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Métodos de entrega Double-stranded RNA Oral para induzir a interferência do RNA no floema e insetos Hemipteran planta-sap-alimentação

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57390
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Horticultural Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

Este artigo demonstra novas técnicas desenvolvidas para entrega oral de RNA double-stranded (dsRNA) através dos tecidos vasculares das plantas para o RNA de interferência (RNAi) na seiva do floema alimentação de insetos.

Abstract

Floema e planta seiva alimentação insetos invadem a integridade das culturas e frutas para recuperar nutrientes, no processo de danificar as culturas alimentares. Hemipteran insetos são responsáveis por uma série de pragas economicamente substanciais de plantas que causam danos a culturas alimentando na seiva do floema. O marrom marmorated percevejo (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) e os asiáticos citrinos psilídeos (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) são pragas hemipteran introduzidas na América do Norte, onde eles são uma praga agrícola invasiva da especialidade de alto valor, linha e culturas descontínuas e frutas cítricas, bem como uma praga de incômodo quando eles agregam dentro de casa. Resistência de inseticida em muitas espécies tem levado ao desenvolvimento de métodos alternativos de estratégias de manejo de pragas. Double-stranded do RNA (dsRNA)-mediada de RNA de interferência (RNAi) é um mecanismo para estudos de genômicos funcionais que tem aplicações potenciais como uma ferramenta para o manejo de insetos-praga de silenciamento do gene. DsRNA exogenamente sintetizado ou RNA de interferência pequeno (siRNA) pode desencadear silenciamento de genes altamente eficiente através da degradação do RNA endógeno, que é homólogo ao apresentado. Utilização eficaz e ambiental de RNAi como biopesticidas moleculares para biocontrole de insetos hemipteran exige a entrega na vivo de dsRNAs através da alimentação. Aqui podemos demonstrar métodos para a entrega do dsRNA aos insetos: carregamento do dsRNA em feijão verde por imersão e absorção de dsRNA gene-específico com entrega oral através da ingestão. Descrevemos também plantas não-transgênicas entrega abordagens utilizando pulverizadores foliares, embebe de raiz, injeções de tronco, bem como grânulos de argila, que pode ser essencial para liberação sustentada do dsRNA. Entrega eficiente por dsRNA ingerida por via oral foi confirmada como uma dosagem eficaz para induzir uma redução significativa na expressão de genes alvo, tais como o hormônio juvenil ácido O-Metiltransferase (JHAMT) e vitellogenin (Vg). Estes métodos inovadores representam estratégias para entrega do dsRNA para uso em proteção de cultivos e superar os desafios ambientais para a gestão de pragas.

Introduction

Hemipteran insetos compõem algumas das pragas mais economicamente importantes do agriculturebecause de sua capacidade para atingir o crescimento populacional elevado e espalhar doenças em plantas. O BMSB, H. Hális Stål, é uma praga invasora que foi introduzida acidentalmente no hemisfério ocidental em Allentown, Pensilvânia da Ásia (China, Taiwan, Coreia e Japão) com o primeiro avistamento relatado em 19961. Desde a sua introdução, o BMSB foi detectada em 43 Estados, com as populações mais altas no meio do Atlântico (DE, MD, PA, NJ, VA e WV), bem como no Canadá e Europa e representa uma ameaça potencial para a agricultura2. Como uma praga polífaga, BMSB pode instigar danos para aproximadamente 300 hosts de plantas identificadas, incluindo culturas de alto valor, tais como maçãs, uvas, plantas ornamentais, oleaginosas, soja e milho. Dano é causado principalmente devido ao modo de alimentação conhecido como lacerate e nivelado, onde o animal atravessa a cultura do anfitrião com seu estilete da agulha para obter acesso aos nutrientes do tecidos vasculares2,3. BMSB também é um interior de pragas que podem encontrar residência em áreas vivas, tais como escolas e casas durante o outono até o inverno de2. Produtos químicos e aeroallergens lançadas pela BMSB foram relatadas como ilícita reação alérgica em trabalhadores de colheita de frutas. BMSB também pode contribuir para doença alérgica levando a dermatite de contato, conjuntivite e rinite em indivíduos sensíveis4,5. Outro inseto hemipteran, o ACP, d. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), é uma séria Praga de frutas cítricas e transmite a bactéria limitada no floema (Candidatus Liberibacter asiaticus) causando Huanglongbing (HLB), mais conhecido como cítricas greening doença6,7. HLB foi primeiramente relatada do Sul da China e se espalhou para 40 diferentes asiático, África, Oceania, Sul e norte-americano países7. Cítrica greening é um problema mundial com ameaça de perdas económicas e financeiras devido à perda de citrinos; Portanto, gestão da ACP é considerada de suma importância para prevenir e controlar o HLB.

Medidas para o controle efetivo destas pragas de insetos geralmente requer a aplicação de pesticidas químicos que são relativamente curto viveu. Estratégias de controle químico insecticida muitas vezes faltam de estratégias de gestão ambiental segura ou diminuíram a susceptibilidade devido à resistência de pesticidas em populações de pragas8,9. Portanto, o controle biológico de pragas com biopesticidas moleculares é uma alternativa potencial, mas seu uso permanece globalmente modesto, e várias espécies de parasitoides (por exemplo, Trisolcus japonicus) podem também ser eficazes como biológico natural controles. RNAi é um potencial de tecnologia para o gerenciamento de pragas invasoras com biopesticidas molecular10emergente. RNAi é um mecanismo regulatório de gene bem descrito que facilita o silenciamento de genes posttranscriptional eficaz de endógenos bem como invadir dsRNAs de maneira sequência-específicos, que eventualmente leva a regulação da expressão do gene no mRNA nível11,12. Brevemente, quando dsRNA exógeno é internalizado em uma célula, que ele é processado em siRNAs por um membro da superfamília de RNase III nuclease bidentado, chamado Dicer, que é conservado evolutivamente em moscas, vermes, plantas, fungos e mamíferos13, 14 , 15. estes duplex de siRNA 21-25 nucleotídeos são então desenrolados e integrados no complexo RNA-induced silencioso (RISC) como guia de RNAs. Este complexo RISC-RNA permite o pareamento de Watson-Crick base para o complementar destino mRNA; eventualmente, isto leva a clivagem pela proteína Argonaute, uma proteína de multi domínio que contém um domínio de H-como RNase, que degrada o mRNA correspondente e reduz a tradução da proteína, levando assim ao silenciamento16 do gene posttranscriptional , 17 , 18.

RNAi para gestão de pragas requer a introdução do dsRNA na vivo para silenciar o gene de interesse, ativando assim o percurso de siRNA. Diversos métodos que foram usados para dsRNA entrega aos insetos e células de inseto para induzir RNAi sistêmica incluem alimentação10,19,20,21, microinjeção22, portadores de imersão como lipossomas 23e outras técnicas de24. RNAi foi primeiro demonstrado em elegans de Caenorhabditis para silenciar a expressão de gene unc-22 pelo fogo e Mello25, seguido por nocaute na expressão dos genes em Drosophila melanogaster26crespos. Os estudos funcionais iniciais utilizaram microinjeção para entregar dsRNA em insetos, como Apis mellifera22,27, piolho pisum28, Blattella germanica29, H. Hális30e insetos lepidópteros (revistos por Terenius et al 31). microinjection é vantajosa para entregar uma dose exata e precisa para o site de interesse no inseto. Embora tais puncturas sépticas podem eliciar a expressão de genes relacionados imunes devido a trauma32, portanto, descartando sua praticidade em desenvolvimento agrícola biopesticidas.

Outro método de entrega de dsRNA na vivo é por imersão, que envolve ingestão ou absorção do dsRNA por suspensão de animais ou células geralmente no meio extracelular, contendo dsRNA. Imersão foi usado para induzir eficientemente RNAi em células de cultura de tecidos de drosófila S2 para inibir a jusante-de-Raf1 (DSOR1) o mitogen-ativado proteína quinase quinase (MAPKK)20, assim como em c. elegans para silenciar o pos-1 gene33. No entanto, dsRNA entregado usando imersão é menos eficiente para induzir RNAi comparado a microinjeção20. RNAi mediada silenciar em um inseto mastigação era primeiro mostrado no repele milho (RPT) (Diabrotica virgifera virgifera) infundindo o dsRNA em uma dieta de ágar artificial10. Relatórios anteriores tem resumido métodos para entregar dsRNA infundido em dietas naturais específicas para artrópodes34. Esses métodos de entrega foram ainda mais determinados a ser comparavelmente eficazes meios artificiais de entrega; Como é o caso da mosca tsé-tsé (Glossina morsitans morsitans), onde "knockdown" igual de um gene imune-relacionados foi observado quando dsRNA foi entregue por meio de farinha de sangue ou microinjected35. Da mesma forma, a entrega do dsRNA através de gotículas no apple marrom luz traça (Epiphyas postvittana)36, diamondback moth (Plutella plutella) larvas37, bem como as abelhas de mel38,39 induzida por RNAi eficiente. Experimentos de RNAi mais eficazes em hemipteran têm utilizado a injeção do dsRNA40 porque entrega oral do dsRNA em insetos hemipteran é árdua, já que ele deve ser entregue através de tecidos vasculares da planta hospedeira. RNAi eficaz também foi observada em ACP e Cicadellidae atirador-de-asa-vítreo (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA foi entregue através de citros e as videiras que tinham absorvido os tecidos vasculares através de embebe de raiz, foliar dsRNA pulverizadores, injeções de tronco ou absorção por estacas41,42,,43,44,45,46. Isto também resultou na primeira patente para dsRNA contra o ACP (2016, nos 20170211082 A1). Entrega de siRNA e dsRNA usando as transportadoras como nanopartículas e lipossomas transmite estabilidade, e aumento da eficácia do dsRNA entregues rapidamente está surgindo23,,47,48,49 ,50. Uma nova classe de veículos de entrega baseados em nanopartículas de ácidos nucleicos para in vitro e em vivo que foi resumida especificamente para aplicações terapêuticas podem dar imenso potencial como vectores de entrega adequada51. Nanopartículas como um veículo de entrega para dsRNA podem ter desvantagens incluindo solubilidade, hidrofobicidade ou limitada bioacumulação52, mas uma entrega ajudando polímero apropriado pode compensar estas desvantagens. Desenvolvimento e uso de auto entrega de nucleotídeos emergem também chamados 'oligonucleotides antisentido', que são o único encalhado RNA/DNA duplex46.

Vitelogênese nos Artrópodes é uma chave de processo de controle de reprodução e regulado pelo hormônio juvenil (JH) ou isoinokosterone, que são as chaves indutores da síntese de Vg pela gordura corporal; o Vg é eventualmente ocupado pelo oócito em desenvolvimento através de de endocitose receptor mediado Vg53. VG é um grupo de polipeptídeos sintetizados extraovarially, que é essencial para o desenvolvimento da proteína de gema de ovo grande, vitelina54,55, e portanto, é importante na reprodução e envelhecimento56. VG foi silenciada com êxito em nematoides57 , bem como em abelhas (Apis mellifera) onde RNAi mediada por esgotamento de Vg foi observada em adultos e ovos22. RNAi mediada silenciamento posttranscriptional de Vg foi testado porque pensava que seu esgotamento conduziria a um efeito fenotípico observável como reduzida fertilidade e fecundidade, potencialmente ajudar no controle BMSB. O gene JHAMT que codifica a S-adenosyl-L-metionina (SAM)-dependente JH ácido O-Metiltransferase, catalisa a etapa final da biossíntese JH via58. Neste caminho Farnesil pirofosfato (FPP) sequencialmente é transformado de farnesol, ao ácido farnesoic, seguido por conversão de metil farnesoate JH por JHAMT. Esta via é conservada em insetos e artrópodes especificamente para a metamorfose, um processo que mentalmente é regulamentado por hormônios59,60,61. Em b. mori, expressão do gene JHAMT e a atividade biossintética de JH na Corpora allata sugerem que a supressão transcricional do gene JHAMT é crucial para a rescisão de JH biossíntese58. Portanto, os genes JHAMT e Vg foram selecionados para esgotamento alvo usando RNAi. RNAi também foi testado em árvores de citrinos para controle da ACP e GWSS. Árvores cítricas foram tratadas com dsRNA através de embebe de raiz, da haste da torneira (injeções de tronco), assim como pulverizações foliares com dsRNAs contra inseto específico arginina quinase (AK) transcrições42,44. A aplicação tópica de dsRNA foi detectada na Copa das árvores de citrinos, indicando uma entrega eficiente através dos tecidos vasculares de plantas e resultou em aumento da mortalidade em ACP e GWSS41,42, 45.

No estudo atual, nós identificamos um método de entrega de dieta natural para tratamentos como dsRNA. Esta técnica recentemente desenvolvida foi posteriormente usada para silenciar o JHAMT e o Vg mRNA usando o gene específico dsRNAs em ninfas BMSB como demonstrado anteriormente62. Estes novos protocolos de entrega demonstrados aqui substituem sistemas convencionais da entrega do RNA que usar sprays tópicos ou microinjeções. Legumes e frutas, haste da torneira, encharcando o solo e absorventes de argila em podem ser utilizados para entrega de dsRNA, que é fundamental para o desenvolvimento contínuo de Biopesticida gestão de pragas e patógenos.

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Protocol

1. BMSB criação

  1. Traseira BMSB insetos como por prática de laboratório padrão e descrito anteriormente63.
  2. Levante os insetos ACP (d. citri) em Citrus macrophylla em uma estufa (22 ° C) e a luz natural. Uso adulto ACP, em aproximadamente 5-7 dias pós eclosão.

2. seleção de Gene regiões e síntese In Vitro de dsRNA

  1. Selecione os genes específicos para BMSB publicados anteriormente transcriptome perfis32.
  2. Certifique-se de regiões de interesse selecionados variam entre 200 a 500 pares de bases.
  3. Realize a reação em cadeia da polimerase (PCR) usando as condições descritas abaixo para gerar fragmentos associados com o gene selecionado de interesse do DNA genômico. Consulte a tabela 1 para os oligonucleotides gene-específico.
    1. Reação de PCR: em um tubo PCR de 0,25 mL, combinar 5 µ l de 10x Buffer PCR, 4 µ l de dNTP mistura (2,5 mM cada), 2 µ l do molde de ADN (50 ng / µ l), 2,5 μL de cada de Primers 1 e 2 (10 µM), 0,25 µ l de DNA polimerase (5 U / µ l) , e DNase/RNase livre até 50 µ l de água.
    2. Condição PCR: ciclo da reação de PCR para amplificar a região de interesse a 95 ° C por 3 min, seguido de 30 ciclos de 98 ° C por 10 s, 55 ° C por 30 s, 72° C por 1 min. Incubar a reação a 72 ° C para um adicional 10 min. Purify a reação de PCR usando um kit de purificação.
  4. Amplificar os fragmentos obtidos de PCR ainda mais com primers específicos de gene ladeados com a sequência de promotor T7 RNA polimerase (5'-GAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA-3') como mencionado anteriormente,62.
  5. Use o gene LacZ como um controle negativo (simulação) para RNAi.
    Nota: LacZ é um gene que codifica a β-galactosidase amplificada do DNA genômico de Escherichiacoli (os primers utilizados são listados na tabela 1).
  6. Execute em vitro transcrição para render dsRNA como descrito anteriormente62.
  7. Dissolver e resuspenda o dsRNA resultante em 150 µ l DNase/RNase livre água, medir a concentração e armazenar a-80 ° C para uso futuro.

3. entrega do dsRNA usando verde feijão

  1. Selecione cedo 4th ínstar BMSB ninfas nascidas da mesma massa de ovo e privá-los durante 24 h antes da alimentação dsRNA.
  2. Selecione Delgado certificada orgânica verde feijão (Phaseolus vulgaris L.) e lavar com solução de hipoclorito de sódio 0,2% por 5 min.
    Nota: Delgado feijão verde foram selecionado para que os grãos facilmente podem ser acomodados em tubos de microcentrifuga de 2 mL.
  3. Lavar 3 vezes com O ddH2e deixar secar ao ar.
  4. Corte o feijão verde, desde o final do cálice para um comprimento total de 7,5 cm, usando uma lâmina de barbear limpa.
  5. Mergulhe os grãos verdes lavados e cortados em um tubo de 2 mL de tampão-menos microcentrifuga contendo 300 µ l de solução de controle (um 01:10 diluição de corante alimentar verde (ingredientes: água, propileno glicol, Fd & C amarelo 5, Fd & C Blue 1 e propilparabeno como conservante)).
  6. Faça diluições do em vitro sintetizaram dsRNAs LacZ, JHAMT ou Vg por diluição µ g 5 ou 20 µ g/ml 300 µ l de água livre de RNase/DNase para produzir concentrações finais de 0,017 µ g / µ l ou 0,067 µ g / µ l, respectivamente.
  7. Mergulhe os grãos verdes lavados e cortados em um tubo de microcentrifugadora cap-menos 2 mL contendo 300 µ l de solução de dsRNA (da etapa 3.6).
  8. Embrulhe e selar as bordas dos tubos microcentrifuga encerram o feijão imerso para evitar a evaporação da solução dsRNA e para impedir que os animais entre o tubo de microcentrifugadora.
  9. Coloque estes tubos de forma vertical em temperatura ambiente por 3 h permitir que a solução do dsRNA ser carregado durante todo o feijão verde por ação capilar.
  10. Coloque estes tubos na cultura limpa os vasos (polipropileno). Lugar três fome 4th ínstar ninfas BMSB nos vasos cultura.
  11. Trate a três animais por navio de cultura cada um contendo três feijões verdes com solução de coloração ou dsRNA alimento verde. Manter os insetos em 25 ° C e 72% umidade relativa, sob um fotoperíodo de 16 L: 8 em uma incubadora.
  12. Permitir que os insetos para se alimentar de feijão verde (imerso e absorvido com dsRNA) por 5 dias mas reabastecer com dietas frescas dos grânulos de tratamento verde dsRNA após 3 dias.

4. em tempo real quantitativa (qPCR) análise de expressão seguinte RNAi mediada silenciamento em BMSB

  1. Medir o efeito de RNAi sobre os níveis de expressão de transcrição por qPCR.
  2. Isolar o RNA total de animais Tratado de dsRNA e sintetizar o cDNA62.
  3. Configure as reações de qPCR usando um sistema PCR em tempo real e os primers listados na tabela 1. Use a seguinte condição de ciclismo qPCR: 95 ° C por 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 60 ° C por 1 min, juntamente com a etapa de dissociação, incluindo 95 ° C por 15 s, 60 ° C por 1 min, 95 ° C por 15 s e 60 ° C durante 15 s.
  4. Determinar os padrões de qPCR: usar a diluição serial do cDNA preparado a partir de isolados de um animal normal como um padrão de referência para a quantificação de RNA total.
  5. Use BMSB 18s RNA como padrão interno para corrigir as diferenças na recuperação de RNA de tecidos32.

5. aplicação de Spray foliar em grandes árvores cítricas em vasos e mudas

Nota: As plantas da cultivar cítrico citrange 'Carrizo' (Citrus sinensis XPoncirus trifoliata, Rutaceae), foram mantidas em estufa sob luz natural e temperatura, cultivadas em recipientes de 1,2 L. As plantas foram podadas constantemente para promover o crescimento de novos brotos foliares, chamado 'flush'. ACP prefere alimentação e oviposição no novo crescimento do citrino64.

  1. Selecione as plantas ou mudas e não molhá-los durante 2-3 dias antes de usar para deixar o solo secar a umidade, mas não completamente seco.
  2. Usando um frasco de spray de bomba de mão aplicar um 200 mL de solução de dsRNA (0,5 mg/mL) para o dossel inferior (Figura 4A).
    Nota: Preparar o acima mencionado dsRNA soluções em água livre de RNase/DNase.
  3. Pós-spray de aplicação, permitem que a solução aplicada dsRNA ser completamente absorvido pelas folhas.
    Nota: Citros absorveram o dsRNA aplicado, e depois folhas de qualquer novo crescimento ou de ramos que foram cobertos antes da aplicação, foram extraídos; o dsRNA foi detectável usando qPCR e mostrou o movimento sistêmico nas folhas árvore dossel superior em 3-4 h44,,45,46.
  4. Experimente o novo crescimento das árvores previamente cobertos depois 25-40 dias coletando aproximadamente 10 folhas das pontas dos quatro ramos. Extraia o RNA total e analisá-lo por transcrição reversa PCR (RT-PCR) e qPCR para a presença do gatilho dsRNA aplicada usando as primeiras demão listados na tabela 1 e descrito anteriormente métodos46.
    Nota: A coleta de amostra, total isolamento de RNA, RT-PCR e qPCR foram realizados como descrito anteriormente,46.
  5. Da mesma forma, topicamente pulverizador 10ml dsRNA à região mais baixa de uma plântula ou folhagem de pequena árvore em vaso.
    Nota: Hemipteran insetos (ACP e GWSS) foram dadas acesso alimentação normalmente em 24h, pós tratamentos no crescimento novo (folhas) que não tinha sido pulverizado diretamente, ou que cresceu semanas mais tarde, ou plantas inteiras. Isto produziu insetos que testado positivo para o dsRNA em 3, 6 e 10 dias, pós alimentação.

6. solo/raiz Drench aplicação em grandes ou pequenas em vaso mudas e árvores de citrinos

  1. Selecione as plantas ou mudas e não molhá-los durante 2-3 dias antes de usar para deixar o solo seque a úmido mas não completamente seco (isso cria espaço de ar para manter a solução líquida a ser aplicada).
  2. Adicionar 1 L da solução de dsRNA (0,2 mg/mL) para o solo de plantas em vasos grandes (cerca de 2,5 m) e adicionar 1 litro de água (caçador) depois de 1 h.
  3. Aplicam-se as árvores de 100 mL de solução de dsRNA (1,33 mg/mL) para o solo de 1 m de altura em vaso em solos parcialmente secos.
  4. Para pequenas mudas, aplica 10 mL da solução de dsRNA (1 mg/mL) para o solo nos cones ou as próprias raízes (Figura 4B, C).
  5. Permitir que as plantas que recebem a solução de dsRNA aplicada como um embebe de solo de molho por 30 min. Em seguida aplica o único tratamento de água para ajudar a absorção pelas raízes (20 mL para plantas em recipientes amarelos), ou 100 mL se vasos para plantas maiores são > 1 galão.
    Nota: DsRNA aplicado topicamente a folhagem resultou na deteção pelo mais distais dicas de ramos dentro de tratamentos de post de 3-6 h, mostrando a circulação sistêmica através de árvores. Novos ramos de crescimento testaram positivo para dsRNA em 60-90 dias pós tratamentos. Estacas são fornecidas aos insetos (ACP e GWSS) em um dsRNA alimentação bioensaio44.

7. haste torneira (injeção de tronco de árvore) aplicação em grandes árvores cítricas em vasos e mudas

  1. Selecione mudas cítricas, novo, ou aproximadamente 3,5 anos velhas plantas para injetar dsRNA usando a haste torneira método (injeções de tronco).
  2. Fure as plantas cítricas, usando uma furadeira e uma broca de 10 mm, tomando cuidado para não ultrapassar 2 cm, ou cerca de metade do diâmetro da haste.
  3. Enrole a ponta de cobre de cada injector 4 - 6 vezes com uma larga faixa de 0,6 cm (¼ de polegada) de selagem de filme para impedir o escapamento perto da ponta.
  4. Encha os injectores de tronco de árvore com 6 mL (1,7 mg/mL) do dsRNA solução diluída em água livre de DNase/RNase (denotada aqui como solução colorida).
  5. Injetar a solução no tronco da árvore e deixe o injector na mala para 6-10 h permitir a absorção da solução dsRNA. Permitir que os insetos se alimentam os cortes de árvores tratadas em 3, 10 e 30 dias pós tratamento.
    Nota: O dsRNA injetado usando o método de injeção de tronco persistiu nas árvores, por um período de 30-60 dias41,42,44. Validação para RNAi foi realizada por qPCR usando as primeiras demão listadas na tabela 1.

8. dsRNA grânulos de argila Tratado para a entrega de insetos através de solo

  1. Deite fora a argila absorvente em um tubo cónico de 50 mL até a marca de 35 mL (aproximadamente 30 g de argila absorvente) no tubo.
  2. Despeje o tubo para molhar todo o absorvente, 20 mL de solução de dsRNA diluída em água livre de DNase/RNase (100 µ g/mL). Tampar o tubo cônico, ponta do tubo para ajudar a remover o ar e o tubo do tampão.
  3. Colocar o tubo na posição vertical e deixe ficar por 1-2 min para as partículas de argila absorver a solução.
  4. Adicione suficiente encharcada de dsRNA argila na mistura solo para encher um pote de 1 galão.
  5. Misturar e preparar o solo com a mão para homogeneizar completamente encharcada de dsRNA argila no solo.
  6. Use este solo para replantar mudas selecionadas para o tratamento de dsRNA.
  7. Água do solo com 200 mL de água pura sem dsRNA. Depois de 30 min a 1 h, siga com 100 mL de água pura. Após 24h, colocar a planta em uma programação de rega normal.
  8. Teste 4-6 folhas de vasos de plantas tratadas com absorventes de argila e dsRNA tratamento de post cada mês para dsRNA, recolhendo as folhas apicais mais novo do crescimento das plantas.
    Nota: Plantas ou mudas destas plantas tratadas são alimentadas com insetos após 24h pós tratamento e ter sido capaz de entrega RNAi para até um ano de insetos (dados não publicados).

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Representative Results

Entrega de vegetais dsRNA mediada através da alimentação em BMSB 4th ínstar ninfas foi testada para o desenvolvimento de biopesticidas moleculares usando RNAi para pragas invasoras. BMSBs alimentação usando seus estiletes de agulha através de um mecanismo conhecido como dilacerar e flush, que provoca danos consideráveis para as culturas. Delgados feijão verde orgânico, p. vulgaris L., foram usado para testar se a nutrientes ou dsRNA pôde ser entregue na vivo a BMSB através de alimentação3. Segmentos de feijão verde foram imersas em água livre de DNase/RNase ou uma solução de água e corante verde para testar uma entrega em BMSB (figura 1A). A coloração de alimento verde foi usada como uma indicação visual para imitar o dsRNA. O tecido vascular de feijões verdes foram saturadas com colorante verde devido ao fluxo da solução colorida verde através do floema por ação capilar62. Viam-se ninfas BMSB alimentando-se de segmentos de feijão verde, inserindo seus estiletes nos tecidos vasculares do feijão verde (figura 1B). Gotículas de excrementos de cor verde foram observadas após dias 2 e 3 em insetos que foram alimentados com grãos saturados com alimento verde coloração indicando o material entregue tinha sido ingerido oralmente e passado através do intestino antes de excreção (Figura 1, D ).

Posteriormente, nós testamos se depleção significativa de expressão do gene alvo foi realizada utilizando a entrega de feijão verde mediada de BMSB específico dsRNA por ingestão em BMSB. Feijão verde segmentos foram imersas e absorveram com uma solução de 0,067 µ g / µ l (20 µ g/ml 300 µ l de água livre de DNase/RNase) ou 0,017 µ g / µ l (5 µ g/ml 300 µ l de água livre de DNase/RNase) do dsRNA em vitro sintetizadas específico para BMSB JHAMT e Vg , respectivamente. Feijão verde também foram imersas na água sozinha, 0,067 µ g / µ l ou 0,017 µ g / µ l LacZ dsRNA (Mock) como respectivos controles. Níveis de transcrição foram avaliados usando qPCR indicando essa expressão de JHAMT e Vg mRNA foi significativamente reduzida na vivo por quase 4,5 - e 2.2-fold, respectivamente (Figura 2A, B). Consequentemente, os resultados indicam que dsRNA pode ser entregues através dos tecidos vasculares de feijão verde para induzir RNAi bem sucedida.

Outra praga hemipteran, o bug de arlequim (HB) (Murgantia histrionica), que causa danos ao cole as culturas foram também testadas se entrega bem sucedida de nutrientes ou tratamentos dsRNA pôde ser entregue usando o vegetal mediada por entrega. As 4th ínstar ninfas de HB foram autorizadas a se alimentam de couve de bebê (Brassica oleracea var. viridis) imerso em água ou uma solução de água com corante alimentar verde. Resultados indicaram que a HB alimentados e ingeriu a coloração de alimento verde, que era aparente de suas excreções de cores verdes, em comparação com HB que ingeriu os vegetais imergidos em água, que tinha claras excreções (Figura 3).

Técnicas adicionais para a entrega de transiente de dsRNA de pulverização ou imersão resultados na captação de dsRNA em todos os tecidos de planta65,66raiz/solo. Produtos à base de RNAi pulverizáveis estão em desenvolvimento e podem estar disponíveis em breve na pendência da aprovação. Entrega do dsRNA nos campos usando sprays ou raiz embebe pode ajudar na gestão de insetos invasiva42,67. Mudas e árvores de citrinos de tamanho foram expostas para o dsRNA por pulverização foliar, ou pelo solo ou de raiz nua, encharcando, respectivamente (Figura 4). Resultados indicaram que dsRNAs entregues ou esguichos ou solo/bare embebe de raiz pode ser detectado em plantas cítricas (2,5 m de altura) para 7 semanas post uma única exposição de 2 g de dsRNA42. Entrega e ingestão de psilídeos dsRNA-AK (20 ng / µ l) aumentaram da mortalidade de psilídeos por 30-45% (Figura 4)42.

Em vitro transcrito dsRNA pode eficientemente ser entregues aos insetos polífagos, utilizando a haste da torneira (injeções de tronco) do gene específico dsRNA diretamente nos tecidos vasculares da planta, que pode ser adquirido pelos insetos quando predando tais plantas44 (Figura 5). Para árvores de citrinos que foram expostas para o dsRNA por injeções de tronco, o dsRNA poderia ser detectado em plantas cítricas envelhecidas (aproximadamente 1 m de altura) para 7 semanas postar uma única exposição usando 6 mL de 1,7 mg/mL de dsRNA em uma solução de DNase/RNase água livre (Figura 5A B). Floema-alimentação hemipteran insetos então permitiu que alimentam estas plantas hospedeiras tratadas com dsRNA. Presume-se que o dsRNA com êxito foi infundido e movido através do sistema vascular das plantas cítricas para ingestão por ACP, que demonstrou a mortalidade quando alimentados com dsRNA-AK42.

Bioensaios desenvolvido a partir de 2008 a 2012, foram selecionados através de uma grande variedade de plantas em vasos e mostrados para fornecer dsRNA entrega em uma maneira pela qual as plantas podem absorver e translocar o dsRNA para dsRNA sistêmica divulgação41,42 . Um método utiliza um componente absorvente de argila com dsRNA adsorção na matriz de argila; Isso inclui uma grande variedade de argilas, Fuller da terra, Zeolite e outros, como bem como outros materiais absorventes, celulose, ágares, bioplásticos, etc Clay partículas são portadores de ácido nucleico livre de poeira que podem ser utilizados para a entrega de ingredientes ativos como dsRNA para solos para absorção da planta e, finalmente, entrega aos insetos (Figura 6). A complexo de argila também pode ser configurada quimicamente para liberar o dsRNA sob pH específico ou condições iônicas. Métodos de entrega de argila do dsRNA em plantas foram mostrados para fornecer dsRNA em árvores de citrinos em vaso e outras plantas há mais de 14 meses (dados não mostrados). Este sistema de entrega pode ser usado para alterar os traços de planta, como cores da flor, altura de planta (nanismo) ou outros. Atualmente, o principal uso desse método é para o desenvolvimento de uma eficaz de insetos pragas e controle de patógenos (vírus) ou de gestão. A abordagem pode ser rentável para berçários e proprietário e é um método não-transgênicos.

Figure 1
Figura 1 . Entrega de nutrientes ou dsRNA através de feijões verdes. (A) segmentos de delgados feijão verde orgânico foram imersas e absorveu a solução em um tubo de microcentrifugadora de 2 mL contendo 300 µ l de DDQ2O sozinho ou ddH2O com corante verde, para 3h. Três 4th ínstar ninfas BMSB foram passaram fome durante 24 h e colocadas em recipientes de cultura junto com 3 feijões verdes por navio. (B) BMSB se alimentam de segmentos de feijão verde, imergida em água por perfuração através do feijão verde para alcançar os nutrientes com seus estiletes. (C) dia 2 do BMSB alimentação bioensaio, setas denotam excreções. (D) dia 3; Excreções BMSB aumentada (indicadas pela seta) observaram verde e post a ingestão de uma solução de DDQ2O corante através de feijão verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Análise de RT-PCR quantitativo para medir o nível de transcrição após mediada por RNAi depleção de JHAMT e Vg em BMSB. RNA total das 3 individuais BMSB 4th ínstar ninfas alimentados com JHAMT (A) 20 µ g (0,067 µ g / µ l), e dsRNAs de 5 µ g (0,017 µ g / µ l) Vg (B) em 300 µ l de DDQ2O entregues através de segmentos de feijão verde, foi isolado e o níveis de transcrição foram medidos por qPCR. LacZ dsRNA (Mock) servido como um controle negativo. BMSB 18s RNA foi usado como um padrão interno para corrigir diferenças na recuperação de RNA de tecidos. Resultados relatados são de três réplicas biológicas, e barras de erro indicam SEM. Realizou-se um sentido único de análise de variância (ANOVA) para testar a significância estatística dos dados, p < 0,0001. Resultados reproduzidos de Ghosh et al 62 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Entrega oral de tratamento em arlequim bug (M. histrionica ) usando couve bebê. Couve de bebé orgânico foram lavados com hipoclorito de sódio 0,2%, aparadas e imerso em um tubo de microcentrifugadora cap-menos de 2 mL contendo 300 µ l de solução de (A) DNase/RNase livre ddH2O, ou (B) DNase/RNase livre ddH2 Solução O com coloração de alimento verde, por um período de 3h. Três ninfas de HB 4º ínstar foram passaram fome durante 24 h colocadas em vasos de cultura e permitiu que alimentam esses couve durante 3 dias. Setas brancas indicam excreções observadas na alimentação de post do dia 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Raiz e pulverização foliar banhar aplicação em árvores de citrinos e mudas. As plantas seleccionadas ou mudas prévias para usar não são regadas por 2-3 dias para deixar o solo secar a umidade, mas não completamente seco. (A) as árvores foram primeiro cobertas e 200 mL de solução de dsRNA (0,5 mg/mL) em DNase/RNase livre água foi aplicada, à mão, frasco do pulverizador de bomba para o dossel inferior. Solução (B), 100 mL de dsRNA (1 mg/mL) em água livre de RNase/DNase foi aplicada ao solo de mudas em solos parcialmente secos. (C) 100 mL de solução de dsRNA (1 mg/mL) em água livre foi aplicada às próprias raízes de mudas por aproximadamente 3 h. (D) DNase/RNase ACP, alimentando-se de mudas que tinham absorvido dsRNA pelas próprias raízes, mostrou aumento de mortalidade de ACP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 . Citrino injeção de tronco de árvore Seedling. Mudas cítricas aproximadamente 1 m de altura foram injetadas com 1,7 mg/mL de dsRNA. (A) broca buracos em mudas cítricas usando uma broca de diâmetro de 10 mm para inserir o injector o caule da planta. A ponta de cobre exposta de cada injector foi envolvida com uma larga faixa de 0,6 cm (¼ de polegada) de selagem de filme para evitar fugas. (B) injectores preenchidos com 6 mL de solução colorida foram aplicados para o caule (tronco) de mudas. Injetores foram deixados no local por cerca de 6-10 h para a completa absorção da solução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 . Entrega de alteração de solo de argila do dsRNA em plantas através do solo. Uma nova linha de entrega de material: argila que é um portador de ácido nucleico livre de poeira para uso no fornecimento de ingredientes ativos tais como dsRNA para solos para captação em plantas e, finalmente, em insetos. Argila Unbaked (A) e (B) cozido argila retratando tolerância/retenção de água. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Genes-alvo potenciais H. Hális
Adesão Tamanho Nome do gene/homologia
XP_014293026.1 491 Vitellogenin-A1-como (Vg) (Possíveis isoformas: vitellogenin-2-como isoform X1 XP_014291483.1; vitellogenin-2-como isoform X2 XP_014291484.1).
XP_014290953.1 545 Hormônio juvenil ácido O-Metiltransferase-como (JHAMT) (Possível homólogo: hormônio juvenil ácido O-Metiltransferase, XP_014283772.1).
Primeiras demão
PCR
Nome do gene/homologia Nome da primeira demão Sequência de
VG BMSB Vitellog P2 F CAATTTGATCCACCGACTGTT
VG BMSB Vitellog P2 R CCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH P1 F GGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH P1 R GTATAGGATTGCCATTTTGG
T7 PCR
VG T7 BMSB Vitellog P2 4263 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCAAAGTTGGAAGGGAATGA
VG T7 BMSB Vitellog P2 4753 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH T7 P1 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH T7 P1 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATAGGATTGCCATTTTGG
LacZ T7 LacZ RNAi F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGAAAGCTGGCTACAGGA
LacZ T7 LacZ RNAi R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGGCTTCTGCTTCAAT
AK dsAK-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
AK dsAK 50-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK 50-R TAATACGACTCACTATAGGGAGTGAAGCCCTTGTGGTAGTC
AK dsAK 30-F TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGGACTCTGGAGTAGG
AK dsAK 30-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
GFP dsGFP-F TAATACGACTCACTATAGGGAGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTT
GFP dsGFP-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGTAATGGTTGTCTGGTAAAAGGA
qPCR
VG Vitellog RT P2 F TTGATAGTTGTTTGGATTTTGAAGGT
VG Vitellog RT P2 R TCTTACTTGATCAGCGCTCAGAA
JHAMT BMSB JH RT P1 F AGGAAAACCCAAAATGGCAAT
JHAMT BMSB JH RT P1 R ATGTATTCTTCTTTTGGATCTTTTCTTGAG
18S F3 BMSB 18S ATGCCCCCGCCTGTCCTTATT
18S BMSB 18S R3 TGAAAGCAGCCTGAATAGTGG
GFP GFP-F GGTAAAAGGACAGGGCCATC
GFP GFP-R TCAAGGAGGACGGAAACATC
AK AK quant-F CGGACTTGAGGGAGAACTGA
AK AK quant-R GTGGTAGATACCGCGACCAG
uma banheira a banheira-F GCGTCTCTTCGGTTTGACGG
uma banheira um-Cuba-R CACTTCACCATCTGGTTGGC

Tabela 1. Sequências do oligonucleotide para RNAi. Listados são os genes e oligonucleotides usados para gerar o PCR fragmentos, dsRNA, qPCR primers e analisar os níveis de transcrição.

Complementar Video 1: ágares e géis como absorventes para entrega e liberação sustentada do dsRNA. Hidratado ágares sintéticas ou naturais e géis com dsRNA solução que pode ser usado como isca ou dietas para vários artrópodes. Por favor clique aqui para baixar este vídeo

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Discussion

RNAi tem provado para ser uma importante ferramenta para explorar a função biológica do gene e o regulamento, com grande potencial para ser utilizado para a gestão de pragas19,68,69,70, 71. o projeto e a seleção de um genes apropriados para silenciar em uma determinada espécie de inseto e o método de entrega de dsRNA(s) o correspondente para o inseto são de extrema importância. O método ideal para a entrega do dsRNA em um inseto deve ser determinado empiricamente, juntamente com a seleção da dose relativa para a entrega, como certos métodos podem oferecer vantagens e outras limitações. Para o desenvolvimento de um biopesticida molecular que, finalmente, pode ser adequado para a liberação ambiental, um método de entrega viável, eficiente e vantajoso é necessário. Por exemplo, dsRNA aplicação tópica mostrou ser eficaz para dsRNA entrega para controle de insetos, citrinos e videiras42,44. Estratégias inovadoras, tais como uso de iscas, soluções de sacarose, fermento ou produção bacteriana dsRNA por ingestão direta, aplicação tópica de dsRNA em plantas, ou produção de dsRNAs específico por plantas transgênicas modificadas, têm avançado o desenvolvimento de eficaz de controles baseados em RNAi19,,72.

Um bom exemplo é demonstrado aqui com o uso de feijão verde para entregar dsRNA (Figura 1 e Figura 2) projetado especificamente impacto e reduzir uma praga de insetos de importância global. O recém-desenvolvido vegetal mediada dsRNA entrega protocolo usando segmentos de feijão verde imerso e saturado com dsRNA serviu para efetivamente genes-alvo específicos para o desenvolvimento larval em BMSB. Feijões verdes são um dos muitos vegetais que são devorados por BMSB e então estas foram usadas como um meio para entregar dsRNA. Outros meios de entrega dsRNA foram testados (dados não mostrados), mas não tiveram sucesso no fornecimento de nutrientes para o BMSB, possivelmente devido a diferenças na textura vascular. Portanto, usamos a segmentos de feijão verde para entregar as ninfas BMSB em vitro sintetizado dsRNA. Os ácidos nucleicos entregados através de uma planta ou vegetal técnica mediada pode ser potencialmente capazes de induzir RNAi de inseto de escolha como observado aqui com depleção de genes JHAMT e Vg em BMSB (Figura 2)62.

Este protocolo de entrega de vegetais dsRNA mediada tem sido usado com sucesso para induzir RNAi não somente em BMSB, mas também em HB usando couve (Figura 3), embora estratégias de entrega e métodos devem ser otimizados para cada gene e inseto. Portanto, recomenda-se que vários métodos ser testado para a entrega, bem como alvo de múltiplos genes de interesse individualmente ou por empilhamento dsRNAs pelo menos dois a fim de obter melhor fenotípica penetrância. Vários métodos têm sido resumidos para dsRNA entrega aos insetos e insetos células incluindo alimentação13,22,73,,74, microinjeção75e outras técnicas de imersão76 utilizados para captação de dsRNA para induzir RNAi sistêmica. Métodos mais recentes para entrega oral do dsRNA para induzir RNAi em outros insetos por ingestão de plantas não-transgênicas tratadas também foram exploradas (Figura 4, Figura 5e Figura 6). Árvores cítricas foram demonstradas para absorver dsRNAs através de raízes, da haste da torneira (injeções de tronco), ou pulverizações foliares42,44. Anteriormente, árvores de citrinos e videiras maduras foram tratadas com inseto dsRNA específico correspondente ao gene de AK em ACP e GWSS. Estas plantas tratadas causaram um aumento na mortalidade para o ACP e GWSS para até vários comprimentos de tempo41,45. Juntos esses resultados demonstram que dsRNA pode impedir a expressão de genes específicos nos insetos estudados.

Desafios que afetam o sucesso de silenciamento da expressão do gene incluem grupos exclusivos de dsRNA nucleases (dsRNases), expressados principalmente no tecido do intestino de insetos e secreções salivares ou o pH do intestino que, pode ser responsável pela degradação do dsRNA47 ,77,78. No entanto, para superar tal degradação, RNAi sistêmica pode ser induzida com eficiência em insetos por utilizando concentrações mais altas de dsRNA e/ou usando PEG na dieta para entrega oral do dsRNA gene-específico para superar tal degradação62, 79. entrega e aceitação do dsRNA podem também ser estabilizados com a ajuda de moléculas do portador, tais como nanopartículas80 como quitosana48, lipossomas como Lipofectamine 2000 e Metafectene76, polietileno glicol,79, argila nanosheets81e carbono quântica ponto50. Pesquisa está em andamento para melhorar a entrega eficaz de dsRNA usando pedaços de ágar e gel infundidos com gene específico dsRNA (dados não mostrados, consulte Supplemental Video 4). Essa técnica pode ser usada para a entrega de uma dose efectiva de dsRNA para formigas que possa levar o dsRNA infundido resina ou ágar para o ninho como alimento.

Além de estabilidade do dsRNA, persistência a longo prazo do dsRNA em tecidos vegetais é de importância, especialmente para as culturas agrícolas. dsRNA distribuído através de tecidos vasculares de plantas, frutos ou vegetais pode se acumular no xilema e floema com atividade enzimática reduzida antes de ser ingerida pelos insetos para induzir o mecanismo de RNAi. Pode ser necessário para determinados aplicativos ter dsRNA persistirem por um curto período, tais como por 6 dias no feijão verde, ou mais, por 36 h no solo62,82 assim o acúmulo de ácidos nucleicos no ambiente torna-se improvável. No entanto, Neena et al. demonstraram que a nanosheets poderia proteger dsRNAs grande da degradação prematura como bem como mediato sua liberação sustentada em superfícies de folhas durante um período de pelo menos 30 dias81.

Em geral as estratégias de entrega de dsRNA discutidas aqui poderiam ser usadas para silenciar o insetos genes específicos para a gestão de pragas. Fornecimento de dsRNA às plantas através da água de irrigação, embebe de raiz ou injeção de tronco pode ser uma estratégia eficaz para insetos pragas, tais como alimentadores de raiz, para que nenhum método de controle eficiente está atualmente disponível. Entrega do dsRNA usando uma transportadora ou estabilização médio como argila ou ágar pode ser adicionada diretamente ao solo para a absorção pelas plantas. Uma das principais causas para a lentidão dos progressos no desenvolvimento de RNAi mediada biopesticidas moleculares tem sido a falta de técnicas de entrega oral eficiente para iniciar RNAi eficiente e estabilidade sob condições ambientais83. A entrega oral métodos indicados aqui no futuro podem ser utilizados para entregar ácido nucleico mediada por gene silenciar tratamentos para plantar sap alimentação, bem como mastigar insetos para reduzir o dano do inseto na produção alimentar global e desenvolvimento sustentável ecológico de pragas gestão.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores reconhecem com gratidão Donald Weber e Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) para fornecer BMSB e HB para experimentação e manter as colônias; e Maria T. Gonzalez, Salvador P. Lopez, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) e Jackie L. Metz (Universidade da Flórida, Fort Pierce, FL) para manutenção da colônia, preparação de amostras e análises.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMSB (H. halys) insects  USDA
ACP (D. citri) insects  USDA
organic green beans N/A
Citrus plants USDA
sodium hypochlorite solution J.T. Baker
green food coloring  McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers  Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture) Sigma
Primers  IDT DNA
SensiMix SYBR Bioline
qPCR ABI 7500 Applied Biosystems 
Spray bottle N/A
Parafilm American Can Company
TaKaRa Ex Taq Clontech
QIAquick Qiagen

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Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects. J. Vis. Exp. (135), e57390, doi:10.3791/57390 (2018).

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