Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Методы доставки двуцепочечной РНК Оральный побудить РНК-интерференции в флоэма и членистохоботные насекомых, растений sap питание

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57390
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Horticultural Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

Эта статья демонстрирует новые методы, разработанные для перорального двуцепочечной РНК (dsRNA) через сосудистых тканей растений для РНК-интерференции (RNAi) в sap флоэма кормления насекомых.

Abstract

Флоэма и завод sap кормления насекомых вторгнуться целостность культур и фруктов, чтобы получить питательные вещества, в процессе повреждение продовольственных культур. Членистохоботные насекомые счета для целого ряда экономически существенные вредителей растений, которые причиняют ущерб урожаю кормления на флоэма sap. Коричневый marmorated вонь ошибок (BMSB), Halyomorpha щитомордник (клопы: Pentatomidae) и азиатской цитрусовых psyllid (ACP), Diaphorina citri Кувейама (полужесткокрылые: Liviidae), членистохоботные насекомых-вредителей в Северной Америке, где они являются инвазивные сельскохозяйственных вредителей дорогостоящих специальности, строки и основных сельскохозяйственных культур и цитрусовых, а также вредитель неприятности, когда они вычисляются в помещении. Резистентность к инсектицидам многих видов привела к разработке альтернативных методов стратегий управления вредителей. Двуцепочечной РНК (dsRNA)-опосредованной РНК-интерференции (RNAi) является геном глушителей механизм для функциональных геномных исследований, который имеет потенциал применения как инструмент для управления насекомых-вредителей. Экзогенно синтезированных РНК или малые интерферирующие РНК (siRNA) может вызвать сайленсинга генов высокоэффективных через деградации эндогенного РНК, которая гомологичных для представления. Эффективное и экологические использования РНК-интерференции как молекулярные биопестицидов для биоконтроля членистохоботные насекомых требует в vivo доставка двуцепочечных РНК путем кормления. Здесь мы продемонстрировать методы для доставки dsRNA насекомых: Загрузка двуцепочечной ДНК в зеленых бобов путем погружения и поглощать двуцепочечной ДНК ген специфического с устные доставки через проглатывание. Мы также определили не трансгенных растений доставки подходы с использованием внекорневая спреи, корень обливать, ствол инъекции, а также глиняных гранул, все из которых могут иметь важное значение для стабильного выпуска двуцепочечной ДНК. Оперативная доставка, устно попадает двуцепочечной был подтвержден как эффективной дозы побудить значительное снижение экспрессии целевых генов, например несовершеннолетних гормонов кислоты O-метилтрансфераза (JHAMT) и вителлогенина (Vg). Эти инновационные методы представляют собой стратегии для доставки двуцепочечной ДНК для защиты урожая и преодоления экологических проблем для борьбы с вредителями.

Introduction

Членистохоботные насекомые составляют некоторые из наиболее экономически значимых вредителей agriculturebecause их способности для достижения повышенных населения роста и распространения заболеваний растений. BMSB, Stål H. щитомордник , является инвазивным Пешт, который был случайно введен в Западном полушарии в Аллентаун, Пенсильвания из Азии (Китай, Тайвань, Корея и Япония) с первой прицельной, сообщили в 1996 году1. С момента своего появления BMSB была обнаружена в 43 государствах, с высоким населения в Срединно-Атлантического (DE, MD, Пенсильвания, Нью-Джерси, VA и WV), а также в Канаде и Европе и представляет собой потенциальную угрозу для сельского хозяйства2. Как полифаговый Пешт BMSB может спровоцировать повреждение примерно 300 узлов выявленных растений, включая высокотоварных культур, таких как яблоки, виноград, декоративных растений, семян сельскохозяйственных культур, сои и кукурузы. Повреждение вызвано главным образом из-за режима кормления, известный как lacerate и изобилия, где животное пронзает принимающей культур с его игольчатые стилет, чтобы получить доступ к питательные вещества от сосудистых тканей2,3. BMSB является также крытый вредителей, как они могут найти проживание в жилых помещениях, таких как школы и дома в течение осени через зимний2. Химические вещества и аэроаллергенами, выпущенная BMSB сообщалось незаконным аллергическая реакция в фруктовых культур работников. BMSB может также способствовать аллергических заболеваний, ведущих к контактный дерматит, конъюнктивит и ринита в чувствительных людей4,5. Еще один членистохоботные насекомых, акт, D. citri Кувейама (полужесткокрылые: Liviidae), является серьезным вредителем цитрусовых и передает флоэма ограниченной бактерий (Candidatus Liberibacter Азиатская), вызывая Huanglongbing (HLB), более известный как цитрусовые, озеленение болезни6,7. HLB впервые сообщили из Южного Китая и распространился на 40 различных Азии, Африки, Океании, Южной и Северной Америки стран7. Цитрусовые озеленение является проблемой во всем мире с угрожающими экономических и финансовых потерь из-за потери цитрусовые; Следовательно управление акт считается крайне важное значение для предотвращения и контроля HLB.

Меры для эффективного контроля за этих насекомых-вредителей, как правило, требует применения химических пестицидов, которые являются относительно короткими жили. Стратегии контроля химических инсектицидов часто не хватает стратегий безопасного управления природопользованием или уменьшилась подверженность из-за сопротивления пестицидов в Пешт населения8,9. Следовательно биологического контроля вредителей с молекулярной биопестицидов потенциальной альтернативой, но его использование глобально остаются скромными, и различных видов гемоцитов (например, Trisolcus japonicus) также может быть эффективным как естественных биологических элементы управления. RNAi является потенциал новых технологий для управления инвазивных насекомых-вредителей с молекулярной биопестицидов10. RNAi это хорошо описана гена регулирующий механизм, который облегчает эффективное посттранскрипционного гена глушителей эндогенных а также вторжение двуцепочечных РНК в последовательность конкретным образом, что в конечном итоге приводит к регуляции экспрессии генов в мРНК 12уровень11,. Кратко когда экзогенных dsRNA внедрено в ячейку, которую она перерабатывается в малые интерферирующие РНК членом надсемейства бидентантный Нуклеаза РНКазы III, называемый Dicer, который эволюционно сохраняется в черви, мух, растений, грибов и млекопитающих13, 14 , 15. Эти 21-25 нуклеотидов siRNA дуплексы, затем раскрутил и интегрированы в РНК-комплекс (RISC) как руководство РНК. Этот комплекс RISC-РНК позволяет Уотсона-крика низкопробный спаривать для дополнительных целевых мРНК; Это в конечном итоге приводит к расщепления белков Argonaute, multi домен белка, содержащего РНКазы H-как домен, который ухудшает соответствующей мРНК и уменьшает перевод белка, что ведет к посттранскрипционного гена, глушителей16 , 17 , 18.

РНК-интерференции для борьбы с вредителями требует введением dsRNA в vivo заставить замолчать гена интереса, тем самым активизируя путь siRNA. Различные методы, используемые для доставки dsRNA насекомых и насекомых клетки побудить системных RNAi включают в себя питание10,19, замачивания20,21, микроинъекции22, перевозчиков например липосом 23и другие методы24. RNAi была впервые продемонстрирована в Caenorhabditis elegans замолчать экспрессии генов unc-22 огнем и Мелло25, следуют нокдаун в выражении Кучерявая генов в Drosophila melanogaster26. Первоначальный функциональные исследования использовали микроинъекции доставить двуцепочечной ДНК в насекомых, таких как Apis mellifera22,27, Гороховая pisum28, германский Blattella29, H. щитомордник30и спаривающиеся насекомых (обзор, Terenius и др. 31). микроинъекции выгодно для доставки и точное доза на сайт интерес в насекомых. Хотя такой септик проколы могут выявить выражение иммунной связанных генов из-за травмы32, следовательно, исключает ее практичность в развитии сельскохозяйственной биопестицидов.

Другой метод доставки двуцепочечной ДНК в естественных условиях является путем замачивания, который включает в себя заглатывания или поглощение dsRNA подвеска животных или клетки обычно в внеклеточной среде, содержащей двуцепочечной ДНК. Замачивания использовалась эффективно побудить RNAi дрозофилы S2 клетки культуры ткани подавляют Downstream Raf1 (DSOR1) Митоген активированный протеин киназы киназы (MAPKK)20, а также в C. elegans заставить замолчать POS-1 гена33. Однако малым интерферирующим РНК, доставляются с помощью замачивания является менее эффективным, чтобы побудить интерференции, по сравнению с микроинъекции20. RNAi опосредованного подавления в жевательной насекомых был впервые показан в Западный кукурузный rootworm (WCR) (под эгидой содействие), вливая двуцепочечной ДНК в искусственных агар диета10. Предыдущих докладах обобщили методов доставки вливается в природных диеты для членистоногих34двуцепочечной ДНК. Эти методы доставки далее были полны решимости быть соответствующе эффективно искусственных средств его доставки; Например, в случае мухи цеце (Glossina morsitans morsitans), где равных нокдаун гена, связанные с иммунной наблюдалось, когда двуцепочечной ДНК был доставлен через крови еды или microinjected35. Аналогичным образом доставка двуцепочечной ДНК через капли в светло коричневый яблоко моли (Epiphyas postvittana)36, бугорчатая моли (Plutella xylostella) личинки37, а также мед пчелы38,39 индуцированных эффективное RNAi. Наиболее эффективное RNAi эксперименты в членистохоботные использовали инъекции dsRNA40 , потому что устные доставка двуцепочечной ДНК в членистохоботные насекомых является трудной, поскольку оно должно быть доставлено через сосудистых тканей растения-хозяина. Эффективное RNAi наблюдалось также в АШП и стекловидный крылатый снайпер Цикадки (GWSS), Homalodisca vitripennis: двуцепочечной ДНК был доставлен через цитрусовых и виноградные лозы, которые поглощены двуцепочечной ДНК в сосудистых тканей через корень обливать, листвы аэрозоли, ствол инъекции или поглощением черенки41,42,,4344,45,46. Это также привело к первый патент для dsRNA против ACP (2016, нас 20170211082 A1). Доставка малых интерферирующих РНК и малым интерферирующим РНК с помощью перевозчиков например наночастиц и липосомы придает стабильность, и увеличение эффективности поставляемого dsRNA быстро появляются23,47,48,49 ,50. Новый класс автомобилей доставки на основе наночастиц для нуклеиновых кислот в пробирке и в естественных условиях , было кратко специально для терапевтического применения могут распространять огромный потенциал как подходящие доставки векторные51. Наночастицы как средство доставки для двуцепочечной ДНК могут иметь недостатки, включая растворимость, гидрофобность или ограниченный биоаккумуляции52, но подходящего полимерного пособничестве доставки может компенсировать эти недостатки. Разработка и использование самостоятельно доставлять нуклеотидов появляются также называется «антисмысловых олигонуклеотидов», которые являются одной мель РНК/ДНК дуплексы46.

Vitellogenesis в членистоногих является одним из ключевых процессов управления воспроизведением и регулируется несовершеннолетних гормонов (JH) или экдистероидов, которые являются ключевыми индукторов Vg синтеза жира; в конечном итоге Vg поглощается развивающихся ооцитов через вол рецептор-опосредованный эндоцитоз53. VG-группы полипептиды синтезированы extraovarially, который имеет важное значение для развития основных яичный желток белка, vitellin54,55, и поэтому важно воспроизведение и старения56. VG был успешно замолчать в нематод57 , а также в медоносной пчелы (Apis mellifera) где истощение Vg опосредованного интерференции наблюдался в22взрослых и яйца. Интерференции, протестированных опосредованного посттранскрипционного гена глушителей из Vg был потому что считалось, что его истощении приведет к наблюдаемый фенотипические эффект таких, как снижение плодородия и плодовитости, потенциально помощи в BMSB управления. JHAMT ген, который кодирует S-аденозил L-метионина (SAM)-зависимых JH кислоты O-метилтрансфераза, катализирует заключительный этап пути биосинтеза JH58. В этом пути Фарнезилпирофосфат пирофосфат (FPP) последовательно преобразуется из фарнезол, farnesoic кислота, следуют преобразование метил farnesoate JH, JHAMT. Этот путь сохраняется в насекомых и членистоногих специально для метаморфоза, процесс, который регулируется развивающих гормоны59,,6061. В б. МориJHAMT экспрессии генов и биосинтетическую активность JH в кавернозных Тегулы предположить, что transcriptional подавление гена JHAMT имеет решающее значение для прекращения JH биосинтез58. Таким образом гены JHAMT и вол были отобраны для целевых истощения, с помощью РНК-интерференции. RNAi также был испытан в цитрусовых деревьев для управления АКП и GWSS. Цитрусовые деревья были обработаны с двуцепочечной ДНК через корень обливать, стволовые кран (ствол инъекции), а также Внекорневые спреи с двуцепочечных РНК против насекомых конкретных аргинин киназы (АК) стенограммы42,44. Актуальным применение двуцепочечной ДНК была обнаружена всему сенью цитрусовых деревьев, указывающее эффективной доставки через сосудистых тканей растений и привели к росту смертности в АШП и GWSS,41-42, 45.

В текущем исследовании мы определили метод доставки естественная диета для лечения таких двуцепочечной ДНК. Впоследствии этот недавно разработанный метод использовался для подавления JHAMT и вол мРНК, используя гена конкретных двуцепочечных РНК в нимфы BMSB как показано ранее62. Эти новые протоколы доставки, продемонстрировали здесь отменяют обычных систем доставки РНК, использующих актуальные аэрозоли или микроинъекций. Овощи и фрукты, стволовые кран, обливая почвы и глиняные адсорбенты в может использоваться для доставки двуцепочечной ДНК, которая имеет решающее значение для дальнейшего развития биопестицидов вредителей и патогенных управления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. BMSB воспитания

  1. Задний BMSB насекомых согласно стандартных лабораторной практике и ранее описанных63.
  2. Поднимите ACP (D. citri) насекомых на цитрусовые macrophylla в Теплице (22 ° C) и естественный свет. Использовать взрослых ACP, примерно 5-7 дней после eclosion.

2. Выбор гена регионов и In Vitro синтеза dsRNA

  1. Выберите конкретные гены для BMSB из ранее опубликованных транскриптом профили32.
  2. Убедитесь, что регионы интереса выбран варьируются от 200 до 500 пар.
  3. Выполняйте полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием условий, описанных ниже, чтобы генерировать фрагменты, связанные с выбранной гена интереса от геномной ДНК. В таблице 1 приведена олигонуклеотиды ген специфического.
    1. Реакции PCR: В 0,25 мл ПЦР-пробирку, объединить 5 мкл 10 X буфер ПЦР, 4 мкл dNTP смесь (по 2,5 мм), 2 мкл ДНК шаблона (50 нг/мкл), 2,5 мкл праймеров 1 и 2 (10 мкм), 0,25 мкл ДНК-полимеразы (5 U/мкл) , и DNase/РНКазы свободной воды до 50 мкл.
    2. Условия PCR: цикл реакции PCR усиливает региона интерес на 95 ° C 3 мин после 30 циклов 98 ° C 10 s, 55 ° C за 30 сек, 72° C в течение 1 мин инкубировать реакции на 72 ° C для дополнительных 10 минут очистить реакции PCR с помощью Комплект для очистки.
  4. Усилить полученный ПЦР фрагментов далее с Джин конкретных грунты с последовательностью промоутер полимеразы T7 RNA (5'-ГАА TTA ATA CGA КТК акт ATA GGG Ага-3') как упоминалось ранее62.
  5. Ген LacZ можно используйте в качестве отрицательного контроля (макетов) для RNAi.
    Примечание: LacZ-ген, который кодирует β-галактозидазы усиливается от Escherichiacoli геномной ДНК (праймеры используются, перечислены в таблице 1).
  6. Выполните в vitro транскрипция приносить двуцепочечной ДНК как описано ранее62.
  7. Распустить Ресуспензируйте результате двуцепочечной ДНК в 150 мкл DNase/РНКазы свободной воды, измерения концентрации и хранить при температуре-80 ° C для использования в будущем.

3. доставка двуцепочечной ДНК с помощью зеленой фасоли

  1. Выберите рано 4й instar BMSB нимфы вылупились из того же яйцо массы и голодать их за 24 часа до кормления двуцепочечной ДНК.
  2. Выберите стройные сертифицированных органических зеленые бобы (Phaseolus vulgaris L.) и смыть раствор гипохлорита натрия 0,2% за 5 мин.
    Примечание: Стройная Зеленая фасоль были выбраны таким образом, что бобы могут быть легко размещены в 2 мл пробирок microcentrifuge.
  3. Промойте ddH2O 3 раза и дайте высохнуть на воздухе.
  4. Трим зеленая фасоль с конца чашечки для общей длиной 7,5 см, с использованием чистого лезвия бритвы.
  5. Погружать промывают и подстриженные зеленая фасоль в 300 мкл раствора управления microcentrifuge тубы Кап менее 2 мл (1:10 разрежения зеленый пищевой краситель (ингредиенты: вода, пропиленгликоль, Fd & C желтый 5, Fd & C синий 1 и пропилпарабен как консервант)).
  6. Сделать разведений в vitro синтезированных LacZ, JHAMT или Vg двуцепочечных РНК путем разбавления 5 мкг или 20 мкг в 300 мкл РНКазы/DNase свободной воды давать окончательный концентрациях 0,017 мкг/мкл или 0,067 мкг/мкл, соответственно.
  7. Погружайте промывают и подстриженные зеленая фасоль в Кап менее 2 мл microcentrifuge тубы 300 мкл раствора двуцепочечной ДНК (от шага 3.6).
  8. Оберните и уплотнение края microcentrifuge трубок, включающего погруженный бобы избежать испарения раствора двуцепочечной ДНК и предотвращения проникновения пробки microcentrifuge животных.
  9. Поместите эти трубы в вертикальном порядке при комнатной температуре 3 h разрешить dsRNA решение для загрузки всей фасоль действием капиллярных.
  10. Поместите эти трубы в чистой культуре судов (полипропилен). Место три голодал 4й instar BMSB нимфы в культуре судов.
  11. Лечить три животных каждого судна культуры каждый из которых содержит три зеленые бобы раствором зеленого продовольствия окраски или двуцепочечной ДНК. Поддерживать насекомых при 25 ° C и 72% относительной влажности, под 16 Л: 8 d фотопериода в инкубаторе.
  12. Разрешить насекомых питаются зеленая фасоль (погружен и всасывается с dsRNA) на 5 дней, но пополняться свежими диеты dsRNA лечения зеленый бисер после 3 дней.

4. в реальном времени количественный анализ из выражения следующие RNAi опосредованного подавления экспрессии гена в BMSB (ПЦР)

  1. Измерьте влияние RNAi на уровень экспрессии стенограмма, ПЦР.
  2. Изолировать всего РНК от dsRNA лечить животных и синтеза cDNA62.
  3. Настройка реакций ПЦР, с использованием системы реального времени PCR и праймеры, перечисленных в таблице 1. Использовать следующее условие Велоспорт ПЦР: 95 ° C в течение 10 мин, после чего 40 циклов 95 ° c 15 сек, 60 ° C в течение 1 мин, наряду с шагом диссоциации, включая 95 ° C 15 сек, 60 ° C в течение 1 мин., 95 ° C 15 s и 60 ° C 15 s.
  4. Определить стандарты ПЦР: используйте серийный разрежения cDNA, приготовленный из всего РНК, изолированный от нормальной животное как эталон для количественной оценки.
  5. Использование BMSB 18s RNA как внутренний стандарт для устранения различий в РНК восстановления от тканей32.

5. листвы спрей приложение в больших горшках цитрусовых деревьев и саженцев

Примечание: Растения цитрусовые сорт «Карризо» citrange (Citrus sinensis XPoncirus гепатотоксинов, рутовых), были сохранены в Теплице под естественного света и температуры, вырос в 1,2 Л контейнеров. Растения были постоянно обрезке способствовать росту новых внекорневая побегов, называют «скрытой». ACP предпочитает кормить и откладки яиц на новый рост цитрусовых64.

  1. Выберите растений или рассады и не поливайте их за 2-3 дня до использовать для сухой влажной, но не полностью сухой почвы.
  2. С помощью ручной насос спрей бутылку применить 200 мл раствора (0,5 мг/мл) двуцепочечной ДНК к нижней купола (рис. 4A).
    Примечание: Подготовьте выше упомянутые решения двуцепочечной ДНК в DNase/РНКазы свободной воды.
  3. После распыления приложений, позволяют прикладной dsRNA решение быть полностью поглощается листьями.
    Примечание: Цитрусовые деревья покрыты прикладной двуцепочечной ДНК, а затем листья от любой новый рост или филиалы, которые были охвачены до приложения, были извлечены; двуцепочечной ДНК было обнаружить с помощью ПЦР и показал системный движения в верхнем пологом листья деревьев в 3-4 h44,45,46.
  4. Образец нового роста от ранее превысила деревьев после 25-40 дней, собрав приблизительно 10 листьев от кончиков четырех ветвей. Экстракт всего РНК и анализировать его обратной транскрипции ПЦР (RT-PCR) и ПЦР на наличие прикладной dsRNA триггера, используя праймеры, перечисленных в таблице 1 и ранее описанных методов46.
    Примечание: Образец коллекции, Общая РНК изоляции, RT-PCR и ПЦР проводились как описано46.
  5. Аналогичным образом местно спрей 10 мл двуцепочечной ДНК в регионе нижней рассады или небольших горшках дерево листвы.
    Примечание: Членистохоботные насекомых (акт и GWSS) были даны кормления доступа обычно на 24 ч, после лечения на новый рост (листья) который не были распыляется непосредственно, или который рос неделями позже, или всего растения. Это произвело насекомых, какие испытания позитивным для двуцепочечной ДНК на 3, 6 и 10 дней, после кормления.

6. почвы/Root обливать приложение в больших или малых горшках цитрусовые деревья и саженцы

  1. Выберите растений или рассады и не поливайте их на 2-3 дня до использовать, чтобы позволить почву сухой влажной, но не полностью высохнет (это создает воздушное пространство для хранения жидкого раствора применяться).
  2. 1 Л раствора двуцепочечной ДНК (0,2 мг/мл) в почве больших горшках (примерно 2,5 м) и добавить 1 Л воды (охотник) после 1 час.
  3. Примените 100 мл раствора (1.33 мг/мл) двуцепочечной ДНК в почву высотой 1 м горшках деревья в частично сухих почвах.
  4. Для небольших саженцев применить 10 мл раствора двуцепочечной ДНК (1 мг/мл) в почву в конусов или голые корни (рис. 4В, C).
  5. Разрешить растения, которые получают раствор малым интерферирующим РНК, применяется в качестве почвы замочить, чтобы впитать в течение 30 мин. Затем примените простую воду только лечение для помощи поглощения корнями (20 мл для растений в контейнерах, желтый), или 100 мл, если большие цветочные горшки > 1 галлон.
    Примечание: Злободневно прикладной dsRNA листва привели к обнаружения более дистальных советы филиалов в течение 3-6 ч пост лечения, показаны системные движение через деревья. Новые ветви роста оказались позитивными на двуцепочечной ДНК на 60-90 дней поста лечения. Черенки предоставляются насекомых (акт и GWSS) в РНК, кормления биопроб44.

7. штока крана (инъекции ствол дерева) приложения в больших горшках цитрусовых деревьев и саженцев

  1. Выберите Саженцы цитрусовых, новые, или приблизительно 3,5 лет старых растений для инъекций двуцепочечной ДНК с помощью стволовых коснитесь (ствол инъекции) метод.
  2. Просверлите отверстия в цитрусовых растений, используя дрель и 10 мм сверло, стараясь не превышает 2 см, или около половины диаметра ствола.
  3. Оберните медной кончик каждой форсунки 4 - 6 раз с широкой полосой запайки пленки для предотвращения утечки недалеко от оконечности 0,6 см (¼ дюйма).
  4. Заполнить инжекторы ствол дерева с 6 мл (1,7 мг/мл) dsRNA раствора разводят в воде бесплатно DNase/РНКазы (обозначается здесь как цветные решения).
  5. Внедрить решение в ствол дерева и оставить инжектор в багажнике за 6-10 h разрешить поглощение раствора двуцепочечной ДНК. Разрешить насекомых питаются черенки от лечение деревьев в 3, 10 и 30 дней после лечения.
    Примечание: Двуцепочечной ДНК вводят с помощью метода впрыска ствола сохраняются на деревьях в течение 30-60 дней41,,42-44. Проверка интерференции была проведена ПЦР с праймерами, перечисленные в таблице 1.

8. dsRNA относятся глиняных гранул для доставки насекомых через почву

  1. Вылейте из глины, абсорбирующего в 50-мл Конические трубки до отметки 35 мл (примерно 30 g впитывающих глины) на трубе.
  2. Налейте в трубы для мокрой абсорбента 20 мл dsRNA раствор разбавляют в DNase/РНКазы свободной воды (100 мкг/мл). Шапочка коническая труба, наконечник трубки для удаления воздуха и крышка трубки.
  3. Место трубки вертикально и дайте ему постоять 1-2 мин для глинистых частиц поглощать решения.
  4. Добавьте достаточно малым интерферирующим РНК пропитанной глины в почве смеси заполнить горшок 1 галлон.
  5. Смешать и поверните почвы вручную, чтобы тщательно перемешайте двуцепочечной ДНК пропитанной глины в почву.
  6. Используйте этот почвы для пересаживать саженцев, отобранных для лечения двуцепочечной ДНК.
  7. Воды почвы с 200 мл чистой воды без двуцепочечной ДНК. После 30 мин до 1 часа следить за 100 мл чистой воды. После 24 часов поместите завод на нормальный график полива.
  8. Тест 4-6 листьев обработанных горшечных растений с глиняные адсорбенты и dsRNA каждый месяц после лечения для малым интерферирующим РНК, собирая наиболее апикальной листья нового роста растений.
    Примечание: Растения или вырезки из этих обработанных растений подаются насекомых любое время после 24 ч после лечения и имели возможность доставки РНК-интерференции для до одного года для насекомых (неопубликованные данные).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Овощной опосредованной dsRNA доставки через питание в BMSB 4й instar нимфы был протестирован для развития молекулярной биопестицидов, с помощью РНК-интерференции для инвазивных насекомых-вредителей. BMSBs кормить их стилеты иглы с помощью механизма, известного как разрывают и флеша, который вызывает значительный ущерб урожаю. Стройные органических зеленые бобы, P. vulgaris L., были использованы для тестирования, если питательные вещества или двуцепочечной ДНК могут быть поставлены в естественных условиях в BMSB через питания3. Сегменты фасоль были погружены в DNase/РНКазы бесплатно воду или раствор воды и зеленый пищевой краситель, чтобы проверить доставку в BMSB (рис. 1A). Зеленый пищевой краситель использовался как визуальная индикация подражать двуцепочечной ДНК. Васкулярные ткани зеленых бобов, были насыщенный зеленый пищевой краситель из-за потока зеленого цвета раствора через флоэмы капиллярность62. Нимфы BMSB были замечены кормления на сегменты зеленых бобов, вставив их стилеты в сосудистых тканей зеленых бобов (рис. 1B). Зеленые цвета выделений капельки наблюдались после дней 2 и 3 в насекомых, которые были поданы на фасоль, насыщенный зеленый food окраска указанием поставленный материал внутрь и через кишечник перед экскрецию (рис. 1 c, D ).

Впоследствии мы проверили, если значительное истощение экспрессии целевых генов было достигнуто с помощью зеленой фасоли опосредованной доставки конкретных BMSB двуцепочечной ДНК через проглатывание в BMSB. Зеленая фасоль сегменты были погружены и покрыты раствором 0,067 мкг/мкл (20 мкг в 300 мкл DNase/РНКазы свободной воды) или 0,017 мкг/мкл (5 мкг в 300 мкл DNase/РНКазы свободной воды) в пробирке синтезированных РНК специфичные для BMSB JHAMT и вол , соответственно. Зеленая фасоль также были погружены в воду только, 0,067 мкг/мкл или 0,017 мкг/мкл LacZ двуцепочечной ДНК (макет) как соответствующие элементы управления. Стенограмма уровни были оценены с помощью ПЦР, указывающее, что выражение JHAMT и вол мРНК была значительно сокращена в естественных условиях почти 4,5- и 2,2 раза, соответственно (Рисунок 2а, Б). Следовательно результаты показывают, что что двуцепочечной ДНК могут быть доставлены через сосудистых тканей зеленых бобов, чтобы побудить успешных RNAi.

Еще один членистохоботные Пешт, Арлекин ошибка (HB) (Murgantia histrionica), что наносит ущерб Коул, протестированных культур были также при успешной доставке питательных веществ или лечения двуцепочечной ДНК могут быть поставлены с помощью растительного опосредованной доставки. 4й instar HB нимфы было позволено кормить ребенка зелень (Brassica oleracea var. зелёный) Погруженный в воду или раствор воды с зеленый пищевой краситель. Результаты показали, что HB кормили и проглотить зеленый пищевой краситель, который был явно от их зеленый цветных выделений, по сравнению с HB, что попадает овощи, погруженных в воду, которая была ясно экскрементов (рис. 3).

Дополнительные методы для переходных доставка двуцепочечной распыления или замачивания результаты в dsRNA поглощение все65,тканей растений66корень/почвы. Серия нормальных термитных RNAi-продукты на основе находятся в стадии разработки и может быть доступен вскоре после утверждения. Доставка двуцепочечной ДНК в полях с помощью аэрозоли или корневой обливать может помочь в управлении инвазивных насекомых42,67. Полноразмерный цитрусовые деревья и саженцы были подвержены двуцепочечной ДНК, либо листвы спрей, или почвы или солодки голой, обливая, соответственно (рис. 4). Результаты показали, что двуцепочечных РНК доставлены либо аэрозоли или почвы/голой корень обливать могут быть обнаружены в цитрусовых растений (2,5 м высотой) за 7 недель пост одного контакта 2 g dsRNA42. Поставка и употребления psyllid двуцепочечной ДНК АК (20 нг/мкл) увеличились psyllid смертности на 30-45% (Рисунок 4 d)42.

В vitro транскрипции РНК может быть эффективно доставлен полифаговый насекомых с помощью стволовые кран (ствол инъекции) конкретных двуцепочечной ДНК гена непосредственно в сосудистых тканей растений, которая может быть приобретена насекомых, когда наживаться на таких растений44 (Рис. 5). Для цитрусовых деревьев, которые были подвержены двуцепочечной ДНК иньекциями ствола двуцепочечной ДНК может быть обнаружен в возрасте цитрусовых растений (примерно 1 м в высоту) за 7 недель после одного контакта с использованием 6 мл dsRNA 1,7 мг/мл в растворе DNase/РНКазы свободной воды (Рисунок 5A Б). Флоэма кормления членистохоботные насекомых разрешалось затем питаются эти относились с двуцепочечной ДНК растений-хозяев. Предполагается, что двуцепочечной ДНК была успешно проникнуты и переехал через сосудистой системы цитрусовых растений для употребления, акт, который продемонстрировал смертности, когда кормили на42двуцепочечной ДНК АК.

Bioassays разработаны с 2008 по 2012, были проверку через широкий спектр горшечных растений и показано для обеспечения доставка двуцепочечной ДНК в манере, в которой растения могут поглощать и перемещать двуцепочечной ДНК для системного dsRNA распространение41,42 . Один метод использует компонент абсорбирующий глины с двуцепочечной адсорбции в матрице глины; Это включает в себя широкий спектр глин, Фуллерова земля, цеолит и другие, а также абсорбирующие материалы, целлюлоза, агары, биопластиков, глины, частицы являются носителями пыли бесплатно нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы для доставки активных ингредиентов и т.д. такие dsRNA почвы для поглощаемого растениями и в конечном итоге доставку насекомых (рис. 6). Также комплекс глины химически можно выпустить двуцепочечной ДНК при определенных рН или ионных условиях. Методы доставки глины двуцепочечной ДНК растений было показано, предоставить малым интерферирующим РНК в горшках цитрусовые деревья и другие растения для более чем 14 месяцев (данные не показаны). Эта система доставки может использоваться для изменения черты растений, например цветок цвета, высота растений (карликовость) или другие. В настоящее время этот метод используется для развития эффективных насекомых-вредителей и патогенных (вирус) контроля или управления. Этот подход может быть экономически эффективным для питомников и домовладельцев и не трансгенных метод.

Figure 1
Рисунок 1 . Доставка питательных веществ или двуцепочечной ДНК через зеленая фасоль. (A) сегментов стройные органических зеленые бобы были погружены и впитывания раствора в 2-мл пробирку microcentrifuge, содержащий 300 мкл ddH2O одиночку или ddH2O с зеленый пищевой краситель, 3 ч. Три 4й instar BMSB нимфы были голодали на 24 часа и помещены в культуре судов наряду с 3 зеленая фасоль на судно. (B) BMSB питаются сегментов зеленых бобов, погруженных в воду, пирсинг через зеленые бобы для достижения питательных веществ с их стилеты. (C) день 2 из BMSB, кормление биопроб, стрелки обозначают экскрементов. (D) день 3; Увеличение BMSB выделений (обозначается стрелкой) наблюдается пост проглатывания раствора ddH2O и зеленый пищевой краситель через зеленые бобы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Количественная ПЦР-анализ для измерения уровня Стенограмма после истощения, опосредованного системой РНК-интерференции, JHAMT и вол в BMSB. Всего РНК из 3 индивидуальных нимфы instar BMSB 4й кормили на JHAMT (A) 20 мкг (0,067 мкг/мкл), и Vg (B) 5 мкг (0,017 мкг/мкл) двуцепочечных РНК в 300 мкл ddH2O через сегменты зеленых бобов, был изолирован и Стенограмма уровни были измерены по ПЦР. LacZ двуцепочечной ДНК (макет) служил в качестве отрицательного контроля. BMSB 18s RNA был использован как внутренний стандарт для устранения различий в РНК восстановления тканей. Результаты полученные от три биологических реплицирует и погрешностей указывают SEM. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) была выполнена для проверки статистической значимости данных, p < 0,0001. Результаты воспроизводится от Гош и др. 62 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Перорального лечения в Арлекин ошибка (М. histrionica ) с помощью ребенок зелень. Органические baby зелень были промывают гипохлорита натрия 0,2%, подстриженные и погружен в трубу microcentrifuge Кап менее 2 мл, содержащих 300 мкл раствора (A) DNase/РНКазы бесплатно ddH2O, или (B) DNase/РНКазы бесплатно ddH2 Решение O с зеленый пищевой краситель, в течение 3 ч. Три 4-instar HB нимф были голодали на 24 часа и затем помещен в культуре судов и разрешено питаются эти зелень на 3 дня. Белые стрелки указывают выделений наблюдается на 3 день пост кормления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Листвы спрей и корень обливать приложения в цитрусовых деревьев и саженцев. Выбранных растений или рассады до использовать не поливал для 2-3 дней, чтобы высохнуть, влажной, но не полностью сухой почвы. (A) деревья были впервые превысила и 200 мл раствора (0,5 мг/мл) двуцепочечной ДНК в DNase/РНКазы свободной воды был применен вручную бутылку спрей насоса к нижней навесом. (B) 100 мл dsRNA раствор (1 мг/мл) в свободной воды DNase/РНКазы был применен в почву, саженцев в частично сухих почвах. (C) 100 мл раствора (1 мг/мл) двуцепочечной ДНК в DNase/РНКазы свободной воды был применен к голые корни саженцев для примерно 3 ч. (D) акт кормления на саженцы, которые поглощены голые корни, двуцепочечной ДНК показали увеличение смертности ACP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 . Цитрусовые инъекции ствол дерева рассада. Саженцы цитрусовых высотой около 1 м вводили с 1,7 мг/мл двуцепочечной ДНК. (A) сверла отверстия в цитрусовых саженцев с помощью сверла диаметром 10 мм для вставки инжектора в стволе растения. Воздействию медных кончик каждой форсунки был завернутый с широкой полосой 0,6 см (¼ дюйма) запайки пленки для предотвращения утечки. Форсунки (B), заполнены с 6 мл цветных решения были применены к стеблю (ствол) саженцев. Инжекторы остались в месте для примерно 6-10 ч для полного поглощения раствора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 . Глины почвы поправки доставка двуцепочечной ДНК в растения через почву. Новая линия доставки материалов: глина, которая является носителем свободной нуклеиновые кислоты пыли для использования в предоставлении активные ингредиенты, такие как dsRNA грунты для поглощения в растениях и в конечном итоге в насекомых. Unbaked глины (A) и (B) запеченная с изображением глины толерантности/удержания воды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Потенциальные H. щитомордник целевых генов
Присоединение Размер Джин имя/гомологии
XP_014293026.1 491 Вителлогенина A1-как (Vg) (Возможно изоформ: изоформы вителлогенина-2-как X1 XP_014291483.1; изоформы вителлогенина-2-как X2 XP_014291484.1).
XP_014290953.1 545 Несовершеннолетних гормонов кислота O-метилтрансфераза как (JHAMT) (Возможные гомолога: несовершеннолетних гормонов кислоты O-метилтрансфераза XP_014283772.1).
Праймеры
PCR
Джин имя/гомологии Грунтовка имя Последовательность
VG F BMSB Vitellog P2 CAATTTGATCCACCGACTGTT
VG R BMSB Vitellog P2 CCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH P1 F GGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH P1 R GTATAGGATTGCCATTTTGG
T7 PCR
VG T7 BMSB Vitellog P2 4263 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCAAAGTTGGAAGGGAATGA
VG T7 BMSB Vitellog P2 4753 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH T7 P1 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH T7 P1 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATAGGATTGCCATTTTGG
LacZ T7 LacZ RNAi F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGAAAGCTGGCTACAGGA
LacZ T7 LacZ RNAi R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGGCTTCTGCTTCAAT
AK dsAK-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
AK dsAK 50-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK 50-R TAATACGACTCACTATAGGGAGTGAAGCCCTTGTGGTAGTC
AK dsAK 30-F TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGGACTCTGGAGTAGG
AK dsAK 30-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
ЗЕЛЁНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК dsGFP-F TAATACGACTCACTATAGGGAGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTT
ЗЕЛЁНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК dsGFP-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGTAATGGTTGTCTGGTAAAAGGA
ПЦР
VG RT Vitellog P2 F TTGATAGTTGTTTGGATTTTGAAGGT
VG RT Vitellog P2 R TCTTACTTGATCAGCGCTCAGAA
JHAMT BMSB JH RT P1 F AGGAAAACCCAAAATGGCAAT
JHAMT BMSB JH RT P1 R ATGTATTCTTCTTTTGGATCTTTTCTTGAG
18S BMSB 18S F3 ATGCCCCCGCCTGTCCTTATT
18S BMSB 18S R3 TGAAAGCAGCCTGAATAGTGG
ЗЕЛЁНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК GFP-F GGTAAAAGGACAGGGCCATC
ЗЕЛЁНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК GFP-R TCAAGGAGGACGGAAACATC
AK AK Квант F CGGACTTGAGGGAGAACTGA
AK AK Квант R GTGGTAGATACCGCGACCAG
в ванной -Ванна F GCGTCTCTTCGGTTTGACGG
в ванной -Ванна R CACTTCACCATCTGGTTGGC

Таблицы 1. Последовательности олигонуклеотида для RNAi. Перечислены генов и олигонуклеотиды, используется для генерации фрагментов, двуцепочечной ДНК и ПЦР праймеры PCR для анализа уровней транскрипт.

Дополнительные видео 1: агары и гели как сорбенты для доставки и устойчивый выпуска dsRNA. Гидратированная синтетические или природные агары и гели с двуцепочечной решение, которое может использоваться в качестве приманки или диеты для различных членистоногих. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RNAi оказался важным инструментом для изучения биологической функции гена и регулирования, с большим потенциалом, чтобы быть использованы для управления насекомых-вредителей19,,6869,70, 71. дизайн и подбор соответствующей gene(s) для глушителей в данной видов насекомых и метод доставки соответствующего dsRNA(s) Насекомое являются крайне важное значение. Оптимальный метод для доставки двуцепочечной ДНК в насекомое должна определяться эмпирически, наряду с выбором относительная доза для доставки, как некоторые методы могут предложить преимущества и другие ограничения. Для развития молекулярной биопестицидов, который в конечном итоге могут быть пригодны для окружающей среды выпуска возможно, эффективной и выгодной доставки метод не требуется. Например эффективным для доставки двуцепочечной ДНК для насекомых управления для цитрусовых и виноградными лозами42,44показал злободневно прикладной двуцепочечной ДНК. Инновационные стратегии, такие как использование приманок, сахароза решения, дрожжи или производства бактериальных двуцепочечной ДНК для прямого употребления, актуальным применение двуцепочечной ДНК на растения или производства определенных двуцепочечных РНК, модифицированных трансгенных растений, продвинулись в разработке эффективный контроль на основе RNAi19,72.

Хорошим примером здесь демонстрируется с использованием зеленых бобов для доставки двуцепочечной ДНК (рис. 1 и рис. 2) предназначен для специально влияние и уменьшить насекомых-вредителей глобальной важности. Недавно разработанный растительное опосредованной dsRNA протокол доставки с использованием сегментов зеленых бобов погружен и насыщенных с двуцепочечной ДНК использовалась для эффективно целевых генов конкретных для развития личинок в BMSB. Зеленые бобы являются одним из многих овощей, которые являются съедение BMSB, и поэтому они использовались как средство для доставки двуцепочечной ДНК. Других медиумов доставка двуцепочечной ДНК были испытания (данные не показаны), но не увенчались успехом в обеспечении питания для BMSB возможно из-за различий в сосудистой текстуры. Таким образом мы использовали сегментов зеленых бобов для доставки в vitro синтезированных РНК BMSB нимф. Нуклеиновые кислоты, доставлено через растений или растительных опосредованной техника потенциально может быть возможность побудить RNAi в насекомое выбора как здесь наблюдается с истощением генов JHAMT и вол в BMSB (рис. 2)62.

Этот протокол доставки овощей опосредованной dsRNA успешно используется побудить интерференции не только в BMSB, но и в HB, используя зелень (рис. 3), хотя доставка стратегии и методы должны быть оптимизированы для каждого гена и насекомых. Следовательно рекомендуется проверку различных методов доставки, а также целевых несколько генов интерес индивидуально или путем укладки по крайней мере два двуцепочечных РНК для того чтобы получить лучше фенотипические пенетрантностью. Несколько методов были объединены для доставки dsRNA насекомых и насекомых клетки, включая кормление13,22, замачивания7473,, микроинъекции75и другие методы76 используется для поглощение dsRNA побудить системных RNAi. Новые методы для перорального dsRNA побудить RNAi в других насекомых при попадании на лечение не трансгенных растений также былиизучены (рисунок 4, Рисунок 5и Рисунок 6). Цитрусовые деревья были продемонстрированы штока крана (ствол инъекции), или листвы спрей42,44, чтобы поглощать двуцепочечных РНК, либо через корни. Ранее цитрусовые деревья и зрелого винограда были обработаны насекомых конкретных двуцепочечной ДНК, соответствующий ген АК в АШП и GWSS. Эти обработанных растений привело к увеличению смертности для АШП и GWSS для до различных длин время41,45. Вместе эти результаты показывают, что РНК может препятствовать экспрессии определенных генов изучал насекомых.

Проблемы, которые влияют на успешное подавления экспрессии генов включают уникальные группы двуцепочечной ДНК nucleases (dsRNases) главным образом в кишечнике ткани насекомых и слюнных выделениями или рН кишки, который, может быть ответственным за деградацию двуцепочечной ДНК47 ,,7778. Однако, для преодоления такой деградации, системные РНК-интерференции может быть вызван эффективно насекомых использования более высоких концентраций двуцепочечной ДНК и/или используя КОЛЫШЕК в диете для перорального двуцепочечной ДНК ген специфического для преодоления такой деградации62, 79. Доставка и поглощение двуцепочечной ДНК может также быть стабилизированы с помощью перевозчика молекул, например, наночастицы80 как Хитозан48, липосомы как Lipofectamine 2000 и Metafectene76, полиэтиленгликоль79, Глина nanosheets81и углерода Квантовая точка50. Исследования ведется по совершенствованию эффективной доставки используя агар гель и infused с Джин конкретных двуцепочечной РНК (данных не отображается, см. Дополнительные видео 4). Этот метод может использоваться для доставки эффективной дозы dsRNA муравьи, которые могут нести двуцепочечной ДНК проникнуты смолы или агар в гнездо как еда.

В дополнение к стабильности малым интерферирующим РНК долгосрочное сохранение двуцепочечной ДНК в тканях растений имеет важное значение, особенно для сельскохозяйственных культур. двуцепочечной ДНК распространяться через сосудистых тканей растений, фрукты или овощи могут накапливаться в флоэма и ксилема с снижение ферментативной активности до время попасть в организм насекомых заставить механизм RNAi. Это может потребоваться для некоторых приложений иметь dsRNA сохраняются для короткого периода, такие как на 6 дней в зеленой фасоли или дольше, для 36 h в62,почвы82 так что накопление нуклеиновых кислот в среде становится маловероятным. Однако Нина, et al. продемонстрировали, что nanosheets может защитить большие двуцепочечных РНК от преждевременной деградации как также посредником их устойчивый выпуска на поверхности листьев в течение по крайней мере 30 дней81.

Общей стратегии доставка двуцепочечной ДНК, обсуждаемые здесь могут использоваться заставить замолчать насекомых конкретные гены для борьбы с вредителями. Поставка двуцепочечной ДНК растений через оросительной воды, облить корень или ствол инъекции могут быть эффективной стратегией для насекомых-вредителей, таких как корень кормушки, для которых в настоящее время доступен не метод эффективного управления. Доставка двуцепочечной ДНК с помощью перевозчика или стабилизации среды, таких как глина или агар могут непосредственно добавляться в почву для поглощения растениями. Одной из главных причин медленного прогресса в развитии молекулярной биопестицидов интерференции при посредничестве было отсутствие эффективных устных доставки техники начать эффективное RNAi и стабильности под условия окружающей среды83. Перорального, методы, описанные здесь в будущем могут быть использованы для доставки нуклеиновых кислот опосредованной процедуры экспрессию гена к заводе sap кормления, а также жевательные насекомых для уменьшения повреждения насекомыми в мирового производства продовольствия и развитие устойчивого экологического Пешт управления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы с благодарностью признать, Доналд Вебер и Меган Херлии (USDA, ARS Beltsville, MD) для обеспечение BMSB и HB для экспериментов и колоний; и Мария т. Гонсалес, Сальвадор P. Лопес, (USDA, ARS, Форт Пирс, FL) и Джеки л Меца (Университет штата Флорида, Форт Пирс, FL) для поддержания колонии, пробоподготовки и анализа.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMSB (H. halys) insects  USDA
ACP (D. citri) insects  USDA
organic green beans N/A
Citrus plants USDA
sodium hypochlorite solution J.T. Baker
green food coloring  McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers  Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture) Sigma
Primers  IDT DNA
SensiMix SYBR Bioline
qPCR ABI 7500 Applied Biosystems 
Spray bottle N/A
Parafilm American Can Company
TaKaRa Ex Taq Clontech
QIAquick Qiagen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoebeke, E. R., Carter, M. E. Halyomorpha halys (Stǻl)(Heteroptera: Pentatomidae): a polyphagous plant pest from Asia newly detected in North America. , (2003).
  2. Leskey, T. C., Hamilton, G. C., et al. Pest Status of the Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha Halys in the USA. Outlooks on Pest Management. 23 (5), 218-226 (2012).
  3. Peiffer, M., Felton, G. W. Insights into the Saliva of the Brown Marmorated Stink Bug Halyomorpha halys (Hemiptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (2), e88483 (2014).
  4. Anderson, B. E., Miller, J. J., Adams, D. R. Irritant contact dermatitis to the brown marmorated stink bug, Halyomorpha halys. Dermatitis : contact, atopic, occupational, drug. 23 (4), 170-172 (2012).
  5. Mertz, T. L., Jacobs, S. B., Craig, T. J., Ishmael, F. T. The brown marmorated stinkbug as a new aeroallergen. The Journal of allergy and clinical immunology. 130 (4), 999-1001 (2012).
  6. McClean, A. P. D., Schwarz, R. E. Greening or blotchy-mottle disease of citrus. Phytophylactica. 2 (3), 177-194 (2012).
  7. Bové, J. M. Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
  8. Kuhar, T., Morrison, R., Leskey, T., Aigner, J. Integrated pest management for brown marmorated stink bug in vegetables. , (2016).
  9. Tiwari, S., Mann, R. S., Rogers, M. E., Stelinski, L. L. Insecticide resistance in field populations of Asian citrus psyllid in Florida. Pest management science. 67 (10), 1258-1268 (2011).
  10. Baum, J. A., Bogaert, T., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nature Biotechnology. 25 (11), 1322-1326 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418 (6894), 244-251 (2002).
  12. Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  13. Macrae, I. J., Zhou, K., et al. Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science(New York, N.Y.). 311 (5758), 195-198 (2006).
  14. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., Hannon, G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 (6818), 363-366 (2001).
  15. Ketting, R. F., Fischer, S. E., Bernstein, E., Sijen, T., Hannon, G. J., Plasterk, R. H. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes & development. 15 (20), 2654-2659 (2001).
  16. Agrawal, N., Dasaradhi, P. V. N., Mohmmed, A., Malhotra, P., Bhatnagar, R. K., Mukherjee, S. K. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 67 (4), 657-685 (2003).
  17. Martinez, J., Patkaniowska, A., Urlaub, H., Lührmann, R., Tuschl, T. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell. 110 (5), 563-574 (2002).
  18. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  19. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
  20. Clemens, J. C., Worby, C. A., et al. Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6499-6503 (2000).
  21. Saleh, M. C., van Rij, R. P., et al. The endocytic pathway mediates cell entry of dsRNA to induce RNAi silencing. Nature cell biology. 8 (8), 793-802 (2006).
  22. Amdam, G. V., Simões, Z. L. P., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC biotechnology. 3, 1 (2003).
  23. Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (11), 824-832 (2009).
  24. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 227-235 (2010).
  25. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  26. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
  27. Gatehouse, H. S., Gatehouse, L. N., Malone, L. A. Amylase activity in honey bee hypopharyngeal glands reduced by RNA interference. Journal of Apicultural. , (2004).
  28. Jaubert-Possamai, S., Le Trionnaire, G., Bonhomme, J., Christophides, G. K., Rispe, C., Tagu, D. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC biotechnology. 7, 63 (2007).
  29. Martín, D., Maestro, O., Cruz, J., Mané-Padrós, D., Bellés, X. RNAi studies reveal a conserved role for RXR in molting in the cockroach Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 52 (4), 410-416 (2006).
  30. Bansal, R., Mittapelly, P., Chen, Y., Mamidala, P., Zhao, C., Michel, A. Quantitative RT-PCR Gene Evaluation and RNA Interference in the Brown Marmorated Stink Bug. PloS one. 11 (5), e0152730 (2016).
  31. Terenius, O., Papanicolaou, A., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57 (2), 231-245 (2011).
  32. Sparks, M. E., Shelby, K. S., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Invasive Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha halys (Stål) (Heteroptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (11), e111646 (2014).
  33. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science (New York, N.Y.). 282 (5388), 430-431 (1998).
  34. Baum, J. A., Roberts, J. K. Chapter Five - Progress Towards RNAi-Mediated Insect Pest Management. Insect Midgut and Insecticidal Proteins. 47, 249-295 (2014).
  35. Walshe, D. P., Lehane, S. M., Lehane, M. J., Haines, L. R. Prolonged gene knockdown in the tsetse fly Glossina by feeding double stranded RNA. Insect Molecular Biology. 18 (1), 11-19 (2009).
  36. Turner, C. T., Davy, M. W., MacDiarmid, R. M., Plummer, K. M., Birch, N. P., Newcomb, R. D. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Molecular Biology. 15 (3), 383-391 (2006).
  37. Bautista, M. A. M., Miyata, T., Miura, K., Tanaka, T. RNA interference-mediated knockdown of a cytochrome P450, CYP6BG1, from the diamondback moth, Plutella xylostella, reduces larval resistance to permethrin. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (1), 38-46 (2009).
  38. Maori, E., Paldi, N., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with Colony Collapse Disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
  39. Hunter, W., Ellis, J., Hayes, J., Westervelt, D., Glick, E. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), e1001160 (2010).
  40. Christiaens, O., Smagghe, G. The challenge of RNAi-mediated control of hemipterans. Current Opinion in Insect Science. 6, 15-21 (2014).
  41. Hunter, W. B., Hail, D., Tipping, C., Paldi, N. RNA interference to reduce sharpshooters, the glassy-winged sharpshooter, and the Asian citrus psyllid. Symposium. , 24-27 (2010).
  42. Hunter, W. B., Glick, E., Paldi, N., Bextine, B. R. Advances in RNA interference: dsRNA treatment in trees and grapevines for insect pest suppression. Southwestern Entomologist. , (2012).
  43. Hail, D. A., Dowd, S., Hunter, W. H., Bextine, B. R. Investigating the transcriptome of the potato psyllid (Bactericera cockerelli): toward an RNAi based management strategy. Proceed. 10th Annual Zebra Chip Reporting Session, San Antonio TX, , 183-186 (2010).
  44. de Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNA Interference-Natural Gene-Based Technology for Highly Specific Pest Control (HiSPeC). RNA INTERFERENCE. , (2016).
  45. Taning, C. N. T., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian Citrus Psyllid RNAi Pathway - RNAi evidence. Scientific reports. 6, 38082 (2016).
  46. Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNAi feeding bioassay: development of a non-transgenic approach to control Asian citrus psyllid and other hemipterans. Entomologia Experimentalis et Applicata. 162 (3), 389-396 (2017).
  47. Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi Efficiency, Systemic Properties, and Novel Delivery Methods for Pest Insect Control: What We Know So Far. Frontiers in physiology. 7, 553 (2016).
  48. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Molecular Biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  49. Li-Byarlay, H., Li, Y., et al. RNA interference knockdown of DNA methyl-transferase 3 affects gene alternative splicing in the honey bee. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12750-12755 (2013).
  50. Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, Carbon Quantum Dot, and Silica Nanoparticle Mediated dsRNA Delivery for Gene Silencing in Aedes aegypti: A Comparative Analysis. ACS applied materials & interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
  51. Nimesh, S. Recent patents in siRNA delivery employing nanoparticles as delivery vectors. Recent patents on DNA & gene sequences. 6 (2), 91-97 (2012).
  52. Draz, M. S., Fang, B. A., et al. Nanoparticle-mediated systemic delivery of siRNA for treatment of cancers and viral infections. Theranostics. 4 (9), 872-892 (2014).
  53. Swevers, L., Raikhel, A. S., Sappington, T. W. Vitellogenesis and post-vitellogenic maturation of the insect ovarian follicle. Comprehensive. , (2005).
  54. Tufail, M., Takeda, M. Molecular characteristics of insect vitellogenins. Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).
  55. Hagedorn, H. H., Kunkel, J. G. Vitellogenin and vitellin in insects. Annual review of entomology. , (1979).
  56. Brandt, B. W., Zwaan, B. J., Beekman, M. Shuttling between species for pathways of lifespan regulation: a central role for the vitellogenin gene family? Bioessays. , (2005).
  57. Murphy, C. T., McCarroll, S. A., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  58. Shinoda, T., Itoyama, K. Juvenile hormone acid methyltransferase: a key regulatory enzyme for insect metamorphosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 11986-11991 (2003).
  59. Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual review of entomology. 55, 111-128 (2010).
  60. Nouzova, M., Edwards, M. J., Mayoral, J. G., Noriega, F. G. A coordinated expression of biosynthetic enzymes controls the flux of juvenile hormone precursors in the corpora allata of mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 41 (9), 660-669 (2011).
  61. Huang, J., Marchal, E., Hult, E. F., Tobe, S. S. Characterization of the juvenile hormone pathway in the viviparous cockroach, Diploptera punctata. PloS one. 10 (2), e0117291 (2015).
  62. Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA delivery system for plant-sap-feeding insects. PloS one. 12 (2), e0171861 (2017).
  63. Khrimian, A., Zhang, A., et al. Discovery of the aggregation pheromone of the brown marmorated stink bug (Halyomorpha halys) through the creation of stereoisomeric libraries of 1-bisabolen-3-ols. Journal of natural products. 77 (7), 1708-1717 (2014).
  64. Hall, D. G., Richardson, M. L., El-Desouky, A., Halbert, S. E. Asian citrus psyllid, Diaphorina citri, vector of citrus huanglongbing disease. Entomologia Experimentalis et Applicata. 146 (2), 207-223 (2012).
  65. Murphy, K. A., Tabuloc, C. A., Cervantes, K. R., Chiu, J. C. Ingestion of genetically modified yeast symbiont reduces fitness of an insect pest via RNA interference. Scientific reports. 6, 22587 (2016).
  66. San Miguel,, K,, Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest management science. 72 (4), 801-809 (2016).
  67. Li, H., Guan, R., Guo, H., Miao, X. New insights into an RNAi approach for plant defence against piercing-sucking and stem-borer insect pests. Plant, cell & environment. 38 (11), 2277-2285 (2015).
  68. Hull, D., Timmons, L. Methods for delivery of double-stranded RNA into Caenorhabditis elegans. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 265, 23-58 (2004).
  69. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  70. Burand, J. P., Hunter, W. B. RNAi: future in insect management. Journal of Invertebrate Pathology. 112 Suppl, S68-S74 (2013).
  71. Rodrigues, T. B., Figueira, A. Management of Insect Pest by RNAi-A New Tool for Crop Protection. , (2016).
  72. Baumann, A. M. T., Bakkers, M. J. G., et al. 9-O-Acetylation of sialic acids is catalysed by CASD1 via a covalent acetyl-enzyme intermediate. Nature communications. 6, 7673 (2015).
  73. Araujo, R. N., Santos, A., Pinto, F. S., Gontijo, N. F., Lehane, M. J., Pereira, M. H. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect biochemistry and molecular biology. 36 (9), 683-693 (2006).
  74. Wuriyanghan, H., Rosa, C., Falk, B. W. Oral Delivery of Double-Stranded RNAs and siRNAs Induces RNAi Effects in the Potato/Tomato Psyllid, Bactericerca cockerelli. PloS one. 6 (11), e27736 (2011).
  75. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 30 (4), 313-321 (2003).
  76. Yu, N., Christiaens, O., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions). Insect Science. , (2012).
  77. Allen, M. L., Walker, W. B. Saliva of Lygus lineolaris digests double stranded ribonucleic acids. Journal of Insect Physiology. 58 (3), 391-396 (2012).
  78. Wynant, N., Santos, D., Verdonck, R., Spit, J., Van Wielendaele, P., Vanden Broeck, J. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect biochemistry and molecular biology. 46, 1-8 (2014).
  79. Ghosh, S. K. B., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA-mediated RNA interference through feeding in larval gypsy moth, Lymantria dispar (Lepidoptera: Erebidae). European Journal of Entomology. 114, 170-178 (2017).
  80. Baigude, H., Rana, T. M. Delivery of therapeutic RNAi by nanovehicles. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 10 (15), 2449-2454 (2009).
  81. Mitter, N., Worrall, E. A., et al. Clay nanosheets for topical delivery of RNAi for sustained protection against plant viruses. Nature plants. 3, 16207 (2017).
  82. Dubelman, S., Fischer, J., et al. Environmental fate of double-stranded RNA in agricultural soils. PloS one. 9 (3), e93155 (2014).
  83. Kola, V. S. R., Renuka, P., Madhav, M. S., Mangrauthia, S. K. Key enzymes and proteins of crop insects as candidate for RNAi based gene silencing. Frontiers in physiology. 6, 119 (2015).

Tags

Науки об окружающей среде выпуск 135 доставки коричневый marmorated вонь ошибок азиатских цитрусовых psyllid РНК-интерференция проглатывания Полужесткокрылые
Методы доставки двуцепочечной РНК Оральный побудить РНК-интерференции в флоэма и членистохоботные насекомых, растений sap питание
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B.,… More

Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects. J. Vis. Exp. (135), e57390, doi:10.3791/57390 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter