qPCR הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ואחריו 40 מחזורי 95 ° C 15 s, 60 ° C עבור 1 דקות, ביחד עם שלב דיסוציאציה כולל 95 ° C 15 s, 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, 95 ° C 15 s , ו- 60 ° C 15 s.
  4. לקבוע את הסטנדרטים qPCR: להשתמש דילול טורי cDNA שהוכנו RNA הכולל מבודד מן חיה נורמלית כתקן הפניה עבור כימות.
  5. להשתמש BMSB 18s RNA כמו תקן פנימי לתיקון על ההבדלים RNA התאוששות הרקמות32.

5. בריסוס ספריי ביישום עצי הדר בעציץ גדול ושתילים

הערה: צמחים זנים הדרים citrange 'Carrizo' (הדר סיננסיס XPoncirus trifoliata, פיגמיים), היו בהשתתפות של החממה תחת אור טבעי וטמפרטורה, גדלו במיכלים 1.2 L. הצמחים היו לסילוק כל הזמן כדי לקדם את הצמיחה של נבטים בריסוס, שנקרא 'יישור'. ACP מעדיף להאכיל וגם ההטלה על גידול חדש של הדר64.

  1. בחר צמחים או שתילים, לא המים אותם במשך 2-3 ימים לפני השימוש לתת הקרקע להתייבש לחים אך לא יבש לחלוטין.
  2. בעזרת בקבוק ריסוס משאבת יד להחיל 200 מ של dsRNA פתרון (0.5 mg/mL) על החופה התחתון (איור 4A).
    הערה: להכין לעיל הזכיר פתרונות dsRNA DNase/RNase מים חינם.
  3. פוסט-לרסס היישום, לאפשר את הפתרון dsRNA יישומית להיקלט לחלוטין על ידי העלים.
    הערה: עצי הדר נספג dsRNA יישומית ולאחר מכן עלים או צמיחה חדש או ענפים שכוסו לקראת יישום, חולצו; dsRNA לזיהוי באמצעות qPCR, הראה תנועה מערכתית לתוך העלים החופה העליונה עץ ב- 3-4 h-44,-45,-46.
  4. לטעום את הצמיחה החדשה מעצי עקף בעבר לאחר 25-40 ימים על ידי איסוף כ 10 יוצא מן הקצוות של ארבעה סניפים. לחלץ את הרנ א הכולל ולנתח אותם על ידי שעתוק במהופך PCR (RT-PCR) qPCR לנוכחות של ההדק dsRNA שהוחלו באמצעות תחל את המפורטים בטבלה 1, שתואר קודם לכן בשיטות46.
    הערה: המדגם אוסף הכולל בידוד ה-RNA, RT-PCR, qPCR בוצעו כפי שתואר לעיל46.
  5. באופן דומה, topically תרסיס 10 מ"ל dsRNA באזור התחתון של שתיל או עץ בעציץ קטן העלווה.
    הערה: חרקים Hemipteran (ACP ו GWSS) כנתינתן גישה האכלה בדרך כלל 24 שעות ביממה, פוסט טיפולים על צמיחה חדש (עלים) אשר לא מחשיפה ישירות, או שגדל שבועות מאוחר יותר, או צמחים שלמים. זה מיוצר חרקים אשר חיובית שנבדקו עבור dsRNA ב 3, 6 ו- 10 ימים, פוסט האכלה.

6. אדמה/שורש היישום הירטבות בגדולים או קטנים בעציצים שתילים ועצי הדרים

  1. בחר צמחים או שתילים ומים לא אותם במשך 2-3 ימים לפני השימוש לתת הקרקע להתייבש כדי לח אך לא יבש לחלוטין (זה יוצר המרחב האווירי להחזיק את הפתרון נוזלי כדי להחיל).
  2. להוסיף 1 ליטר של dsRNA פתרון (0.2 מ"ג/מ"ל) אדמת עציצים גדולים ביותר (כ- 2.5 מטר) ולהוסיף 1 ליטר של מים (מסרק) לאחר 1 h.
  3. החל 100 מ של dsRNA פתרון (1.33 mg/mL) אדמת בגובה 1 מ' בעציצים עצים בקרקעות חלקית יבש.
  4. עבור שתילים קטנים, להחיל 10 מ"ל של dsRNA פתרון (1 מ"ג/מ"ל) אדמות הקונוסים או על שורשי חשופות (איור 4B, C).
  5. לאפשר את הצמחים מקבלים את הפתרון dsRNA מורחים על אדמת הירטבות להשרות למשך 30 דקות. לאחר מכן להחיל טיפול רק מים רגילים כדי לסייע הקליטה על-ידי שורשים (20 מ"ל צמחים במיכלים צהוב), או 100 מ ל, אם סירים צמח גדולים > 1 ליטר.
    הערה: dsRNA למריחה העלווה הביא זיהוי לכל היותר דיסטלי קצות ענפים בתוך h 3-6 טיפולים פוסט, מציג מערכתית תנועה דרך העצים. סניפים צמיחה חדשים נבחנה חיובית עבור dsRNA טיפולים פוסט 60-90 יום. ייחורים ניתנים לג'וקים (ACP ו- GWSS) dsRNA האכלה bioassay44.

7. גזע ברז (הזרקת גזע עץ) יישום גדול עצי הדר בעציץ ושתילים

  1. בחר שתילי הדר, חדש, או כ- 3.5 שנים צמחים ישנים על הזרקת dsRNA באמצעות הגזע הקש על השיטה (המטען זריקות).
  2. קודחים חורים הצמחים הדרים באמצעות תרגיל ו- 10 מ"מ מקדחה, מטפל לא יעלה על 2 ס מ, או כחצי הקוטר של הגבעול.
  3. לעטוף את קצה נחושת של מזרק כל 4 - 6 פעמים עם רצועה רחבה 0.6 ס"מ (¼ אינץ ') של איטום הסרט כדי למנוע דליפה ליד הקצה.
  4. למלא את מזרקי גזע עץ עם 6 מ ל (1.7 מ"ג/מ"ל) של פתרון dsRNA מדולל במים חינם DNase/RNase (מסומן בתור הפתרון צבעוניות).
  5. להזריק את הפתרון לתוך תא המטען של העץ ולהשאיר את מזרק בתא המטען עבור 6-10 h לאפשר קליטה של הפתרון dsRNA. לאפשר את החרקים ניזונים גזרי מעצי שטופלו ב 3, 10, ו- 30 ימים לאחר הטיפול.
    הערה: dsRNA מוזרק בשיטת הזרקת תא המטען שהתמידו בעצים לתקופה של 30-60 ימים41,42,44. אימות עבור RNAi בוצע על ידי qPCR באמצעות תחל את המפורטים בטבלה1.

8. dsRNA אלייך בגרגרים קליי למסירה חרקים דרך האדמה

  1. יוצקים את החומר סופג לתוך צינור חרוטי 50-mL לסימן 35 מ ל (כ 30 גרם של חומר סופג) ברכבת התחתית.
  2. שופכים 20 מ של dsRNA הפתרון מדולל במים חינם DNase/RNase (100 µg/mL) לתוך צינור כדי להרטיב את כל כושר ספיגה. קאפ הצינור חרוט, עצה צינור כדי לסייע בהסרת אוויר, קאפ ברכבת התחתית.
  3. מקם את הצינור זקוף, ומשהים 1-2 דקות על החלקיקים קליי לספוג את הפתרון.
  4. הוסף מספיק קליי ספוג dsRNA לתערובת האדמה כדי למלא סיר 1 ליטר.
  5. לערבב, להפוך את האדמה ביד כדי לערבב ביסודיות החימר ספוג dsRNA לתוך האדמה.
  6. השתמש האדמה הזו כדי repot שתילים שנבחרו לטיפול dsRNA.
  7. מים האדמה עם 200 מ של מים רגילים ללא dsRNA. לאחר 30 דקות כדי 1 h, פעל עם 100 מ של מים רגילים. לאחר 24 שעות, לשים את הצמח על לוח זמנים השקיה רגילה.
  8. מבחן 4-6 עלים של הצמחים בעציץ שטופלו עם חימר. סופגים, dsRNA לטיפול בכל פוסט חודש dsRNA על ידי איסוף העלים ביותר הפסגה של צימוח חדש.
    הערה: צמחים או ייחורים מצמחים אלו שטופלו נזרקים חרקים בכל עת לאחר 24 שעות פוסט הטיפול ולא הצליחו משלוח RNAi במשך שנה חרקים (נתונים שלא פורסמו).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

משלוח ירקות dsRNA מתווכת באמצעות האכלה ב BMSB 4th לחלל נימפות נבחנה לפיתוח biopesticides מולקולרית באמצעות RNAi עבור מזיקים חרקים פולשני. BMSBs הזנה באמצעות stylets דמוי מחט שלהם על-ידי מנגנון המכונה lacerate, סומק, הגורמת להרס יבולים. שעועית ירוקה אורגנית ודק, דלקתית פ ל', שימשו כדי לבדוק אם מזינים או dsRNA יכול להישלח ויוו BMSB באמצעות האכלה3. מקטעים של שעועית ירוקה שטבלו במים חינם DNase/RNase או פתרון של מים וצבע מאכל ירוק כדי לבדוק את המשלוח ב- BMSB (איור 1 א'). מאכל ירוק שימש ציון ויזואלי לחקות dsRNA. הרקמה וסקולריים של השעועית הירוקה היו רווי צבע מאכל ירוק בשל הזרימה של פתרון בצבע ירוק באמצעות שיפה מאת נימיות62. נימפות BMSB נראו ניזון המקטעים של שעועית ירוקה על-ידי הוספת stylets שלהם לתוך רקמות וסקולריים השעועית הירוקה (איור 1B). הפרשות בצבע ירוק טיפות נצפו לאחר ימי 2 ו- 3 חרקים מוזנים על שעועית רווי אוכל ירוק צביעה המציין החומר ונמסרו בלע בעל פה, עברו דרך הבטן לפני הפרשה (איור 1C, D ).

לאחר מכן בדקנו אם דלדול משמעותי של ביטוי גנים יישוב הושג באמצעות מסירה שעועית ירוקה מתווכת של dsRNA ספציפי BMSB דרך בליעה ב- BMSB. שעועית ירוקה מקטעי שטבלו ולא נספג פתרון של 0.067 µg/µL (20 µg ב µL 300 DNase/RNase מים חינם) או 0.017 µg/µL (5 µg ב 300 µL של מים בחינם DNase/RNase) של dsRNA חוץ גופית בתוך מסונתז ספיציפית BMSB JHAMT ו- Vg , בהתאמה. שעועית ירוקה היו גם שקוע במים לבד, µg 0.067/µL או µg/µL 0.017 LacZ dsRNA (מעושה) כפקדים בהתאמה. התעתיק רמות הוערכו באמצעות qPCR המציין את הביטוי הזה של JHAMT והיה Vg mRNA מופחתת באופן משמעותי ויוו מאת כמעט 4.5 - ו 2.2-fold, בהתאמה (איור 2 א, ב'). כתוצאה מכך, התוצאות מצביעות על ש-dsrna הזה עשוי להיות מועברת דרך הרקמות וסקולריים של שעועית ירוקה לזירוז RNAi מוצלחת.

עוד מזיקים hemipteran, הבאג ארלקינו (HB) (Murgantia histrionica), הגורמת לפגיעה קול יבולים נבדקו גם אם מסירה מוצלחת של חומרים מזינים או טיפולים dsRNA יכולה להיות מועברת באמצעות הירק מתווכת משלוח. הנימפות HB 4th לחלל הורשו ניזון התינוק ראמוס (כרוב הבר var. דגולה) שקוע במים או פתרון של מים עם צבע מאכל ירוק. התוצאות הצביעו על כי HB האכיל, בלע את צבע מאכל ירוק, אשר היה ברור מן הפרשות בצבע ירוק שלהם, לעומת HB זה אכל את הירקות שקוע במים, אשר היה ברור הפרשות (איור 3).

שיטות נוספות למסירה ארעית של dsRNA ריסוס או שורש/אדמה לספוג את תוצאות dsRNA ספיגת כל65,רקמות הצמח66. מוצרים מבוססי-RNAi מותז נמצאים בשלבי פיתוח, עשויים להיות זמינים בקרוב ממתין לאישור. משלוח של dsRNA בשדות באמצעות תרסיסים או שורש הירטבות עשויים לסייע בניהול חרקים פולשנית42,67. בגודל מלא בעצי הדר ושתילים נחשפו dsRNA ספריי בריסוס, או באמצעות קרקע או חשוף שורש קפה, בהתאמה (איור 4). התוצאות הצביעו על כי dsRNAs מועברים על ידי או תרסיסים או אדמה/חשוף שורש הירטבות יכול להתגלות בצמחים הדרים (2.5 מ') 7 שבועות פוסט החשיפה יחיד של 2 גר' dsRNA42. משלוח, בליעה של psyllid dsRNA-AK (20 ng/µL) גדל התמותה psyllid 30-45% (איור 4D)42.

במבחנה עיבד dsRNA יכול להיות מועברת בצורה יעילה כדי רב חרקים באמצעות ברז גזע (המטען זריקות) של גנים ספציפיים dsRNA ישירות לתוך הרקמות וסקולריים של הצמח, אשר ניתן לרכוש באמצעות החרקים כאשר ובעידן צמחים כאלו44 (איור 5). עצי הדר זה נחשפו על ידי זריקות המטען dsRNA, dsRNA יכול להתגלות בצמחים הדר גיל (כ 1 מ') במשך 7 שבועות פוסט החשיפה יחיד באמצעות 6 מ של 1.7 מ"ג/מ"ל של dsRNA בפתרון של DNase/RNase מים חינם (איור 5A B). האכלה שיפה חרקים hemipteran הורשו אז ניזונים אלה צמחים פונדקאים שטופלו dsRNA. ההנחה היא כי dsRNA בהצלחה חלוט, עברה דרך מערכת כלי הדם של הצמחים הדר עבור בליעה על ידי ACP, אשר הפגינו התמותה בעת ניזונו dsRNA-AK42.

Bioassays התפתח 2008 עד 2012, יש כבר הוקרן על פני מגוון רחב של עציצים, שמוצג כדי לספק משלוח dsRNA באופן שבו צמחים יכול לספוג, translocate של dsRNA עבור dsRNA מערכתית הפצתו41,42 . שיטה אחת משתמשת רכיב סופג חימר עם dsRNA ספיחה לתוך מאטריקס חימר; זה כולל מגוון רחב של חרסיות, פולר של כדור הארץ, זאוליט, ואחרים, כמו יתר חומרי ספיגה, תאית, agars, bioplastics, וכו חימר חלקיקים הם נשאים של חומצת גרעין בחינם אבק העשויות לשמש להעברת חומרים פעילים כגון dsRNA כדי קרקעות עבור הצמח ספיגת ובסופו של דבר משלוח. חרקים (איור 6). החימר מורכבים ניתן גם מבחינה כימית להגדיר כדי לשחרר את dsRNA תחת pH ספציפי או תנאים יוניים. קליי שיטות משלוח של dsRNA לתוך צמחים הוכחו לספק dsRNA לתוך עצי הדר בעציץ, וצמחים אחרים מעל 14 חודשים (נתונים לא מוצג). מערכת משלוח זו ניתן לשנות את תכונות הצמח, כגון צבעי הפרחים, גובה הצמח (שלמרגלותיהן) או אחרים. כיום, השימוש העיקרי של שיטה זו הוא פיתוח של מזיקים חרקים יעיל של פתוגן (וירוס) שליטה או ניהול. הגישה יכול להיות חסכוני עבור משתלות, בעלי בתים, היא שיטה שאינה מהונדס.

Figure 1
איור 1 . מסירה של חומרים מזינים או dsRNA דרך שעועית ירוקה- (א) מקטעים של שעועית ירוקה אורגנית ודק שטבלו ולא נספג הפתרון צינור microcentrifuge 2 מ"ל המכיל 300 µL של ddH2O לבד או ddH2O עם צבע מאכל ירוק, עבור 3 שעות. 3 4th לחלל BMSB נימפות היו ברעב עבור 24 שעות והניח בכלי תרבות יחד עם שעועית ירוקה 3 לכל כלי. BMSB (B) ניזונים מקטעים של שעועית ירוקה הושקע במים על ידי פירסינג דרך השעועית הירוקה כדי להגיע את החומרים המזינים עם stylets שלהם. (ג) יום 2 של BMSB האכלה bioassay, החיצים מציינות הפרשות. היום (ד') 3; הפרשות BMSB מוגברת (מסומן בחץ) נצפתה פוסט בליעה של פתרון של ddH2O וירוק מאכל דרך שעועית ירוקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . ניתוח RT-PCR כמותי כדי למדוד את רמת התעתיק לאחר מציאה RNAi בתיווך דלדול של JHAMT ו- Vg ב- BMSB. RNA הכולל מ- 3 נימפות לחלל BMSB 4th בודדים ניזונו JHAMT (א) 20 µg (0.067 µg/µL), ו- Vg (B) dsRNAs 5 µg (0.017 µg/µL) ב- 300 µL של ddH2O מועברת באמצעות מקטעים של שעועית ירוקה, הופרדה ו התעתיק רמות נמדדו על ידי qPCR. DsRNA LacZ (מעושה) שימש פקד שלילי. BMSB 18s RNA שימש תקן פנימי לתיקון הבדלים RNA התאוששות הרקמות. התוצאות שדווחו הן מן משכפל ביולוגי שלוש, קווי שגיאה מציינים ב- SEM. שונות של ניתוח בכיוון אחד (ANOVA) בוצע כדי לבדוק מובהקות סטטיסטית של הנתונים, 0.0001 < p . תוצאות לשכפל מ גוש. et al. 62 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . משלוח אוראלי של טיפול בבאג ארלקינו (M. histrionica ) באמצעות התינוק ראמוס. תינוקות אורגניים כרוב ירוק היו לשטוף 0.2% נתרן תת-כלורי, גזוז, שקוע בתוך צינור microcentrifuge קאפ-פחות מ 2 ל המכיל 300 µL של פתרון של (A) DNase/RNase ddH חינם2O או DNase (B) / RNase ddH חינם2 O פתרון עם צבע מאכל ירוק, לתקופה של 3 שעות. 3-4 לחלל HB נימפות היו ברעב עבור 24 שעות ואז מניחים בכלי תרבות, מותר להאכיל על אלה כרוב ירוק במשך 3 ימים. החצים הלבנים מצביעים על הפרשות מובחנים האכלה פוסט יום 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . תרסיס בריסוס ושורש משפריצה על יישום עצי הדר ושתילים. הצמחים שנבחרו או שתילים מוקדמת לשימוש לא להשקות 2-3 ימים לתת הקרקע להתייבש לחים אך לא יבש לחלוטין. (א) העצים היו קודם עקף וחלים 200 מ של dsRNA פתרון (0.5 מ"ג/מ"ל) מים חינם היה DNase/RNase ביד בקבוק ריסוס משאבת החופה נמוכה יותר. (B) 100 מ של dsRNA פתרון (1 מ"ג/מ"ל) מים חינם DNase/RNase הוחל על האדמה של שתילי בקרקעות חלקית יבש. (ג) 100 מ של dsRNA פתרון (1 מ"ג/מ"ל) מים חינם היה מוחל על שורשי השתילים עבור 3 ח' (D) חשופות DNase/RNase ACP ניזון שתילים שקלטה dsRNA על ידי השורשים חשופות, הראו תמותה מוגברת ACP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . הדר שתיל עץ המטען הזרקת. שתילי הדר גבוה כ- 1 מ' הוזרקו 1.7 מ"ג/מ"ל של dsRNA. חורים לקדוח (א) בשתילי הדר באמצעות מקדחה בקוטר 10 מ מ כדי להוסיף את מזרק לתוך הגבעול של הצמח. קצה נחושת חשוף כל מזרק היה עטוף עם רצועה רחבה 0.6 ס"מ (¼ אינץ ') של איטום הסרט למניעת דליפה. מרססים (B) מלא 6 מ של הפתרון צבעוניות הוחלו על הגבעול (המטען) השתילים. מרססים נותרו במקומם כ 6-10 h עבור ספיגה מלאה של הפתרון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 . קליי אדמה משלוח התיקון של dsRNA לתוך צמחים דרך האדמה. קו חדש של העברת חומר: קליי זה נושאת חומצת גרעין בחינם אבק לשימוש אספקת חומרים פעילים כגון dsRNA קרקעות עבור ספיגת בצמחים, ובסופו של דבר לתוך חרקים. קליי שנהגו (A) ו- (B) אפוי קליי המתארים סובלנות/החזקת מים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פוטנציאל ה האליס היעד גנים
ההצטרפות גודל שם הגן/הומולוגיה
XP_014293026.1 491 Vitellogenin-דמוי-A1 (Vg) (איזופורמים אפשרי: vitellogenin-2-כמו isoform X1 XP_014291483.1; vitellogenin-2-כמו isoform X2 XP_014291484.1).
XP_014290953.1 545 הורמון נעורים חומצה methyltransferase, O-כמו (JHAMT) (אפשרי homolog: הורמון נעורים חומצה XP_014283772.1 O-methyltransferase).
תחל
ה-PCR
שם הגן/הומולוגיה פריימר שם רצף
Vg BMSB F Vitellog P2 CAATTTGATCCACCGACTGTT
Vg BMSB Vitellog P2 R CCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH P1 F GGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH P1 R GTATAGGATTGCCATTTTGG
T7 PCR
Vg T7 BMSB Vitellog P2 4263 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCAAAGTTGGAAGGGAATGA
Vg T7 BMSB Vitellog P2 4753 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH T7 P1 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH T7 P1 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATAGGATTGCCATTTTGG
LacZ T7 LacZ RNAi F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGAAAGCTGGCTACAGGA
LacZ T7 LacZ RNAi R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGGCTTCTGCTTCAAT
AK dsAK-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
AK dsAK 50-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK 50-R TAATACGACTCACTATAGGGAGTGAAGCCCTTGTGGTAGTC
AK dsAK 30-F TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGGACTCTGGAGTAGG
AK dsAK 30-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
GFP dsGFP-F TAATACGACTCACTATAGGGAGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTT
GFP dsGFP-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGTAATGGTTGTCTGGTAAAAGGA
qPCR
Vg RT Vitellog P2 F TTGATAGTTGTTTGGATTTTGAAGGT
Vg RT Vitellog P2 R TCTTACTTGATCAGCGCTCAGAA
JHAMT BMSB JH RT P1 F AGGAAAACCCAAAATGGCAAT
JHAMT BMSB JH RT P1 R ATGTATTCTTCTTTTGGATCTTTTCTTGAG
486 BMSB 18S F3 ATGCCCCCGCCTGTCCTTATT
486 BMSB 18S R3 TGAAAGCAGCCTGAATAGTGG
GFP GFP-F GGTAAAAGGACAGGGCCATC
GFP GFP-R TCAAGGAGGACGGAAACATC
AK AK חשבים-F CGGACTTGAGGGAGAACTGA
AK AK חשבים-R GTGGTAGATACCGCGACCAG
-ג'קוזי a-אמבטיה-F GCGTCTCTTCGGTTTGACGG
-ג'קוזי -אמבטיה-R CACTTCACCATCTGGTTGGC

טבלה 1. Oligonucleotide רצפי RNAi. המפורטים הם גנים ו oligonucleotides המשמש ליצירת PCR שברי dsRNA, תחל qPCR כדי לנתח את רמות תעתיק.

1 וידאו משלימים: Agars וג'ל כמו סופגים עבור משלוח ושחרור מתמשכת של dsRNA. Agars סינטטי או טבעי רטוב, ג'לים עם פתרון dsRNA זה עשוי לשמש בתור פיתיון או דיאטות פרוקי רגליים שונים. לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RNAi הוכיחה להיות כלי חשוב לחקור פונקציה ביולוגית ג'ין ורגולציה, עם פוטנציאל גדול כדי להיות מנוצל עבור ניהול של חרקים מזיקים19,68,69,70, 71. מבחר gene (s) המתאימות עבור להשתיק זן חרקים נתון, שיטת מסירת dsRNA(s) התואמת החרק ועיצוב הן בעל חשיבות עליונה. השיטה אופטימלית עבור אספקת dsRNA לתוך חרק להיקבע מדעית, יחד עם הבחירה המינון היחסי עבור משלוח, כמו שיטות מסוימות עשויות להציע יתרונות ומגבלות אחרות. פיתוח biopesticide מולקולרית בסופו של דבר העלול להיות מתאימים לשחרור סביבתיים, נדרש שיטת משלוח ריאלי. יעילים, יתרון. לדוגמה, dsRNA למריחה הוכיחו להיות אפקטיבית עבור משלוח dsRNA פקד חרקים הדרים, גפנים42,44. אסטרטגיות חדשניות כגון שימוש של פיתיונות, פתרונות סוכרוז, שמרים או חיידקי dsRNA הייצור עבור בליעה ישירה, יישום מקומי של dsRNA על גבי צמחים, או ייצור של dsRNAs ספציפית על ידי הצמחים הטרנסגניים ששונה, קידמו את התפתחות 19,יעיל מבוסס RNAi שולטת72.

דוגמה טובה היא המודגמות כאן עם השימוש של שעועית ירוקה לספק dsRNA (איור 1 ו- 2 איור) שנועדו במיוחד להשפיע ולהפחית מזיקים חרקים חשיבות גלובלית. הירקות פיתח פרוטוקול מסירה dsRNA מתווכת באמצעות מקטעים של שעועית ירוקה שקוע, רווי dsRNA שימש כדי ביעילות היעד גנים ספציפיים לפיתוח זחל BMSB. שעועית ירוקה הם אחד הירקות רבים כי הם טרפו על ידי BMSB, אז אלה שימשו כאמצעי להעברת dsRNA. מדיומים אחרים של dsRNA משלוח שנבדקו (נתונים לא מוצג) אך החמיץ באספקת באמצעות תזונה BMSB כנראה עקב הבדלים מרקם לכלי הדם. לכן, השתמשנו מקטעים של שעועית ירוקה למסור במבחנה מסונתז dsRNA הנימפות BMSB. חומצות גרעין מועברת באמצעות צמח או טכניקה בתיווך ירקות פוטנציאלי יוכל לזירוז RNAi ב החרק של בחירה כפי שרואים כאן עם דלדול של גנים JHAMT ו- Vg BMSB (איור 2)62.

פרוטוקול מסירה זה ירקות dsRNA בתיווך שימש בהצלחה לזירוז RNAi לא רק BMSB אלא גם HB באמצעות ראמוס (איור 3), אבל משלוח אסטרטגיות, שיטות חייב להיות מותאם לכל גן ולכל חרק. לפיכך, מומלץ כי שיטות שונות להיבדק למסירה גם לגבי היעד גנים מרובים עניין אינדיבידואלי או על-ידי הערימה dsRNAs לפחות שני על מנת לקבל יותר פנוטיפי penetrance. יש כבר לסכם מספר שיטות למסירה dsRNA חרקים, חרקים התאים כולל האכלה13,22, השריית73,74, microinjection75וטכניקות אחרות76 המשמש ספיגת dsRNA לזירוז RNAi מערכתית. שיטות חדשות יותר עבור משלוח אוראלי של dsRNA לזירוז RNAi ב חרקים אחרים על ידי בליעה על צמחים שאינם הטרנסגניים התייחס גם כבר בחנו (איור 4, איור 5 ואיור 6). עצי הדר הוכחו לספוג dsRNAs גם דרך השורשים, הגבעול הקשה (המטען זריקות), או תרסיסים בריסוס42,44. בעבר, עצי הדרים וגפנים בוגרת שטופלו עם חרקים dsRNA ספציפי התואם הגן AK ACP והן GWSS. צמחים אלה שטופלו גרם לעלייה בתמותה עבור ACP והן GWSS עבור עד אורכים שונים של זמן41,45. יחד תוצאות אלו מדגימים ש-dsrna הזה לטרפד את הביטוי של גנים ספציפיים של החרקים למד.

אתגרים המשפיעות מוצלחת להחרשת גנים לכלול קבוצות ייחודיות של dsRNA nucleases (dsRNases) באה לידי ביטוי בעיקר בתחום הרקמה הבטן של חרקים, הפרשות הרוק, או את רמת החומציות במעיים אשר, עשוי להיות אחראי על השפלה של dsRNA47 77, ,78. עם זאת, כדי להתגבר על השפלה כזאת, RNAi מערכתית עלולה להיגרם ביעילות בחרקים ניצול ריכוז גבוה של dsRNA ו/או באמצעות PEG בתזונה עבור משלוח אוראלי של dsRNA גנים ספציפיים כדי להתגבר על השפלה כזאת62, 79. ספיגת של dsRNA והספקת עשוי גם להיות התייצב עם העזרה של מולקולות נושאת, כמו חלקיקי80 כמו משקם48, ליפוזומים כמו Lipofectamine 2000 ו- Metafectene76, פוליאתילן גליקול79, קליי nanosheets81, נקודה קוונטית פחמן50. המחקר מתבצע כדי לשפר את מסירת dsRNA באמצעות פיסות אגר, ג'ל רווי גנים ספציפיים dsRNA יעיל (נתונים לא מוצג, ראה 4 וידאו משלימה). ניתן להשתמש בטכניקה זו למסירה של מנה אפקטיבית של dsRNA נמלים שיכול לשאת את dsRNA חדורים שרף או אגר אל הקן כמזון.

בנוסף, היציבות של dsRNA ההתמדה לטווח ארוך של dsRNA ברקמות הצמח הוא בעל חשיבות, במיוחד עבור גידולים חקלאיים. dsRNA המופצים וסקולריים רקמות של צמחים, פירות או ירקות עלולים להצטבר עצה, שיפה עם פעילות אנזים מופחת לפני להיות בלע על-ידי חרקים לזירוז מנגנון RNAi. ייתכן צורך בוודאות יישומים יש dsRNA להימשך לתקופה קצרה, כגון 6 ימים בשעועית ירוקה או יותר, 36 h ב-62,אדמת82 כך ההצטברות של חומצות גרעין הסביבה הופכת לא סביר. עם זאת, נינה et al. הדגימו כי nanosheets יכול להגן על dsRNAs גדול מכל השפלה מוקדמת כמו גם התחלקות שחרורם מתמשכת על משטחים עלה על פני תקופה של 30 יום לפחות81.

באופן כללי האסטרטגיות משלוח dsRNA שנדונו כאן יכול לשמש להשתקת גנים ספציפיים חרקים על ההדברה. אספקה של dsRNA צמחים באמצעות המים להשקיה, שורש הירטבות או הזרקת תא המטען יכול להיות אסטרטגיית יעיל עבור חרקים מזיקים, כגון שורש מזינים, אשר אין שיטה בקרה יעיל זמין כעת. משלוח של dsRNA באמצעות נשא או ייצוב בינוני כגון חימר או אגר ניתן להוסיף ישירות על-ידי צמחים אל הקרקע עבור ספיגת. אחד הגורמים העיקריים עבור התקדמות איטית בפיתוח של biopesticides מולקולרית RNAi בתיווך מצרי לא העדר משלוח אוראלי יעיל טכניקות ליזום RNAi יעיל ויציבות תחת תנאים סביבתיים83. משלוח אוראלי שמפורטות כאן בעתיד ייעשה שימוש בשיטות להעברת חומצות גרעין בתיווך גנים להשתיק טיפולים לשתול sap האכלה, כמו גם ללעוס חרקים להקטין את הנזק חרקים בייצור המזון העולמי ולפתח המזיק אקולוגי בר קיימא ניהול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים בתודה להכיר דונלד וובר, מייגן הרליהי (USDA, ארס Beltsville, MD) מתן BMSB על בסיס חצי פנסיון ניסויים ולשמירה על המושבות; מריה גונזאלס טי סלבדור עמ' לופז, (משרד החקלאות, ארס, בפורט פירס, פלורידה), ג'קי ל' מץ (אוניברסיטת פלורידה, בפורט פירס, פלורידה) תחזוקה המושבה, הכנת הדוגמא של ניתוחים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMSB (H. halys) insects  USDA
ACP (D. citri) insects  USDA
organic green beans N/A
Citrus plants USDA
sodium hypochlorite solution J.T. Baker
green food coloring  McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers  Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture) Sigma
Primers  IDT DNA
SensiMix SYBR Bioline
qPCR ABI 7500 Applied Biosystems 
Spray bottle N/A
Parafilm American Can Company
TaKaRa Ex Taq Clontech
QIAquick Qiagen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoebeke, E. R., Carter, M. E. Halyomorpha halys (Stǻl)(Heteroptera: Pentatomidae): a polyphagous plant pest from Asia newly detected in North America. , (2003).
  2. Leskey, T. C., Hamilton, G. C., et al. Pest Status of the Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha Halys in the USA. Outlooks on Pest Management. 23 (5), 218-226 (2012).
  3. Peiffer, M., Felton, G. W. Insights into the Saliva of the Brown Marmorated Stink Bug Halyomorpha halys (Hemiptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (2), e88483 (2014).
  4. Anderson, B. E., Miller, J. J., Adams, D. R. Irritant contact dermatitis to the brown marmorated stink bug, Halyomorpha halys. Dermatitis : contact, atopic, occupational, drug. 23 (4), 170-172 (2012).
  5. Mertz, T. L., Jacobs, S. B., Craig, T. J., Ishmael, F. T. The brown marmorated stinkbug as a new aeroallergen. The Journal of allergy and clinical immunology. 130 (4), 999-1001 (2012).
  6. McClean, A. P. D., Schwarz, R. E. Greening or blotchy-mottle disease of citrus. Phytophylactica. 2 (3), 177-194 (2012).
  7. Bové, J. M. Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
  8. Kuhar, T., Morrison, R., Leskey, T., Aigner, J. Integrated pest management for brown marmorated stink bug in vegetables. , (2016).
  9. Tiwari, S., Mann, R. S., Rogers, M. E., Stelinski, L. L. Insecticide resistance in field populations of Asian citrus psyllid in Florida. Pest management science. 67 (10), 1258-1268 (2011).
  10. Baum, J. A., Bogaert, T., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nature Biotechnology. 25 (11), 1322-1326 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418 (6894), 244-251 (2002).
  12. Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  13. Macrae, I. J., Zhou, K., et al. Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science(New York, N.Y.). 311 (5758), 195-198 (2006).
  14. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., Hannon, G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 (6818), 363-366 (2001).
  15. Ketting, R. F., Fischer, S. E., Bernstein, E., Sijen, T., Hannon, G. J., Plasterk, R. H. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes & development. 15 (20), 2654-2659 (2001).
  16. Agrawal, N., Dasaradhi, P. V. N., Mohmmed, A., Malhotra, P., Bhatnagar, R. K., Mukherjee, S. K. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 67 (4), 657-685 (2003).
  17. Martinez, J., Patkaniowska, A., Urlaub, H., Lührmann, R., Tuschl, T. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell. 110 (5), 563-574 (2002).
  18. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  19. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
  20. Clemens, J. C., Worby, C. A., et al. Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6499-6503 (2000).
  21. Saleh, M. C., van Rij, R. P., et al. The endocytic pathway mediates cell entry of dsRNA to induce RNAi silencing. Nature cell biology. 8 (8), 793-802 (2006).
  22. Amdam, G. V., Simões, Z. L. P., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC biotechnology. 3, 1 (2003).
  23. Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (11), 824-832 (2009).
  24. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 227-235 (2010).
  25. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  26. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
  27. Gatehouse, H. S., Gatehouse, L. N., Malone, L. A. Amylase activity in honey bee hypopharyngeal glands reduced by RNA interference. Journal of Apicultural. , (2004).
  28. Jaubert-Possamai, S., Le Trionnaire, G., Bonhomme, J., Christophides, G. K., Rispe, C., Tagu, D. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC biotechnology. 7, 63 (2007).
  29. Martín, D., Maestro, O., Cruz, J., Mané-Padrós, D., Bellés, X. RNAi studies reveal a conserved role for RXR in molting in the cockroach Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 52 (4), 410-416 (2006).
  30. Bansal, R., Mittapelly, P., Chen, Y., Mamidala, P., Zhao, C., Michel, A. Quantitative RT-PCR Gene Evaluation and RNA Interference in the Brown Marmorated Stink Bug. PloS one. 11 (5), e0152730 (2016).
  31. Terenius, O., Papanicolaou, A., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57 (2), 231-245 (2011).
  32. Sparks, M. E., Shelby, K. S., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Invasive Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha halys (Stål) (Heteroptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (11), e111646 (2014).
  33. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science (New York, N.Y.). 282 (5388), 430-431 (1998).
  34. Baum, J. A., Roberts, J. K. Chapter Five - Progress Towards RNAi-Mediated Insect Pest Management. Insect Midgut and Insecticidal Proteins. 47, 249-295 (2014).
  35. Walshe, D. P., Lehane, S. M., Lehane, M. J., Haines, L. R. Prolonged gene knockdown in the tsetse fly Glossina by feeding double stranded RNA. Insect Molecular Biology. 18 (1), 11-19 (2009).
  36. Turner, C. T., Davy, M. W., MacDiarmid, R. M., Plummer, K. M., Birch, N. P., Newcomb, R. D. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Molecular Biology. 15 (3), 383-391 (2006).
  37. Bautista, M. A. M., Miyata, T., Miura, K., Tanaka, T. RNA interference-mediated knockdown of a cytochrome P450, CYP6BG1, from the diamondback moth, Plutella xylostella, reduces larval resistance to permethrin. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (1), 38-46 (2009).
  38. Maori, E., Paldi, N., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with Colony Collapse Disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
  39. Hunter, W., Ellis, J., Hayes, J., Westervelt, D., Glick, E. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), e1001160 (2010).
  40. Christiaens, O., Smagghe, G. The challenge of RNAi-mediated control of hemipterans. Current Opinion in Insect Science. 6, 15-21 (2014).
  41. Hunter, W. B., Hail, D., Tipping, C., Paldi, N. RNA interference to reduce sharpshooters, the glassy-winged sharpshooter, and the Asian citrus psyllid. Symposium. , 24-27 (2010).
  42. Hunter, W. B., Glick, E., Paldi, N., Bextine, B. R. Advances in RNA interference: dsRNA treatment in trees and grapevines for insect pest suppression. Southwestern Entomologist. , (2012).
  43. Hail, D. A., Dowd, S., Hunter, W. H., Bextine, B. R. Investigating the transcriptome of the potato psyllid (Bactericera cockerelli): toward an RNAi based management strategy. Proceed. 10th Annual Zebra Chip Reporting Session, San Antonio TX, , 183-186 (2010).
  44. de Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNA Interference-Natural Gene-Based Technology for Highly Specific Pest Control (HiSPeC). RNA INTERFERENCE. , (2016).
  45. Taning, C. N. T., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian Citrus Psyllid RNAi Pathway - RNAi evidence. Scientific reports. 6, 38082 (2016).
  46. Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNAi feeding bioassay: development of a non-transgenic approach to control Asian citrus psyllid and other hemipterans. Entomologia Experimentalis et Applicata. 162 (3), 389-396 (2017).
  47. Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi Efficiency, Systemic Properties, and Novel Delivery Methods for Pest Insect Control: What We Know So Far. Frontiers in physiology. 7, 553 (2016).
  48. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Molecular Biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  49. Li-Byarlay, H., Li, Y., et al. RNA interference knockdown of DNA methyl-transferase 3 affects gene alternative splicing in the honey bee. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12750-12755 (2013).
  50. Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, Carbon Quantum Dot, and Silica Nanoparticle Mediated dsRNA Delivery for Gene Silencing in Aedes aegypti: A Comparative Analysis. ACS applied materials & interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
  51. Nimesh, S. Recent patents in siRNA delivery employing nanoparticles as delivery vectors. Recent patents on DNA & gene sequences. 6 (2), 91-97 (2012).
  52. Draz, M. S., Fang, B. A., et al. Nanoparticle-mediated systemic delivery of siRNA for treatment of cancers and viral infections. Theranostics. 4 (9), 872-892 (2014).
  53. Swevers, L., Raikhel, A. S., Sappington, T. W. Vitellogenesis and post-vitellogenic maturation of the insect ovarian follicle. Comprehensive. , (2005).
  54. Tufail, M., Takeda, M. Molecular characteristics of insect vitellogenins. Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).
  55. Hagedorn, H. H., Kunkel, J. G. Vitellogenin and vitellin in insects. Annual review of entomology. , (1979).
  56. Brandt, B. W., Zwaan, B. J., Beekman, M. Shuttling between species for pathways of lifespan regulation: a central role for the vitellogenin gene family? Bioessays. , (2005).
  57. Murphy, C. T., McCarroll, S. A., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  58. Shinoda, T., Itoyama, K. Juvenile hormone acid methyltransferase: a key regulatory enzyme for insect metamorphosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 11986-11991 (2003).
  59. Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual review of entomology. 55, 111-128 (2010).
  60. Nouzova, M., Edwards, M. J., Mayoral, J. G., Noriega, F. G. A coordinated expression of biosynthetic enzymes controls the flux of juvenile hormone precursors in the corpora allata of mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 41 (9), 660-669 (2011).
  61. Huang, J., Marchal, E., Hult, E. F., Tobe, S. S. Characterization of the juvenile hormone pathway in the viviparous cockroach, Diploptera punctata. PloS one. 10 (2), e0117291 (2015).
  62. Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA delivery system for plant-sap-feeding insects. PloS one. 12 (2), e0171861 (2017).
  63. Khrimian, A., Zhang, A., et al. Discovery of the aggregation pheromone of the brown marmorated stink bug (Halyomorpha halys) through the creation of stereoisomeric libraries of 1-bisabolen-3-ols. Journal of natural products. 77 (7), 1708-1717 (2014).
  64. Hall, D. G., Richardson, M. L., El-Desouky, A., Halbert, S. E. Asian citrus psyllid, Diaphorina citri, vector of citrus huanglongbing disease. Entomologia Experimentalis et Applicata. 146 (2), 207-223 (2012).
  65. Murphy, K. A., Tabuloc, C. A., Cervantes, K. R., Chiu, J. C. Ingestion of genetically modified yeast symbiont reduces fitness of an insect pest via RNA interference. Scientific reports. 6, 22587 (2016).
  66. San Miguel,, K,, Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest management science. 72 (4), 801-809 (2016).
  67. Li, H., Guan, R., Guo, H., Miao, X. New insights into an RNAi approach for plant defence against piercing-sucking and stem-borer insect pests. Plant, cell & environment. 38 (11), 2277-2285 (2015).
  68. Hull, D., Timmons, L. Methods for delivery of double-stranded RNA into Caenorhabditis elegans. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 265, 23-58 (2004).
  69. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  70. Burand, J. P., Hunter, W. B. RNAi: future in insect management. Journal of Invertebrate Pathology. 112 Suppl, S68-S74 (2013).
  71. Rodrigues, T. B., Figueira, A. Management of Insect Pest by RNAi-A New Tool for Crop Protection. , (2016).
  72. Baumann, A. M. T., Bakkers, M. J. G., et al. 9-O-Acetylation of sialic acids is catalysed by CASD1 via a covalent acetyl-enzyme intermediate. Nature communications. 6, 7673 (2015).
  73. Araujo, R. N., Santos, A., Pinto, F. S., Gontijo, N. F., Lehane, M. J., Pereira, M. H. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect biochemistry and molecular biology. 36 (9), 683-693 (2006).
  74. Wuriyanghan, H., Rosa, C., Falk, B. W. Oral Delivery of Double-Stranded RNAs and siRNAs Induces RNAi Effects in the Potato/Tomato Psyllid, Bactericerca cockerelli. PloS one. 6 (11), e27736 (2011).
  75. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 30 (4), 313-321 (2003).
  76. Yu, N., Christiaens, O., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions). Insect Science. , (2012).
  77. Allen, M. L., Walker, W. B. Saliva of Lygus lineolaris digests double stranded ribonucleic acids. Journal of Insect Physiology. 58 (3), 391-396 (2012).
  78. Wynant, N., Santos, D., Verdonck, R., Spit, J., Van Wielendaele, P., Vanden Broeck, J. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect biochemistry and molecular biology. 46, 1-8 (2014).
  79. Ghosh, S. K. B., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA-mediated RNA interference through feeding in larval gypsy moth, Lymantria dispar (Lepidoptera: Erebidae). European Journal of Entomology. 114, 170-178 (2017).
  80. Baigude, H., Rana, T. M. Delivery of therapeutic RNAi by nanovehicles. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 10 (15), 2449-2454 (2009).
  81. Mitter, N., Worrall, E. A., et al. Clay nanosheets for topical delivery of RNAi for sustained protection against plant viruses. Nature plants. 3, 16207 (2017).
  82. Dubelman, S., Fischer, J., et al. Environmental fate of double-stranded RNA in agricultural soils. PloS one. 9 (3), e93155 (2014).
  83. Kola, V. S. R., Renuka, P., Madhav, M. S., Mangrauthia, S. K. Key enzymes and proteins of crop insects as candidate for RNAi based gene silencing. Frontiers in physiology. 6, 119 (2015).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 135 משלוח החרק המסריח marmorated חום psyllid הדר אסיאתי התערבות RNA בליעה פשפשאים
שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B.,… More

Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects. J. Vis. Exp. (135), e57390, doi:10.3791/57390 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter