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篩部と半翅目昆虫の植物 sap 供給の RNA 干渉を誘発する二本鎖 RNA の経口配信方法

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57390

Summary

この記事では、RNA 干渉 (RNAi) 昆虫を摂食する師管液中の植物の維管束組織を通して二本鎖 RNA (dsRNA) の口頭配達のために開発する手法を示します。

Abstract

師部と植物の sap 餌昆虫は侵入作物、食用作物の損傷プロセスの栄養素を取得するために果物の整合性です。半翅目の昆虫は、経済的に相当な害虫植物師管液を摂食による農作物の被害を引き起こす可能性の数を占めています。クサギカメムシ (BMSB)、クサギカメムシ越冬(カメムシ亜目: カメムシ科) と、ミカンキジラミ (ACP)、ミカンキジラミ桑山 (半翅目: Liviidae) が北アメリカに導入された半翅目害虫、彼ら屋内では、柑橘系の果物と主食行、付加価値の高い専門の侵襲性の農業害虫として不快害虫が。多くの種の殺虫剤抵抗性は害虫管理戦略の代替法の開発につながっています。二本鎖 RNA (dsRNA)-仲介された RNA 干渉 (RNAi) はジーンサイレンシングの害虫の管理のためのツールは、潜在的なアプリケーション機能ゲノム研究機構。外因合成 dsRNA または小さい干渉の RNA (siRNA) は、非常に効率的な遺伝子サイレンシング提示に相同である内因性 RNA の分解を介してトリガーできます。RNAi の半翅目昆虫の生物的防除のための分子バイオ農薬として効果的かつ環境使用を介して供給二本鎖 rna の生体内で配信が必要です。昆虫への dsRNA の配信方法を示す: 浸漬、緑の豆に dsRNA の読み込みと摂取を介して口頭配達と遺伝子特異的 dsRNA の吸収します。我々 はまた粘土顆粒と同様、葉面散布、根の水薬、トランク注射 dsRNA の徐放に不可欠なすべての可能性がありますを使用して非遺伝子組換え植物配信アプローチを概説しました。経口摂取の dsRNA によって効率的な配信は、ターゲット遺伝子"幼若ホルモン酸-o-メチルトランスフェラーゼ"(JHAMT) と (vg) の発現低下を誘導するために効果的な投与量として確認されました。これらの革新的な方法を表す作物保護で使用し、害虫管理のための環境の課題を克服する dsRNA の配達のための戦略。

Introduction

半翅目の昆虫は、高い人口成長を達成し、植物の病気を広める能力を agriculturebecause の最も経済的に重要な害虫の一部を構成します。BMSB、 H. 越冬態は 1996年1で報告された最初の目撃にアジア (中国、台湾、韓国、および日本) からペンシルベニア州アレンタウンで西半球で偶然持ち込まれた外来の害虫です。導入以来、BMSB 43 の州で最高の人口だけでなく、カナダ、ヨーロッパ、大西洋 (デ、MD、ペンシルバニア、ニュージャージー州、バージニア、およびウェスト バージニア州) で検出されました、そして農業2へ潜在的な脅威を表します。食性の害虫として BMSB は、リンゴ、ブドウ、観賞植物、種子作物、大豆、トウモロコシなどの高付加価値の作物を含む約 300 の識別された植物ホストへの損傷をしかけることができ。主に動物と維管束組織2,3から栄養素にアクセスを得るために、針のようなスタイレット ホスト作物を貫き、裂くとフラッシュとして知られている餌のモードによる被害です。BMSB 学校など地域生活に住居を見つける可能性があります、また屋内害虫ではあり秋から冬2。化学物質やアレルゲン BMSB によってリリースは、果実収穫労働者の違法なアレルギー反応と報告されました。BMSB も接触性皮膚炎、結膜炎、および敏感な個人4,5で鼻炎をアレルギー疾患に貢献するかもしれない。他の半翅目昆虫、ACP、黒点桑山 (半翅目: Liviidae)、柑橘類の害虫である、師部限定細菌 (カンキツグリーニング病病原細菌うわさの花姫) カンキツグリーニング病 (HLB)、よく知られている原因を転送します。カンキツグリーニング病6,7。HLB は中国南部から最初に報告された、40 異なるアジア、アフリカ、オセアニア、南および北アメリカの国に7を広げています。柑橘類の緑化は柑橘系の果物の損失による経済・金融の損失の恐ろしい世界的な問題それ故に、ACP の管理は最も重要な予防と HLB のと見なされます。

これらの病害虫の効果的な管理のための措置は通常比較的短い化学農薬のアプリケーションが住んでいた必要があります。化学殺虫剤制御戦略頻繁に安全環境管理戦略の欠如や害虫個体群8,9の殺虫剤の抵抗のための感受性を減少しています。したがって、分子バイオ農薬での害虫の生物的防除は潜在的な代わりがその使用を世界的に控えめな、ままあり (例えばTrisolcus ミヤコグサ) 寄生蜂の様々 な種も自然な生物として有効かもしれない制御します。RNAi は潜在的な分子バイオ農薬10と侵襲的な害虫を管理するための技術を新興です。RNAi は mRNA 遺伝子表現の規制につながるシーケンス固有の方法で二本の侵入だけでなく、内因性の効果的な転写後の遺伝子サイレンシングを容易によく記載されている遺伝子調節機構レベル11,12。簡単に言えば、ダイサーは、ワーム、ハエ、植物、菌類、および哺乳類13,で保存されたと呼ばれる外因性 dsRNA は Sirna に二座ヌクレアーゼ RNase III スーパーファミリーのメンバーによって処理されるセルに内面化されます。14,15. これら 21-25 のヌクレオチド siRNA のデュプレックスがアンワインドし、Rna をガイドとして RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) に統合します。この RISC RNA 複合体により、ワトソン Crick の基本組み合わせ補色ターゲット mRNA;これは最終的にアルゴノート蛋白質、対応する mRNA が低下し、それにより転写後遺伝子サイレンシングで16につながるタンパク質翻訳を減らす RNase H のようなドメインを含むマルチ ドメイン蛋白質による胸の谷間につながります,17,18

害虫管理のための RNAi は、siRNA 経路活性化に至る dsRNA体内の興味の遺伝子の沈黙の導入を必要とします。全身 RNAi を誘導するために昆虫および昆虫細胞への dsRNA 配信に使用されている様々 な方法は、1019,20,21, マイクロインジェクション22, キャリアを沈めるリポソームなどを餌23、および他の技術の24。RNAi は線虫で示されて最初の火災によるunc 22遺伝子発現を沈黙とメロ25キイロショウジョウバエ26で焦がした遺伝子の発現の打撃に続いてだった初期の機能研究活用セイヨウミツバチ22,27エンドウヒゲナガアブラムシ2829チャバネゴキブリなどの昆虫に dsRNA を提供するマイクロインジェクションH. 戦って30と鱗翅目昆虫 (Tereniusによって再検討されました31). マイクロインジェクションは有利な昆虫に興味のあるサイトに正確かつ正確な線量を提供します。とはいえ、そのような敗血症の穿刺は、農業バイオ農薬開発にその実用性を排除するため外傷32, したがって、免疫関連遺伝子の発現を引き出す可能性があります。

生体内でdsRNA を提供する別の方法は、浸漬による摂取や dsRNA を含む細胞外媒体で一般に動物または細胞の懸濁液による dsRNA の吸収を含みます。浸漬は RNAi のショウジョウバエS2 ティッシュ文化セル下流 Raf1 (DSOR1) マイトジェン活性化タンパク質キナーゼのキナーゼ (MAPKK)20を阻害するだけでなく、の沈黙にc. の elegansを効率的に誘導するために使用されていますpos 1遺伝子33。ただし、浸漬使用して配信 dsRNA はマイクロインジェクション20に比べて RNAi を誘導するために非効率です。RNAi 仲介された咀嚼昆虫におけるサイレンシングは最初、人工寒天ダイエット10に dsRNA を注入することによって西部のトウモロコシ rootworm (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) に示されました。以前の報告書では、節足動物34に固有の自然な食事療法で注入された dsRNA を交付する方法をまとめています。これらの送付方法はさらに配信の人工的な手段に比較的有効であると判断されました。免疫関連遺伝子の等しいノックダウンが dsRNA の血液の食事または microinjected35に配信されたときが観察されたツェツェ バエ (体重) の場合。同様の光ライトブラウンアップル蛾 (Epiphyas postvittana)36(コナガ) コナガ幼虫37、蜂蜜ミツバチ38,39 で飛沫 dsRNA の配達効率的な RNAi を誘導します。ホスト植物の維管束組織を介して配信する必要がありますので、半翅目の昆虫における dsRNA の口頭配達は困難なので、翅の最も効果的な RNAi 実験は dsRNA40の注射を活用しています。効果的な RNAi も ACP ・ ガラス翼狙撃兵ツマグロヨコバイ (GWSS)、 Homalodisca vitripennisで観察された: dsRNA は柑橘類とルートの水薬、葉面散布による維管束組織に dsRNA を吸収したブドウを介して配信されました。スプレー、トランクの注射、あるいは挿し木41,42,43,44,45,46吸収。これはまた ACP (2016 年米国 20170211082 A1) に対して dsRNA の最初の特許になりました。SiRNA の dsRNA の微粒子やリポソームなどキャリアを使用して配信を与える安定性、および配信された dsRNA の有効性の増加が急速に台頭する23,47,48,49 ,50体外体内のその治療への応用は、適切な配信ベクトル51計り知れない潜在力を与えるかもしれないのために特別に要約された核酸ナノ粒子による配送車両の新しいクラスです。DsRNA の配信手段としてナノ粒子溶解性、疎水性、限られた濃縮52などの欠点がありますが、適したポリマー支援配信は、これらの欠点を補うこともあります。開発と自己実現のヌクレオチドの利用も浮上と呼ばれる 'アンチセンスオリゴヌクレオチド'、単一鎖 RNA/DNA 二重鎖46であるしています。

節足動物のキーである英領バージン諸島; 体脂肪合成のキーの誘導である複製を制御するプロセス、エクダイソンや幼若ホルモン (JH) による規制英領バージン諸島英領バージン諸島受容体を介したエンドサイトーシス53を介して発展途上卵母細胞によって最終的にとられます。英領バージン諸島はポリペプチドの合成 extraovarially、主要な卵卵黄タンパク質ビテリン54,55の開発のために不可欠である、したがって、再現性と加齢56が重要です。英領バージン諸島はミツバチ (セイヨウミツバチ) RNAi が英領バージン諸島の枯渇を介した成虫および卵の22で観察されたと同様、線虫57で正常に沈黙されています。その枯渇は観察可能な表現型効果につながるよう思って調べたの Vg を介した転写後遺伝子サイレンシング RNAi 減少不妊と多産、潜在的 BMSB コントロールを支援します。S-アデノシル-L-メチオニン (SAM) をエンコードする JHAMT 遺伝子-依存 JH 酸-o-メチルトランスフェラーゼ、58中学生合成経路の最終段階を触媒します。この経路ファルネシル、ファルネソールからは、ピロリン酸 (FPP) 順番に farnesoic 酸メチル farnesoate の JHAMT によって公団への変換後に変換されます。この経路は、昆虫や節足動物変身、ホルモン59,60,61によって規制されて発達プロセス用に保存されています。B. 森、JHAMT 遺伝子発現や、あらたに中学生合成活性は、 JHAMT遺伝子の転写抑制が中学生合成58の終了の重要な示唆されました。したがって、 JHAMT 英領バージン諸島の遺伝子は RNAi を用いた対象の枯渇のために選ばれました。RNAi は、ACP と GWSS の制御のための柑橘類の木でテストされています。ルートの水薬を dsRNA と扱われた柑橘類の木、昆虫の特定アルギニン キナーゼ (AK) 成績証明書42,44に対して二本の葉面散布だけでなく、タップ (トランク注射) を幹します。柑橘類の木々、植物の維管束組織を通じて効率的な配信を示す、ACP と GWSS41,42,の死亡率の増加の結果のキャノピー上すべて検出された dsRNA の塗布45

現在の研究では、dsRNA など治療のための自然食配信方法を同定しました。この新しく開発された技術の JHAMT、英領バージン諸島を黙らせるために使用されました mRNA として BMSB ニンフの遺伝子特定の二本を使用して実証以前62。ここに示すこれらの新しい配信プロトコルには、外用スプレーまたは薬剤を使用する従来の RNA 配信システムが優先されます。野菜と果物、幹タップ、潅、・で粘土の吸着剤は、biopesticide 害虫や病原体の管理の継続的な発展に重要である dsRNA の配信のため使用する場合があります。

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Protocol

1. BMSB 飼育

  1. 標準的なラボ実習と説明した63あたりリア BMSB 昆虫。
  2. グラスハウス (22 ° C) と自然光で柑橘系のアジサイの ACP (黒点) 昆虫を上げます。大人の ACP を使用、約 5-7 日で羽化を投稿します。

2. 各種遺伝子領域、dsRNAの試験管内合成

  1. 以前に発行されたトランスクリプトームのプロファイル32から BMSB に特定の遺伝子を選択します。
  2. 選択した関心領域によって異なります 200 に 500 塩基対を確認します。
  3. ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) ゲノム DNA からの興味の選択した遺伝子に関連付けられているフラグメントを生成する次の条件を使用してを実行します。遺伝子特定のオリゴヌクレオチドの表 1を参照してください。
    1. PCR の反作用: 0.25 mL PCR チューブ PCR バッファー、dNTP (2.5 mM) の混合物の 4 μ L、2 μ L の DNA のテンプレート (50 ng/μ L)、プライマー 1 と 2 (10 μ M)、0.25 μ L の DNA ポリメラーゼ (5 U/μ L) の 2.5 μ X 10 の 5 μ L を組み合わせる、DNase/RNase フリー水最大 50 μ L とします。
    2. PCR 条件: サイクル 3 分 10 98 ° C の 30 サイクルによって続いて 95 ° C で関心領域を増幅する PCR 反応 s、55 ° C、30 秒、1 分加温追加 10 分 PCR 反応を用いた浄化のための 72 ° C で反応のための 72 ° C、浄化キットです。
  4. 遺伝子特異的プライマーの T7 RNA ポリメラーゼのプロモーターと並ぶとさらに得られた PCR のフラグメントを増幅 (5'-GAA TTA ATA CGA CTC 法 ATA GGG アガ-3') として言及以前62
  5. RNAi のため (もどき) のネガティブ コントロールとして LacZ 遺伝子を使用します。
    注: LacZ β-ガラクトシダーゼ (使用されるプライマーは、表 1に示す) Escherichiacoli genomic DNA からの増幅をエンコードする遺伝子であります。
  6. 説明以前62dsRNA を生成するための in vitro転写を実行します。
  7. 解散し 150 μ L DNase/RNase 自由水の結果の dsRNA を再懸濁します、濃度、測定、将来使用するため-80 ° C で保存します。

3. dsRNA 使用緑豆の配達

  1. 選択早く 4th齢 BMSB 幼虫から同じ孵化卵の質量と dsRNA を供給する前に 24 時間それらを飢えさせます。
  2. 細長い認定有機緑豆 (インゲンL) を選択し、5 分 0.2% ナトリウム次亜塩素酸溶液で洗浄します。
    注: 細長い緑色の豆は、豆は 2 mL の遠心管で容易に収容することができますので、選ばれました。
  3. DdH2O 3 回を洗浄し、乾いた空気で乾燥させて。
  4. きれいなかみそりの刃を使用した 7.5 cm の長さの合計に萼の端から生豆をトリムします。
  5. 制御ソリューションの 300 μ L を含むキャップレス 2 mL 遠心チューブ内洗浄とトリミングされた緑色の豆を浸す (、1:10 緑の食品着色料の希釈 (成分: 水、プロピレング リコール、Fd & C 黄色 5、Fd & C ブルー 1、および、プロピルパラベン防腐剤))。
  6. [生体外の作る希釈希釈 5 μ g または 0.017 μ g/μ L または 0.067 μ g/μ L の最終濃度をそれぞれ生成するため RNase/DNase 自由水の 300 μ L で 20 μ g が英領バージン諸島、JHAMT、LacZ の二本を合成しました。
  7. キャップレス 2 mL 遠心管内の dsRNA ソリューション (ステップ 3.6) から 300 μ L の洗浄とトリミングされた緑色の豆を浸します。
  8. ラップし、dsRNA 溶液の蒸発を避けるために、動物が遠心管に入るを防ぐために浸漬豆を囲むマイクロ遠心チューブ用のエッジをシールします。
  9. 毛管作用によって緑豆でロードする dsRNA ソリューションを許可する 3 時間室温で直立した方法でこれらの管を配置します。
  10. きれいな培養容器 (ポリプロピレン) にこれらの管を配置します。場所 3 には、培養容器で 4th齢 BMSB 幼虫が餓死しました。
  11. 緑色食品の着色や dsRNA の溶液で 3 つの緑色の豆を含む各培養器あたり 3 つの動物を扱います。25 ° C および 72% の相対湿度、インキュベーターで 16 L: 8 日長下で昆虫を維持します。
  12. 緑豆 (浸漬および dsRNA を吸収) を餌に昆虫は、5 日ですが 3 日後 dsRNA 治療緑ビーズの新鮮な食事を補充します。

4. リアルタイム定量解析の式以下 RNAi 仲介におけるジーンサイレンシング BMSB (qPCR)

  1. QPCR による RNAi の転写産物発現レベルに及ぼす影響を測定します。
  2. DsRNA 扱われる動物からの総 RNA を分離し、62の cDNA を合成します。
  3. リアルタイム PCR システムおよび表 1に示すプライマーを用いた qPCR 反応をセットアップします。次の qPCR サイクリング条件を使用: 95 ° C, 10 分後 40 サイクル 95 ° C の 15 s、95 ° C、15 を含む解離ステップと一緒に、1 分の 60 ° C s、60 ° C で 1 分、95 ° C、15 s、と 60 ° C で 15 秒。
  4. QPCR 基準を決定する: 定量化のための参照基準として通常の動物から分離された総 RNA からの cDNA のシリアル希薄を使用します。
  5. 内部標準として BMSB 18 s RNA を使用して、組織の32から RNA 回復の違いを修正します。

5 大きな鉢植えな柑橘類の木々 の苗葉面散布アプリケーション

注: カンキツ品種 'カリーゾ' トロイヤーシト (Citrus sinensis XPoncirus カラタチ、ミカン科) の植物は、自然光と温度、1.2 L の容器で栽培温室で維持されました。植物は、'フラッシュ' と呼ばれる葉新芽の生育を促進するために常に剪定。ACP はフィードと柑橘類64の新しい成長の産卵することを好みます。

  1. 植物または苗を選択し、土壌を乾燥湿気しますが、完全に乾燥していないように使用前に 2-3 日間それらを水はありません。
  2. (図 4 a) の下のキャノピーに dsRNA 液 (0.5 mg/mL) の 200 mL を適用手ポンプ スプレー ボトルを使用しています。
    注: の上記準備 DNase/RNase 自由水の dsRNA ソリューションを言及しました。
  3. アプリケーションをスプレー後、葉が完全に吸収されるまで適用された dsRNA ソリューションを許可します。
    注: 柑橘類の木の吸収応用 dsRNA と、いずれかの新しい成長、またはアプリケーションの前に覆われていた枝から葉が抽出されました。dsRNA は qPCR を使用して検出された、3-4 h44,45,46でツリーの一番上の天蓋の葉に全身の動きを示した。
  4. 後 25-40 日を集めることによって 4 つの枝の先端から約 10 葉以前突破した木から新たな成長をサンプルします。総 RNA を抽出し、逆転写 PCR (RT-PCR) による分析と qPCR プライマーを用いた応用 dsRNA トリガーの有無を表 1 に示す、前述方法46
    注: サンプル コレクション、合計の RNA の隔離、RT-PCR 法と qPCR 行った前述46として。
  5. 同様に、苗や小さな鉢植えのツリーの葉の下部の領域に局所的に 10 mL dsRNA をスプレーします。
    注: 半翅目昆虫 (ACP および GWSS) 24 h で通常餌のアクセスを与えられた、新しい成長 (葉)、ない直接散布、または、育った数週間後、または全体の植物の治療法を掲載します。これは 3、6、および 10 日 dsRNA の正のテストするポスト餌昆虫を作り出した。

6. 土/根施肥大規模なまたは小さな鉢植え柑橘類の木々 と苗

  1. 植物や苗を選択し、2-3 日はなく減衰させるため乾燥土壌をように使用する前にそれらを水は完全に乾燥 (これは適用する液を保持する空気スペースを作成します)。
  2. 大きく鉢植えな植物 (約 2.5 m) の土に dsRNA 溶液 (0.2 mg/mL) 1 L、1 h 後 (チェイサー) 水 1 リットルを追加します。
  3. 部分的に乾燥した土で鉢植え身長 1 m の土に dsRNA 溶液 (1.33 mg/mL) 100 mL 木を適用します。
  4. 小苗の円錐形の土または裸の根 (図 4 b, C) dsRNA 溶液 (1 mg/mL) 10 mL を適用します。
  5. 植物として 30 分間浸漬する土壌潅注の際適用 dsRNA ソリューションを受け取ることを許可します。大きな鉢なら > 1 ガロン (黄色の容器の植物のため 20 mL) または 100 mL の根によって吸収を支援するために普通の水の唯一の治療法を適用します。
    注: 検出結果葉に局所的に適用される dsRNA 3 6 h 記事トリートメント、木を通して全身の動きを示す内枝のほとんどの遠位先端。60 〜 90 日のポスト処理で dsRNA の成長の新しい枝が陽性。挿し餌生物検定44dsRNA 昆虫 (ACP および GWSS) を提供しています。

7 大きな鉢植えな柑橘類の木々 の苗幹タップ (木樹幹注入) アプリケーション

  1. 新しい、または約 3.5 年の古い植物幹細胞を用いた注入するためタップ (トランク注射) メソッドは、柑橘類の苗を選択します。
  2. ドリルと 2 cm 以上、幹の直径の約半分を超えないよう注意して取って、10 mm のドリルビットを使用して柑橘類の植物の穴をドリルします。
  3. 4-6 回先端付近の漏れを防止するフィルム シールの 0.6 cm (1/4 インチ) 広いストリップと各インジェクターの銅の先端を包みます。
  4. DNase/RNase 自由水で希釈した dsRNA ソリューションの 6 mL (1.7 mg/mL) とツリー トランク インジェクターを埋める (示されるここでは着色溶液として)。
  5. 木の幹に薬液を注入し、dsRNA ソリューションの吸収を許可する 6-10 h のトランクにインジェクターを残します。3、10、30 日後の治療で扱われた木から挿し木を餌に昆虫を許可します。
    注: トランク注入法を用いた注入 dsRNA 木の 30-60 日41,42,44の期間の永続化。RNAi のため検証は qPCR1 プライマーを使用して実行されます。

8. dsRNA 昆虫を介して土壌への配信処理クレイ顆粒

  1. 地下鉄で 35 mL マーク (吸収性粘土の約 30 g) 50 mL コニカル チューブに吸収性の粘土を注ぐ。
  2. すべての吸収をウェットにチューブに DNase/RNase 自由水 (100 μ g/mL) で希釈した dsRNA 溶液 20 mL を注ぐ。キャップ円錐管、空気を除去するためにチューブをヒントし、チューブをキャップします。
  3. チューブを縦置きにして、ソリューションを吸収する粘土粒子の 1-2 分放置しましょう。
  4. 1 ガロン ポットを埋めるため土壌ミックスに十分な dsRNA 浸漬の粘土を追加します。
  5. 混合し、土壌に dsRNA 浸した粘土を徹底的にミックスに手で土を回します。
  6. DsRNA 治療選択の苗を植え替えることにこの土を使用します。
  7. 水 dsRNA のない普通の水の 200 mL の土壌。1 時間 30 分後に普通の水 100 mL で従ってください。24 h 後通常水まきのスケジュールに植物を置きます。
  8. 最も新しい植物成長の葉を集めることによって粘土の吸着剤と dsRNA 扱われた鉢植えの 4-6 葉 dsRNA の各 1 ヶ月後の治療をテストします。
    注: 植物またはこれらの処理植物からの切断うんざりしている昆虫にいつでも 24 時間治療の記事し、昆虫 (未発表データ) への年まで配信の RNAi にできた後。

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Representative Results

BMSB 4th齢幼虫の摂食による野菜の仲介された dsRNA 配信は侵襲的な害虫の RNAi を用いた分子バイオ農薬の開発のテストされました。BMSBs フィードと呼ばれるメカニズムによって、針のようなスタイレットを使用して裂くし、フラッシュ、作物にかなりの被害が発生します。細長い有機緑豆、 P. 尋常性L、栄養素や dsRNA が体内BMSB を通じて届け餌3かをテストする使用されました。緑色の豆のセグメントは、DNase/RNase フリー水または BMSB (図 1 a) で配信をテストする緑の食品着色料と水の溶液に浸漬した.緑の食品着色料は、dsRNA を模倣する表示として使用されました。緑豆の維管束組織された毛細管62師部を通じて緑着色溶液の流れのため緑の食品着色料と飽和状態。BMSB ニンフは、緑豆 (図 1 b) の維管束組織に、スタイレットを挿入することによって緑の豆のセグメントに給餌を見られました。豆緑の食品着色を示す提供された材料を経口投与されていたし、排泄量 (図 1 D の前に消化管を通過で飽和状態で飼育した虫で 2、3 日後緑着色された糞尿液滴がみ).

その後標的遺伝子発現の重要な枯渇は BMSB の摂取を介して BMSB 特定 dsRNA の緑豆を介した配信を使用して達成された場合をテストしました。緑豆セグメント浸漬し、0.067 μ g/μ L (DNase/RNase 自由水の 300 μ L で 20 μ g) の 0.017 μ g/μ L (DNase/RNase 自由水の 300 μ L、5 μ g) in vitro合成 dsRNA BMSB JHAMT、英領バージン諸島に固有のソリューションを吸収、それぞれ。緑豆もそれぞれのコントロールとして単独で水、0.067 μ g/μ L または 0.017 μ g/μ L LacZ dsRNA (もどき) に浸漬した.トラン スクリプト レベル qPCR を示す JHAMT の式を使用して評価され、Vg mRNA 大幅に減少いた生体内でほぼ 4.5- と 2.2、それぞれ (図 2 aB)。その結果、その dsRNA 成功した RNAi を誘導するために緑色の豆の維管束組織経由で配信されることがありますが示唆されました。

他の半翅目害虫コールまた野菜を使って栄養素や dsRNA 治療の正常に配信が配信される場合、テストされた作物に被害をもたらすカメムシ (HB) (Murgantia histrionica) を介した配信。4th齢 HB 幼虫が赤ちゃんコラード (アブラナ属の oleracea varフィードを許可されました。viridis)水や緑の食品着色料と水の溶液に浸漬。HB が供給され、明確な糞尿 (図 3) をしていた水に浸して野菜を摂取 HB と比較すると、緑の色糞尿から明らかだったのグリーン食品の着色料の摂取が示唆されました。

噴霧またはルート/土壌植物組織65,66のすべての dsRNA 取り込み結果を浸漬の dsRNA の一時的な配信方法。RNAi ベースに塗布した製品開発し、承認保留中のすぐに利用できる場合があります。スプレーまたはルートの水薬を使用してフィールドの dsRNA の配達は、侵襲的な昆虫42,67の管理に役立つ場合があります。柑橘類の木々 をフルサイズと苗は、葉面散布または土壌または裸ルートそれぞれ土砂降り (図 4) によって、dsRNA にさらされました。二本は、どちらかのスプレーで配信または 7 週間ポスト dsRNA42の 2 g の単回暴露のカンキツ (高さ 2.5 m) 土壌・裸ルートの水薬を検出できることが示唆されました。配信やキジラミ dsRNA AK (20 ng/μ L) の摂取 30-45% (図 4)42キジラミの死亡率の上昇。

In vitro転写食性昆虫の捕食などの植物44 時に昆虫によって獲得できる植物の維管束組織に直接遺伝子特定 dsRNA の幹タップ (トランク注射) を使用してに dsRNA を効率的に配信できます。(図 5)。なぜならトランク注射による dsRNA にさらされた柑橘類の木々、dsRNA 検出できる高齢者シトラス植物 (約 1 m) で 7 週間投稿 DNase/RNase のソリューションで dsRNA の 1.7 mg/mL の 6 mL を使用して単一露出無料水 (図 5 a、B)。半翅目昆虫の師部餌は dsRNA 処理これらのホスト植物を餌に、許可されました。DsRNA が正常に注入し、dsRNA AK42に供給されるときの死亡率を示した ACP によって摂取の柑橘類の植物の維管束系が移動されると見なされます。

生物検定 2008 年から 2012 年に開発した、選別され鉢植えのさまざま、dsRNA を植物が吸収し、全身 dsRNA 発信41,42 dsRNA を若し方法で配信を提供するために示されています。.1 つの方法は、粘土行列に dsRNA 吸着粘土吸収性コンポーネントを使用します。これとしてでなく、他の吸収性材料、セルロース、寒天、バイオ プラスチック、粘土、白土、ゼオライト、および他のさまざまな含まれていますなど粘土粒子が有効成分を提供するために使用可能性がありますほこり無料核酸キャリア土壌植物吸収と最終的に昆虫 (図 6) への配信のために dsRNA など。複雑な粘土には、特定の pH やイオン強度下で dsRNA を解放する化学的に構成できます。植物に dsRNA の粘土の配信方法は、鉢植えの柑橘類の木に dsRNA と 14 ヶ月以上 (データは示されていない) の他の植物を提供するために示されています。この配信システムは、花の色や草丈 (わい) などの植物の特徴を変更する使用できます。現在、このメソッドの主な用途は、効果的な害虫や病原体 (ウイルス) コントロール管理の開発のためです。アプローチは保育所や住宅所有者は、コスト効果的なことができ、非組み換えの方法です。

Figure 1
図 1.栄養素や緑豆を dsRNA の配信します。細長い有機緑豆の (A) セグメント浸漬し、ddH2O だけの ddH2O 緑の食品着色料、3 時間で 300 μ L を含む 2 mL 遠心チューブにソリューションを吸収します。3 4th齢 BMSB 幼虫が 24 h に飢えていたし、容器ごと 3 緑豆と一緒に培養容器に配置します。(B) BMSB フィード インゲンのスタイレットを栄養素に到達する緑豆をピアスで水に浸漬のセグメント。(C) 2 日目餌生物検定 BMSB の矢印は糞尿を示すため。(D) 日 3;(矢印で表されます) 増加 BMSB 排泄観察 ddH2O のソリューションのポスト摂取とグリーン グリーン豆を着色食品。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2.JHAMT と BMSB の英領バージン諸島の RNAi による枯渇後トラン スクリプトのレベルを測定する定量的 RT-PCR 法によって解析。3 個別 BMSB 4th齢幼虫からの総 RNA は 20 μ g (0.067 μ g/μ L)、JHAMT (A) の供給と ddH2O の 300 μ L で英領バージン諸島(B) 5 μ g (0.017 μ g/μ L) 二本緑色の豆のセグメントを介して配信、分離されたとqPCR による転写レベルを測定しました。LacZ dsRNA (もどき) のネガティブ コントロールとして提供しています。BMSB 18 s RNA は、組織からの RNA の回復の違いを補正するため、内部標準物質として使用されました。3 つの生物学的複製から結果報告があり、誤差範囲を示す SEM.P < 0.0001 データの統計的有意性をテストするため、一方向の分散分析 (ANOVA) を行った。ゴーシュから再現結果62この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3.カメムシの治療の経口デリバリー (M.histrionica) 赤ちゃんコラード グリーンを使用しています。有機ベビー コラードいた 0.2% ナトリウム次亜塩素酸で洗浄、トリミング、および溶液 (A) DNase/RNase フリー ddH2O、または (B) DNase/RNase フリー ddH2 300 μ L を含む 2 mL キャップ少ない微量遠心チューブに浸漬緑の食品着色料、3 h の期間と O ソリューション。3 4 齢 HB 幼虫が 24 h に飢えていた培養容器に配置し、3 日間これらのコラードにフィードを許可しました。白い矢印は、観察 3 日目の記事の餌に糞尿を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4.葉面散布とルートは、柑橘類の木々 の苗アプリケーションをびしょぬれ。を使用する、選択した植物や事前の苗木は土壌を乾燥湿気しますが、完全に乾燥していないように 2 〜 3 日の骨抜きにされていません。(A) 木が突破された最初、DNase/RNase 自由水の dsRNA ソリューション (0.5 mg/mL) の 200 mL が低いキャノピーに手で「ポンプ スプレー ボトルを適用されます。(B) 100 mL dsRNA の水溶液 (1 mg/mL) の DNase/RNase 無料水は部分的に乾燥した土で苗の土に適用されました。裸の根に dsRNA を吸収していた苗供給自由水は約 3 h (D) 用の苗の裸の根に適用した DNase/RNase の dsRNA 溶液 (1 mg/mL) 100 mL (C) ACP は、ACP 死亡率の増加を示した。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5.柑橘苗木樹幹注入。柑橘苗高さ約 1 m は、dsRNA の 1.7 mg/mL を注入しました。(A) ドリル穴 10 mm 径のドリルビットを使用して植物の茎にインジェクターを挿入する柑橘類の苗。各インジェクターの露出した銅の先端は、漏れを防止するフィルム シールの 0.6 cm (1/4 インチ) 広いストリップと包まれました。(B) インジェクターの着色溶液 6 ml は、苗の茎 (幹) に適用されました。インジェクターは、ソリューションの完全な吸収のため約 6-10 時間のための場所に残っていた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6.土壌から植物への dsRNA の粘土土壌改正配達。材料を提供する新しい行: 植物の吸収における土壌に dsRNA など有効成分を提供する使用するためほこり無料核酸キャリアである粘土、最終的に昆虫に。Unbaked 粘土の (A) と (B) 焼き粘土描いた水耐性/保存します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

潜在的な h. 越冬標的遺伝子
加盟 サイズ 遺伝子名/ホモロジー
XP_014293026.1 491 ビテロジェニンの A1 のような(英領バージン諸島)(可能なアイソ フォーム:ビテロジェニンの 2 のようなアイソ フォーム X1 XP_014291483.1;ビテロジェニンの 2 のようなアイソ フォーム X2 XP_014291484.1)。
XP_014290953.1 545 幼若ホルモン酸メチル基転移酵素-様 (JHAMT)(可能な相同物: 幼若ホルモン酸-o-メチルトランスフェラーゼ XP_014283772.1)。
プライマー
PCR
遺伝子名/ホモロジー プライマー名 シーケンス
英領バージン諸島 BMSB Vitellog P2 F CAATTTGATCCACCGACTGTT
英領バージン諸島 BMSB Vitellog P2 R CCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH P1 F GGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH P1 R GTATAGGATTGCCATTTTGG
T7 PCR
英領バージン諸島 T7 BMSB Vitellog P2 4263 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCAAAGTTGGAAGGGAATGA
英領バージン諸島 T7 BMSB Vitellog P2 4753 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH T7 P1 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH T7 P1 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATAGGATTGCCATTTTGG
LacZ T7 LacZ RNAi F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGAAAGCTGGCTACAGGA
LacZ T7 LacZ RNAi R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGGCTTCTGCTTCAAT
AK dsAK F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
AK dsAK 50 F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK 50 R TAATACGACTCACTATAGGGAGTGAAGCCCTTGTGGTAGTC
AK dsAK 30 F TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGGACTCTGGAGTAGG
AK dsAK 30-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
GFP dsGFP F TAATACGACTCACTATAGGGAGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTT
GFP dsGFP R TAATACGACTCACTATAGGGAGGTAATGGTTGTCTGGTAAAAGGA
qPCR
英領バージン諸島 RT Vitellog P2 F TTGATAGTTGTTTGGATTTTGAAGGT
英領バージン諸島 RT Vitellog P2 R TCTTACTTGATCAGCGCTCAGAA
JHAMT BMSB JH RT P1 F AGGAAAACCCAAAATGGCAAT
JHAMT BMSB JH RT P1 R ATGTATTCTTCTTTTGGATCTTTTCTTGAG
18 歳 BMSB 18 F3 ATGCCCCCGCCTGTCCTTATT
18 歳 BMSB 18 R3 TGAAAGCAGCCTGAATAGTGG
GFP GFP F GGTAAAAGGACAGGGCCATC
GFP GFP R TCAAGGAGGACGGAAACATC
AK AK クワント-F CGGACTTGAGGGAGAACTGA
AK AK クワント-R GTGGTAGATACCGCGACCAG
浴槽は -浴槽-F GCGTCTCTTCGGTTTGACGG
浴槽は -浴槽-R CACTTCACCATCTGGTTGGC

テーブル 1。RNAi のオリゴヌクレオチドのシーケンス。遺伝子と転写レベルを分析する PCR フラグメント、dsRNA、qPCR プライマーの生成に使用するオリゴヌクレオチドのとおり。

補助ビデオ 1: 寒天と配信の dsRNA の徐放性吸収剤としてゲル。水和物の合成又は天然の寒天と餌やダイエットとして用は様々 な節足動物 dsRNA ソリューションが付いているゲル。このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください。

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Discussion

RNAi は、遺伝子生物学的機能と規制の害虫19,68,69,70,の管理のために利用するための大きな可能性を探索するための重要なツールであること証明されています71. デザインおよび特定の昆虫種の虫に対応する dsRNA(s) の配信方法を黙らせるための適切な遺伝子の選択が最も重要なの両方です。昆虫に dsRNA を配信する最適な方法は長所とその他の制限を提供するかもしれない特定のメソッドとして配信、相対的な線量の選択と共にの経験的に決定する必要があります。環境リリースに適して可能性があります最終的に分子 biopesticide の開発、実現可能な効率的で有利な配信方法が必要です。たとえば、局所的に適用される dsRNA は柑橘類に防虫のブドウ42,44dsRNA 配信のため有効であること示しています。直接摂取、植物に dsRNA の局所アプリケーションまたは変更された遺伝子組換え植物による特定の二本鎖 rna の生産のための餌、ショ糖液、酵母や細菌の dsRNA の生産の使用のような革新的な戦略の開発高度な効果的な RNAi ベース コントロール19,72

DsRNA (図 1および図 2) 具体的影響を与え、世界的な重要害虫を削減するように設計を提供する緑の豆の使用で良い例をここで発揮します。緑豆のセグメントを使用して仲介された dsRNA 配信プロトコル浸漬 dsRNA で飽和した新開発の野菜は、BMSB に幼生を効果的に標的遺伝子の特定に使用されています。緑豆は BMSB によって貪食される多くの野菜の 1 つで、これらは dsRNA を提供する媒体として使用されたので。DsRNA 配信他のメディア テスト (データは示されていない) が BMSB 血管テクスチャの違いに起因する栄養の供給に成功しました。したがって、我々 は BMSB ニンフに生体外で合成された dsRNA を提供するのに緑の豆のセグメントを使用しました。植物や野菜を介した手法を介して配信核酸潜在的選択 BMSB (図 2)62 JHAMT 英領バージン諸島の遺伝子の枯渇をここで観察した昆虫に RNAi を誘導することがあります。

この野菜仲介された dsRNA の配信プロトコルが配信戦略 BMSB のみならずコラード (図 3) を使用しても HB で RNAi を誘導するために正常に使用されています、遺伝子および昆虫ごとに方法を最適化しなければなりません。したがっての興味の複数の遺伝子を個別に目標に関して同様の配信またはより良い表現型浸透度を得るために、少なくとも 2 つ鎖 Rna スタッキングによって、さまざまな方法をテストすることをお勧めします。昆虫および昆虫の細胞供給13,22,73,74、マイクロインジェクション75、およびその他のテクニックを浸漬を含む76用に dsRNA 配信するためいくつかの方法がまとめられています。dsRNA 取り込み全身 RNAi を誘導します。他の昆虫に扱われた非遺伝子組換え植物の摂取による RNAi を誘導する dsRNA の口頭配達のための新しい方法はまた探検 (図 4図 5および図 6) をされています。柑橘類の木は、根を介していずれかの二本を吸収、タップ (トランク注射)、または葉面散布42,44の幹が示されています。以前は、柑橘類の木々 と成熟したブドウを ACP と GWSS の両方で AK 遺伝子に対応する特定の昆虫の dsRNA と扱われています。これらの扱われた植物は、時間41,45の様々 な長さまで ACP および GWSS のための死亡率の増加をもたらします。一緒にこれらの結果は、その dsRNA が学ぶ昆虫の特定の遺伝子の表現を妨げることができますを示しています。

成功を黙らせる遺伝子発現に影響を与える課題が dsRNA 核酸分解酵素 (dsRNases) の昆虫および唾液分泌物または47 dsRNA の劣化の可能性があります腸内 pH の腸組織で主に表現のユニークなグループを含める ,,7778。ただし、このような劣化を克服するために全身の RNAi 誘導され効率的に昆虫の dsRNA の高濃度を利用したおよび/またはそのような劣化62,を克服するために、遺伝子特異的 dsRNA の口頭配達のため国会でペグを使用79. 配信および dsRNA の吸収も安定化されてキャリア分子キトサン48のようなナノ粒子80 、Lipofectamine 2000 など Metafectene76, リポソームなどの助けを借りて、ポリエチレン ・ グリコール79、粘土ナノシート81, とカーボン量子ドット50。DsRNA 遺伝子特定 dsRNA を流し込んで寒天、ゲルの部分を使用しての効果的な配信を改善するために進行中の研究は (示されていないデータは補足のビデオ 4を参照)。この方法は、樹脂や食品として巣に寒天培地を注入する dsRNA を運ぶことができるアリへの dsRNA の実効線量の配信に使用可能性があります。

DsRNA の安定性に加えて植物組織における dsRNA の長期的な持続性は農作物のために特に重要です。野菜や果物、植物の維管束組織を通じ dsRNA RNAi メカニズムを誘発する昆虫が摂取されている前に還元酵素活性と木部と師部蓄積されます。必要があります特定の dsRNA のアプリケーション日間持続する期間が短いなど 6 緑豆以上では、土62,82 36 h の環境で核酸の蓄積になる可能性は低いように。ただし、ニーナ実証ナノシートとして早期劣化から大規模な二本を守ることだけ仲介として葉の表面に徐放性の少なくとも 30 日間81の期間にわたって。

全体的に害虫管理のため昆虫の特定の遺伝子を沈黙させる dsRNA 配信の戦略がここで説明を使用できます。樹幹注入やルートの水薬、灌漑水を介して植物に dsRNA の供給は、効率的な制御方法はありません現在利用可能なルートの送り装置などの害虫に対する効果的な戦略かもしれません。DsRNA 粘土や寒天などのメディアを安定化またはキャリアを使用しての配達は、植物によって吸収のための土に直接追加することがあります。RNAi 仲介された分子バイオ農薬の開発の遅い進歩のための主要な原因の一つは、効率的な RNAi と83環境条件下で安定性を開始する効率的な口頭配達技術の不足をしています。ここで説明した方法が、将来的に植物に核酸を介したサイレンシング治療を提供するため使用する経口配信 sap 供給だけでなく、咀嚼昆虫世界の食糧生産の昆虫の損傷を軽減し、持続可能な生態学的な害虫を開発管理。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

作者は感謝して実験のため BMSB と HB を提供し、植民地の維持のドナルド ・ ウェーバーとミーガン ハーリヒ (アルス ベルツヴィル, メリーランド、米国農務省) を認めるマリア ・ T ・ ゴンザレス、サルバドール p. ロペス、(米国農務省、アルス、フォート ピアス、フロリダ) と植民地維持、試料調製及び分析ジャッキー ・ l ・ メッツ (フロリダ大学、フォート ピアス、フロリダ)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMSB (H. halys) insects  USDA
ACP (D. citri) insects  USDA
organic green beans N/A
Citrus plants USDA
sodium hypochlorite solution J.T. Baker
green food coloring  McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers  Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture) Sigma
Primers  IDT DNA
SensiMix SYBR Bioline
qPCR ABI 7500 Applied Biosystems 
Spray bottle N/A
Parafilm American Can Company
TaKaRa Ex Taq Clontech
QIAquick Qiagen

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環境科学、問題 135、配信、クサギカメムシ、ミカンキジラミ、RNA 干渉、摂取、半翅目
篩部と半翅目昆虫の植物 sap 供給の RNA 干渉を誘発する二本鎖 RNA の経口配信方法
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Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B.,More

Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects. J. Vis. Exp. (135), e57390, doi:10.3791/57390 (2018).

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