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Environment

Double-stranded RNA Oral entrega métodos para inducir la interferencia de ARN en floema e insectos Hemipteran alimentación planta de sap

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57390

Summary

Este artículo muestra nuevas técnicas desarrolladas para la entrega oral de ARN bicatenario (dsRNA) a través de los tejidos vasculares de las plantas para ARN de interferencia (ARNi) en la savia del floema insectos.

Abstract

Floema y planta sap alimentación insectos invaden la integridad de los cultivos y frutas para recuperar nutrientes, en el proceso de daños en los cultivos de alimentos. Hemipteran insectos representan un número de plagas económicamente importantes de plantas que causan daños a las cosechas al alimentarse de la savia del floema. El marrón apestosa chinche (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) y el psílido asiático de los cítricos (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) son insectos hemipteran introducidos en América del norte, donde se son una plaga invasiva agrícola de alto valor especiales, fila y cultivos básicos y cítricos, así como una plaga de molestia cuando agregan en el interior. Resistencia a los insecticidas en muchas especies ha llevado al desarrollo de métodos alternativos de estrategias de manejo de plagas. Double-stranded RNA (dsRNA)-mediada por ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo para estudios de genómica funcional que tiene aplicaciones potenciales como una herramienta para la gestión de plagas de insectos el silenciamiento del gen. DsRNA exógeno sintetizada o ARN interferente pequeño (siRNA) puede desencadenar silenciamiento altamente eficiente a través de la degradación de ARN endógeno, que es homólogo al que se presentó. Uso eficaz y ambiental de RNAi como molecular bioplaguicidas para control biológico de insectos hemipteran requiere la entrega en vivo de dsRNAs mediante la alimentación. Aquí demostramos métodos para entrega de dsRNA a insectos: carga de dsARN en judías verdes por inmersión y absorción de dsRNA gene-específico con administración oral a través de la ingestión. También hemos esbozado enfoques de entrega de planta no transgénica mediante aplicaciones foliares, alto flujo de raíz, las inyecciones de tronco, así como gránulos de arcilla, que puede ser esencial para la liberación sostenida de dsRNA. Entrega eficiente de dsARN oral injerida se confirmó como una dosis efectiva para inducir una disminución significativa en la expresión de genes específicos, como la hormona juvenil el ácido O-metiltransferasa (JHAMT) y vitelogenina (Vg). Estos métodos innovadores representan estrategias para la administración de dsRNA a utilizar en la protección de cultivos y superar retos ambientales para el manejo de plagas.

Introduction

Hemipteran insectos incluyen algunas de las plagas económicamente más importantes del agriculturebecause de su capacidad para lograr un crecimiento elevado de la población y enfermedades en plantas. BMSB, H. halys Stål, es una plaga invasora que accidentalmente se introdujo en el hemisferio occidental en Allentown, Pennsylvania de Asia (China, Taiwán, Corea y Japón) con el primer avistamiento reportado en 19961. Desde su introducción, BMSB se ha detectado en 43 Estados, con las poblaciones más altas en el mediados de-Atlántico (DE, MD, PA, NJ, Virginia y WV), así como en Canadá y Europa y representa una amenaza potencial para la agricultura2. Como una plaga polífaga, BMSB puede propiciar daños a aproximadamente 300 anfitriones de la planta identificada como cultivos de alto valor tales como manzanas, uvas, plantas ornamentales, cultivos de semillas, soja y maíz. Daño es causado principalmente por el modo de alimentación conocido como lacerar y al ras cuando el animal atraviesa el cultivo del anfitrión con su estilete de la aguja para acceder a los nutrientes de los tejidos vasculares de2,3. BMSB es también una plaga interior como puede encontrar la residencia en áreas de la vida tales como escuelas y casas durante otoño invierno2. Productos químicos y aeroalérgenos lanzados por BMSB reportaron reacción alérgica ilícita en trabajadores de cultivos de frutas. BMSB también pueden contribuir a enfermedad alérgica a dermatitis por contacto, conjuntivitis y rinitis en personas sensibles4,5. Otro insecto hemipteran, la ACP, D. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), es una grave plaga de cítricos y transmite la bacteria de la líber-limited (Candidatus Liberibacter asiaticus) causante de Huanglongbing (HLB), mejor conocido como el enverdecimiento de los cítricos la enfermedad6,7. HLB primero fue divulgado del sur de China y se ha extendido a 40 diferentes Asia, África, Oceanía, sur y América del norte países7. Enverdecimiento de los cítricos es un problema mundial con amenaza de pérdidas económicas y financieras debido a la pérdida de la fruta cítrica; por lo tanto, gestión de la ACP se considera de suma importancia para la prevención y control de HLB.

Medidas para el efectivo control de estas plagas de insectos requiere, generalmente, vivió de la aplicación de pesticidas químicos que son relativamente cortos. Estrategias de control insecticida químico a menudo carecen de estrategias de gestión ambiental segura o han disminuido la susceptibilidad debido a la resistencia a plaguicidas en las poblaciones de plagas8,9. Por lo tanto, el control biológico de plagas con bioplaguicidas molecular es una alternativa posible, pero su uso a nivel mundial sigue siendo modesto y varias especies de parasitoides (p. ej., Trisolcus japonicus) también pueden ser eficaces como natural biológica controles. RNAi es un potencial emergente tecnología para la gestión de plagas de insectos invasores con bioplaguicidas molecular10. RNAi es un mecanismo regulador del gen descrito bien que facilita el silenciamiento del gen postranscripcional eficaz de endógeno así como invadir dsRNAs de manera específica de secuencia, que finalmente lleva a la regulación de la expresión génica en el mRNA nivel11,12. Brevemente, cuando dsRNA exógeno es interiorizado en una celda que se procesa en siRNAs por un miembro de la superfamilia Rnasa III de nucleasa bidentados, llamada Dicer, que evolutivamente se conserva en gusanos, moscas, plantas, hongos y mamíferos13, 14 , 15. estos dúplex de 21-25 nucleótidos siRNA es desenrollado e integrado en el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) como guía RNAs. Este complejo RISC-RNA permite el emparejamiento de Watson-Crick base para el complementario objetivo mRNA; Esto conduce eventual a escote por el Argonaute proteína, un multi dominio que contiene un Rnasa H-como dominio, que degrada el ARNm correspondientes y reduce la traducción de la proteína, lo lleva a16 el silenciamiento postranscripcional del gen , 17 , 18.

ARNi para manejo de plagas requiere la introducción de dsARN en vivo para silenciar el gen de interés, activando la vía de siRNA. Diversos métodos que se han utilizado para la entrega de dsRNA a insectos y células de los insectos para inducir RNAi sistémica incluyen alimentación10,19, remojo de20,21, microinyección22, portadores tales como liposomas 23y otras técnicas24. RNAi era primer demostrado en Caenorhabditis elegans para silenciar la expresión del gen unc-22 por incendio y Mello25, seguido por la caída en la expresión de los genes encrespados en Drosophila melanogaster26. Estudios funcionales iniciales utilizan microinyección para ofrecer dsARN en insectos, como Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29, Halys H.30y los insectos lepidópteros (revisados por Terenius et al. 31). microinyección es ventajoso para entregar una dosis exacta y precisa en el sitio de interés en el insecto. Aunque tales pinchazos sépticos pueden provocar expresión de genes relacionados inmunes debido a trauma32, por lo tanto, descartando su practicidad en el desarrollo agrícola biopesticidas.

Otro método de entrega de dsARN en vivo es por inmersión, que consiste en la ingestión o absorción de dsARN por suspensión de células o animales generalmente en el medio extracelular que contiene dsARN. Remojo se ha utilizado eficientemente inducir RNAi en células de cultivo de tejidos de Drosophila S2 para inhibir Downstream de Raf1 (DSOR1) mitógeno-activada proteína kinasa kinasa (MAPKK)20, así como en C. elegans para silenciar a la POS-1 gen33. Sin embargo, es menos eficiente para inducir RNAi en comparación con microinyección20dsARN entregado mediante remojo. RNAi mediado silenciar en un insecto masticación era primer demostrado en el rootworm occidental del maíz (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) por infundir el dsRNA en un agar artificial dieta10. Informes anteriores han resumido métodos para entregar dsARN infundido en dietas naturales específicas de artrópodos34. Estos métodos de entrega fueron determinados más eficaz comparable a medios artificiales de la entrega; como en el caso de la mosca tsetsé (Glossina morsitans morsitans), donde observó caída igual de un gen relacionado con inmune cuando dsARN fue entregado a través de la harina de sangre o microinyectados35. Del mismo modo, entrega de dsRNA a través de gotitas de luz marrón manzana polilla (postvittana de Epiphyas)36, larvas de polilla del diamondback (xylostella de Plutella)37, así como las abejas de miel38,39 inducida por ARNi eficiente. Más eficaces experimentos de RNAi en hemipteran han utilizado la inyección de dsRNA40 porque entrega oral de dsARN en insectos hemipteran es ardua ya que deben ser entregado a través de los tejidos vasculares de la planta huésped. Arni eficaz también fue observado en ACP y saltahojas de la Chicharrita de alas cristalinas (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsARN fue entregado a través de cítricos y vides que habían absorbido dsARN en los tejidos vasculares a través de la raíz para lavar los ojos, foliar aerosoles, las inyecciones de tronco o absorción por cortes41,42,43,44,45,46. Esto también dio lugar a la primera patente de dsRNA contra el ACP (2016, nos 20170211082 A1). Entrega de siRNA y dsRNA utilizando portadores tales como nanopartículas y liposomas imparte estabilidad y aumentos en la eficacia de dsARN entregados están surgiendo rápidamente23,47,48,49 ,50. Una nueva clase de vehículos de entrega basados en nanopartículas para los ácidos nucleicos para in vitro y en vivo que fue específicamente para aplicaciones terapéuticas pueden impartir inmenso potencial como vectores de entrega adecuado51. Nanopartículas como un vehículo de entrega para el dsRNA pueden tener desventajas incluyendo solubilidad, hidrofobicidad o bioacumulación limitada52, pero una entrega ayudar a polímero adecuado puede compensar estas desventajas. Desarrollo y uso de la entrega de nucleótidos están surgiendo también llamados 'oligonucleótidos antisentidos', que son solo trenzados RNA/DNA dúplex46.

Vitelogénesis en los artrópodos es un proceso de control de reproducción y regulada por la hormona juvenil (JH) o ecdisona, que son los principales inductores de Vg síntesis de la grasa corporal; el Vg se toma finalmente por el ovocito en desarrollo via Vg de endocitosis mediada por receptores53. VG es un grupo de polipéptidos sintetizados extraovarially, que es esencial para el desarrollo de la proteína de yema de huevo grandes, vitelino54,55, y por lo tanto, es importante en la reproducción y envejecimiento56. VG ha sido silenciado con éxito en nematodos57 , así como en miel de abeja (Apis mellifera) donde RNAi mediado agotamiento de Vg se observa en adultos y huevos22. Arni silenciamiento génico postranscripcional mediada del Vg fue probado porque se pensaba que su disminución provocaría un efecto fenotípico observable tales como reduce la fertilidad y la fecundidad, para potencialmente ayudar en el control de BMSB. El gen JHAMT que codifica la S-adenosil-L-metionina (SAM)-dependiente JH ácido O-metiltransferasa, cataliza el paso final de la JH biosíntesis camino58. En esta vía farnesil pirofosfato (FPP) se transforma secuencialmente de farnesol, farnesoic ácido seguido por la conversión de farnesoate metílico a JH por JHAMT. Esta vía se conserva en insectos y artrópodos específicamente para metamorfosis, un proceso de desarrollo está regulado por hormonas59,60,61. De B. mori, expresión de genes JHAMT y la actividad biosintética de JH en la Corpora allata sugieren que la supresión transcripcional del gen JHAMT es crucial para la terminación de JH biosíntesis58. Por lo tanto, los genes JHAMT y Vg se seleccionaron para agotamiento objetivo utilizando RNAi. RNAi también se probó en cítricos para el control de la ACP y GWSS. Árboles de cítricos fueron tratados con el dsRNA mediante aspersión de raíz, tallo tap (las inyecciones de tronco), así como aplicaciones foliares con dsRNAs contra insectos específicos arginina quinasa (AK) transcripciones42,44. La aplicación tópica de dsARN se detectó en las copas de los árboles, indicando una entrega eficiente a través de los tejidos vasculares de las plantas y resultó en aumento de la mortalidad en el ACP y GWSS41,42, 45.

En el estudio actual, hemos identificado un método de entrega de dieta natural para tratamientos como el dsRNA. Esta técnica recién desarrollada fue utilizada posteriormente para silenciar la JHAMT y Vg mRNA usando dsARNs específicos gene en ninfas BMSB como demostrado anterior62. Estos nuevos protocolos de entrega demostrados aquí reemplazan RNA entrega los sistemas convencionales que utilizan aerosoles tópicos o microinyecciones. Verduras y frutas, madre grifo, tierra mojada y absorbentes de la arcilla en pueden utilizarse para la administración de dsRNA, que es fundamental para el desarrollo de la gestión de plagas y patógenos de bioplaguicida.

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Protocol

1. BMSB de cría

  1. Trasero BMSB insectos según descrita63y la práctica de laboratorio estándar.
  2. Criar insectos ACP (D. citri) sobre Citrus macrophylla en un invernadero (22 ° C) y luz natural. Uso adulto ACP, en aproximadamente 5-7 días post eclosión.

2. selección de las regiones de genes y síntesis In Vitro de dsRNA

  1. Seleccionar genes específicos para BMSB de transcriptoma previamente publicado perfiles32.
  2. Asegúrese de que las regiones de interés seleccionados varían entre 200 a 500 pares de bases.
  3. Llevar a cabo la reacción en cadena de polimerasa (polimerización en cadena) usando las condiciones descritas a continuación para generar fragmentos asociados con el gen seleccionado de interés de la DNA genomic. Vea la tabla 1 para los oligonucleótidos gene-específico.
    1. Reacción de PCR: se combinan en un tubo PCR de 0,25 mL, 5 μl de 10 X PCR Buffer, 4 μL de dNTP mezcla (2,5 mM), 2 μl de la plantilla de ADN (50 ng/μL), 2.5 μl de cartillas 1 y 2 (10 μm), 0.25 μl de ADN polimerasa (5 U/μL) , y hasta 50 μl de agua libre de DNasa/Rnasa.
    2. Condición PCR: ciclo de la reacción de PCR para amplificar la región de interés a 95 ° C por 3 min, seguido de 30 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 55 ° C por 30 s, 72° C durante 1 minuto incubar la reacción a 72 ° C durante un adicional 10 minutos purificar la reacción de PCR utilizando un kit de purificación.
  4. Amplificar los fragmentos PCR obtenidos más con iniciadores específicos del gene flanqueados por la secuencia de promotor de T7 ARN polimerasa (5'-GAA TTA ATA CGA CTC ley ATA GGG AGA-3') como mencionado anterior62.
  5. Utilice gen LacZ como control negativo (mofa) para RNAi.
    Nota: LacZ es un gen que codifica la β-galactosidasa amplificado de la DNA genomic de Escherichiacoli (los cebadores utilizados se listan en la tabla 1).
  6. Realizar la transcripción en vitro para producir dsRNA descrito anterior62.
  7. Disolver y suspender el dsRNA resultante en agua libre de 150 μL DNasa/Rnasa, medir la concentración y a-80 ° C para su uso futuro.

3. entrega de dsRNA con ejotes

  1. Seleccione desde 4th BMSB ninfas de instar nacieron de la misma masa de huevo y hambre durante 24 h antes de dsRNA de alimentación.
  2. Seleccione delgados certificadas orgánicas ejotes (Phaseolus vulgaris L.) y lavar con solución de hipoclorito de sodio al 0.2% durante 5 minutos.
    Nota: Judías verdes delgadas fueron seleccionados para que los granos se pueden acomodar fácilmente en los tubos de microcentrífuga de 2 mL.
  3. Lavar 3 veces con ddH2O y deje secar al aire.
  4. Cortar las judías verdes desde el extremo del cáliz de una longitud total de 7,5 cm usando una cuchilla de limpiar.
  5. Sumerja las judías lavadas y cortadas en un tubo de microcentrífuga de cap-menos de 2 mL conteniendo 300 μL de solución de control (un 1:10 dilución de colorante verde (ingredientes: agua, glicol de propileno, Fd & C amarillo 5, Fd & C azul 1 y propilparabeno como preservativo)).
  6. Hacer diluciones de la en vitro sintetizan dsRNAs LacZ, JHAMT o Vg por dilución 5 μg o 20 μg en 300 μL de agua libre de DNasa/Rnasa para obtener concentraciones finales de 0.017 μg/μl o 0.067 μg/μl, respectivamente.
  7. Sumerja las judías lavadas y cortadas en un tubo de microcentrífuga de cap-menos de 2 mL conteniendo 300 μL de solución de dsRNA (del paso 3.6).
  8. Envolver y sellar los bordes de los tubos de microcentrífuga que encierra los granos sumergidos para evitar la evaporación de la solución de dsRNA y para evitar que los animales entren en el tubo de microcentrífuga.
  9. Coloque estos tubos de forma vertical a temperatura ambiente durante 3 h permitir que la solución de dsRNA a cargarse a través de la judía verde por acción capilar.
  10. Colocar los tubos en recipientes de cultivo limpio (polipropileno). Tres murieron a 4th estadio BMSB las ninfas en los recipientes de cultivo.
  11. Tratar a los tres animales por recipiente de cultivo cada una con tres judías verdes con una solución colorante o dsRNA alimento verde. Mantener los insectos a 25 ° C y 72% de humedad relativa, bajo un fotoperíodo 16 L: 8 en una incubadora.
  12. Permite que los insectos se alimentan de las judías verdes (inmersos y absorbido con dsRNA) durante 5 días pero reponer con nuevas dietas de granos tratamiento verde de dsARN después de 3 días.

4. en tiempo real cuantitativa (qPCR) análisis de la expresión siguiente RNAi mediado silenciamiento del gen BMSB

  1. Medir el efecto de RNAi sobre los niveles de expresión de la transcripción por qPCR.
  2. Aislar el RNA total de los animales Tratado de dsARN y sintetizar el cDNA62.
  3. Configuración de las reacciones de qPCR utilizando un sistema PCR en tiempo real y los iniciadores figuran en la tabla 1. Utilizar la siguiente condición de ciclismo qPCR: 95 ° C durante 10 min seguida por 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 60 ° C por 1 min, junto con el paso de la disociación entre 95 ° C por 15 s, 60 ° C por 1 min, 95 ° C por 15 s y 60 ° C por 15 s.
  4. Determinar los estándares de qPCR: utilizar la dilución seriada del cDNA preparado a partir de ARN total aislado de un animal normal como un estándar de referencia para la cuantificación.
  5. Utilice BMSB 18s RNA como estándar interno para corregir las diferencias en la recuperación del RNA de tejidos32.

5. vapor foliar aplicación en grandes árboles cítricos en maceta y plantas de semillero

Nota: Las plantas del cultivar cítricos citrange 'Carrizo' (Citrus sinensis XPoncirus trifoliata, Rutaceae), fueron mantenidas en un invernadero bajo luz natural y temperatura, cultivados en contenedores de 1,2 L. Las plantas fueron podadas constantemente para promover el crecimiento de nuevos brotes foliares, llamado 'ras'. ACP se prefiere para alimentación y oviposición en el nuevo crecimiento de cítricos64.

  1. Seleccione plantas o plántulas y no regarla durante 2-3 días antes de utilizar dejar que el suelo seque a húmedo pero no completamente seca.
  2. Usando un rociador de bomba de mano Aplique 200 mL de solución de dsRNA (0.5 mg/mL) en el dosel inferior (Figura 4A).
    Nota: Preparar las mencionadas soluciones de dsARN en agua libre de DNasa/Rnasa.
  3. La aplicación del aerosol, deje que la solución de dsRNA aplicada totalmente absorbido por las hojas.
    Nota: Árboles absorben el dsRNA aplicada, y luego se extrajeron hojas de cualquier nuevo crecimiento o de ramas que se cubrieron antes de la aplicación, el dsARN fue detectable usando qPCR y movimiento sistémico en las hojas del dosel superior de árbol en 3-4 h44,45,46.
  4. Muestra el nuevo crecimiento de los árboles anteriormente rematadas después de 25-40 días recogiendo aproximadamente 10 hojas desde las puntas de cuatro ramas. Extraer el RNA total y analizar por transcripción reversa PCR (RT-PCR) y qPCR para la presencia del gatillo de dsARN aplicada utilizando los iniciadores figuran en la tabla 1 y descrito métodos46.
    Nota: La recogida de la muestra total aislamiento de RNA, RT-PCR y qPCR se realizan como se describió anteriormente46.
  5. Del mismo modo, tópico spray 10 mL dsARN a la región inferior de una planta de semillero o follaje pequeño árbol en maceta.
    Nota: Hemipteran insectos (ACP y GWSS) recibieron alimentación acceso normalmente a las 24 h, post tratamientos en nuevo crecimiento (hojas) que no había sido directamente rociado, o que crecieron semanas más tarde, o plantas enteras. Esto produjo que positivo probado para el dsRNA en 3, 6 y 10 días, post alimentación de insectos.

6. suelo/raíz aspersión aplicación en grandes o pequeñas en maceta las plantas de semillero y árboles de cítricos

  1. Seleccione plantas o plántulas y no regarla durante 2-3 días antes de utilizar dejar que el suelo seque a la humedad pero no completamente seco (esto crea espacio de aire para mantener el líquido a aplicar).
  2. 1 L de solución de dsRNA (0,2 mg/mL) a la tierra de macetas grandes (aproximadamente 2,5 m) y añadir 1 L de agua (chaser) después de 1 h.
  3. Aplicar los árboles de 100 mL de solución de dsRNA (1,33 mg/mL) al suelo de 1 m de altura en maceta en suelos parcialmente secos.
  4. Para las pequeñas plántulas, aplicar 10 mL de solución de dsRNA (1 mg/mL) al suelo en los conos o a las raíces desnudas (Figura 4B, C).
  5. Permitir que las plantas que reciben la solución de dsRNA que se aplicó como un alto flujo de suelo en remojo durante 30 minutos. Luego aplicar un tratamiento sólo agua para ayudar a la absorción por las raíces (20 mL para plantas en contenedores amarillos) o 100 mL si macetas más grandes son > 1 galón.
    Nota: DsRNA tópico aplicado al follaje resultó en la detección de extremidades distales en la mayoría de sucursales dentro de los tratamientos post 3-6 h, mostrando movimiento sistémico a través de árboles. Nuevas ramas de crecimiento dieron positivo de dsARN en 60-90 días post tratamiento. Esquejes se proporcionan a los insectos (ACP y GWSS) en un dsRNA alimentación prueba44.

7. aplicación de grifo (inyección de tronco de árbol) en grandes árboles cítricos en maceta y plantas de semillero del eje

  1. Seleccione plántulas de citrus, nuevo, o aproximadamente 3,5 años viejas plantas para inyectar el dsRNA utilizando el vástago toque método (inyecciones de tronco).
  2. Perfore agujeros en las plantas cítricos usando un taladro y una broca de 10 mm, teniendo cuidado de no para exceder de 2 cm o aproximadamente la mitad del diámetro del tallo.
  3. Envuelva la punta de cobre de cada inyector 4 - 6 veces con una franja de ancho de 0,6 cm (1/4 pulgada) de la película para prevenir la pérdida de cerca de la punta.
  4. Llene los inyectores de tronco de árbol con 6 mL (1,7 mg/mL) de solución de dsRNA diluida en agua libre de DNasa/Rnasa (denotada aquí como solución coloreada).
  5. Inyectar la solución en el tronco del árbol y deje el inyector en el tronco para 6-10 h permitir la absorción de la solución de dsRNA. Permita que los insectos se alimentan de los detritos de los árboles tratados en 3, 10 y 30 días post tratamiento.
    Nota: El dsRNA inyectado utilizando el método de inyección de tronco persistió en los árboles durante un período de 30-60 días41,42,44. Validación de RNAi fue realizada por qPCR utilizando los iniciadores figuran en la tabla 1.

8. dsARN gránulos de arcilla tratada para su entrega a los insectos a través de suelo

  1. Derramar la arcilla absorbente en un tubo cónico de 50 mL hasta la marca 35 mL (aproximadamente 30 g de arcilla absorbente) en el tubo.
  2. Vierta 20 mL de solución de dsRNA diluido en agua libre de DNasa/Rnasa (100 μg/mL) en el tubo para mojar todo el absorbente. Cerrar el tubo cónico punta del tubo para ayudar a eliminar el aire y cerrar el tubo.
  3. Colocar el tubo en posición vertical y dejar reposar 1-2 min para las partículas de arcilla absorber la solución.
  4. Añadir suficiente arcilla dsARN empapado en la mezcla de suelo para llenar un recipiente de 1 galón.
  5. Mezclar y dar vuelta al suelo con la mano para mezclar bien la arcilla empapada de dsARN en el suelo.
  6. Utilice este suelo para replantar las plántulas seleccionadas para el tratamiento de dsRNA.
  7. Agua del suelo con 200 mL de agua pura sin dsRNA. Después de 30 min a 1 h, sigue con 100 mL de agua. Después de 24 h, poner la planta en un plan de riego normal.
  8. Prueba 4-6 hojas de las plantas en macetas tratadas con absorbentes de arcilla y dsRNA cada tratamiento de post mes de dsARN recogiendo las hojas más apicales de nuevo crecimiento de las plantas.
    Nota: Las plantas o esquejes de estas plantas tratadas se alimentan a insectos cualquier momento después de 24 h después del tratamiento y han sido capaces de RNAi para entrega hasta un año a los insectos (datos no publicados).

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Representative Results

Entrega de verduras dsARN mediada a través de la alimentación en ninfas de instar BMSB 4th fue probada para el desarrollo de bioplaguicidas molecular utilizando RNAi para plagas invasoras. Alimentación de BMSBs con sus estiletes de aguja por un mecanismo conocido como lacerar y enjuague, que causa daños considerables a los cultivos. Ejotes orgánicos delgados, p. vulgaris L., se utilizaron para probar si nutrientes o dsRNA podría ser entregado en vivo en BMSB a través de la alimentación3. Segmentos de judías verdes se sumergieron en agua libre de DNasa/Rnasa o una solución de agua y colorante verde a la entrega de la prueba en BMSB (figura 1A). El colorante verde fue utilizado como una indicación visual para imitar el dsRNA. El tejido vascular de las judías verdes fueron saturados con colorante verde debido al flujo de solución de color verde a través del floema por acción capilar62. Ninfas BMSB se observaron alimentándose de los segmentos de ejotes insertando sus estiletes en los tejidos vasculares de las judías verdes (figura 1B). Gotitas de excrementos color verde fueron observadas después de días 2 y 3 en insectos que se alimentan de granos saturados con alimento verde para colorear indicando el material entregado había sido ingerido por vía oral y pasado a través del intestino antes de excreción (figura 1, D ).

Posteriormente Probamos si el agotamiento significativo de la expresión génica específica fue logrado mediante la entrega de grano verde mediado de dsRNA específico BMSB a través de la ingestión de BMSB. Segmentos de haba verde se sumergieron y absorción en una solución de 0.067 μg/μl (20 μg en 300 μL de agua libre de DNasa/Rnasa) o 0.017 μg/μl (5 μg en 300 μL de agua libre de DNasa/Rnasa) de in vitro sintetiza dsRNA específico BMSB JHAMT y Vg , respectivamente. Judías verdes también se sumergieron en agua sola, 0.067 μg/μl o 0.017 μg/μl LacZ dsRNA (Mock) como controles respectivos. Niveles de transcripción fueron evaluados usando qPCR indicando que la expresión de JHAMT y Vg mRNA fue significativamente reducida en vivo por casi 4,5 - y 2.2-fold, respectivamente (figura 2A, B). En consecuencia, los resultados indican que dsRNA puede ser entregado a través de los tejidos vasculares de judías verdes para inducir RNAi exitosa.

Otra plaga hemipteran, el bug de Arlequín (HB) (Murgantia histrionica), que provoca daños al cole cultivos también fueron probados si entrega exitosa de nutrientes o tratamientos de dsRNA podría ser entregada utilizando el vegetal mediada por entrega. Las ninfas de HB 4th estadio pudieron alimentarse de berza de bebé (Brassica oleracea var. viridis) inmerso en agua o una solución de agua con colorante verde. Resultados indicaron que HB alimentados e ingiere el colorante verde, que era evidente desde sus excrementos color verdes, en comparación con el HB que ingieren las verduras inmersas en agua, que tenía claro excretas (figura 3).

Técnicas adicionales para la administración transitoria de dsRNA de rociar o de raíz, suelo empapar resultados en captación de dsARN en todos los tejidos de planta65,66. Productos pulverizables a base de ARNi en desarrollo y podrían estar disponibles pronto pendiente de aprobación. Entrega de dsRNA en las áreas con alto flujo de aerosoles o raíz puede ayudar en el manejo de insectos invasores42,67. Plántulas y árboles cítricos tamaño completo expusieron a lo dsRNA por aspersión foliar o de suelo o raíz desnuda mojada, respectivamente (figura 4). Los resultados indicaron que dsRNAs entregado por cualquiera de los dos sprays o aspersión de raíz suelo/desnudo pudo detectarse en plantas de cítricos (2,5 m de altura) por 7 semanas post una exposición única de 2 g de dsARN42. Entrega y la ingestión de psílido dsRNA-AK (20 ng/μL) aumentaron mortalidad psílido por 30-45% (figura 4)42.

In vitro transcritos dsRNA puede entregar eficientemente a insectos polífaga con vástago de grifo (inyecciones de tronco) de dsRNA específico gen directamente en los tejidos vasculares de la planta, que puede ser adquirido por los insectos cuando aprovecharse de tales plantas44 (Figura 5). Para cítricos que expusieron a lo dsRNA por las inyecciones de tronco, el dsRNA podría detectarse en plantas de cítricos (aproximadamente 1 m de altura) para 7 semanas post una sola exposición utilizando 6 mL de 1,7 mg/mL de dsARN en una solución de DNasa/Rnasa agua libre (figura 5A B). Insectos hemipteran líber-alimentación entonces se permitieron que se alimentan de estas plantas hospederas con dsRNA. Se supone que el dsARN con éxito fue infundido y movido a través del sistema vascular de las plantas de cítricos para la ingestión por la ACP, que ha demostrado la mortalidad cuando se alimentan de dsARN AK42.

Pruebas biológicas desarrolladas desde 2008 hasta 2012, han sido evaluados a través de una amplia variedad de plantas en maceta y ha demostrado que proporcionan entrega de dsARN en forma por que las plantas pueden absorber y translocan el dsRNA de dsARN sistémica difusión41,42 . Un método utiliza un componente absorbente de arcilla con la adsorción de dsARN en la matriz de arcilla; Esto incluye una gran variedad de arcillas, tierra de Batán, zeolita y otros, así como otros materiales absorbentes, celulosa, agares, bioplásticos, etc. arcilla partículas son portadores de ácido nucleico libre de polvo que se pueden utilizar para la entrega de activos como dsARN a suelos de absorción de la planta y finalmente entrega a los insectos (figura 6). El complejo de arcilla puede configurarse químicamente para liberar el dsRNA en condiciones iónicas o pH específico. Métodos de entrega de arcilla de dsARN en plantas han demostrado proporcionar dsARN en árboles de cítricos en maceta y otras plantas de más de 14 meses (datos no mostrados). Este sistema puede utilizarse para modificar rasgos de la planta, tales como colores de flor, altura de planta (enanismo) u otros. Actualmente, el uso principal de este método es para el desarrollo de una plaga de insectos eficaz y control de patógenos (virus) o gestión. El enfoque puede ser rentable para los viveros y los propietarios de viviendas y es un método no-transgénicas.

Figure 1
Figura 1 . Entrega de nutrientes o de dsRNA a través de judías verdes. (A) segmentos de ejotes orgánicos delgados se sumergieron y absorbe la solución en un tubo de microcentrífuga de 2 mL conteniendo 300 μL de ddH2O solo o ddH2O con colorante verde, 3 h. Tres 4th instar BMSB ninfas estaban hambrientos de 24 h y colocadas en recipientes de cultivo junto con 3 judías verdes por barco. (B) BMSB alimenta de segmentos de ejotes sumergidos en el agua por la perforación a través de las judías verdes hasta llegar a los nutrientes con sus estiletes. (C) día 2 de la BMSB bioensayo de alimentación, las flechas denotan excretas. (D) día 3; Excretas BMSB mayor (denotados por la flecha) observaron post ingestión de una solución de ddH2O y verde colorante a través de judías verdes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Análisis de RT-PCR cuantitativa para medir el nivel de transcripción después del agotamiento de RNAi-mediada de JHAMT y Vg en BMSB. ARN total de 3 ninfas de instar BMSB 4th individuales alimentados con JHAMT (A) 20 μg (0.067 μg/μl), y Vg (B) 5 μg (0.017 μg/μl) dsRNAs en 300 μL de ddH2O a través de segmentos de judías verdes, fue aislada y la se midieron los niveles de transcripción por qPCR. LacZ dsRNA (Mock) sirvió como control negativo. BMSB 18s RNA se utilizó como estándar interno para corregir las diferencias en la recuperación del RNA de tejidos. Resultados reportados son de tres réplicas biológicas, y barras de error indican SEM. Se realizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para probar para la significación estadística de los datos, p < 0.0001. Resultados reproducen de Ghosh et al. 62 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Administración oral de tratamiento en Arlequín de fallos (M. histrionica ) con berza bebé. Berza orgánica bebé fueron lavado con hipoclorito sódico al 0,2%, recortado y sumergido en un tubo de microcentrífuga de cap-menos de 2 mL conteniendo 300 μL de solución de (A) DNasa/Rnasa ddH gratis2O, o (B) DNasa/Rnasa gratis ddH2 Solución O con colorante verde, por un período de 3 h. Tres ninfas de HB 4 º instar fueron de hambre durante 24 h colocadas en recipientes de cultivo y permitieron a estos berza se alimentan durante 3 días. Las flechas blancas indican excrementos observados en día 3 post alimentación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Raíz y aspersión foliar para emergencias químicas aplicación en árboles de cítricos y plantas de semillero. Las plantas seleccionadas o plántulas previo a utilizar no son regadas durante 2-3 días dejar el suelo secado a humedad pero no completamente seca. (A) los árboles primero fueron rematados y 200 mL de solución de dsRNA (0.5 mg/mL) en agua libre fue de DNasa/Rnasa aplicada a mano frasco pulverizador por bombeo a la cubierta inferior. Solución (B) 100 mL de dsRNA (1 mg/mL) en agua libre de DNasa/Rnasa se aplicó al suelo de plántulas en suelos parcialmente secos. (C) 100 mL de solución de dsRNA (1 mg/mL) en agua libre fue aplicado a las raíces desnudas de las plantas de semillero para aproximadamente 3 h. (D) de DNasa/Rnasa ACP alimentándose de las plantas de semillero que habían absorbido el dsRNA de raíz desnuda, mostraron mayor mortalidad de la ACP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Inyección de tronco de árbol de semilla cítricos. Plantones de cítricos aproximadamente 1 m de altura se inyectan 1,7 mg/mL de dsRNA. (A) Taladre orificios en plántulas de cítricos utilizando una broca de diámetro 10 mm para insertar el inyector en el tallo de la planta. La punta expuesta de cobre de cada inyector estaba envuelto con una tira amplia de 0,6 cm (1/4 pulgada) de película para evitar fugas. Inyectores (B) con 6 mL de solución de color fueron aplicados al tallo (tronco) de las plántulas. Inyectores se quedaron en el lugar por aproximadamente 6-10 h para la completa absorción de la solución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 . Entrega de enmienda de suelo arcilla de dsARN en plantas a través del suelo. Una nueva línea de entrega de material: arcilla que es un portador de ácido nucleico libre de polvo para uso en la entrega de ingredientes activos como el dsARN a suelos de absorción en las plantas y en insectos. Arcilla sin hornear (A) y (B) al horno de arcilla que representa tolerancia/retención de agua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Posibles genes de Diana H. halys
Adhesión Tamaño Gen nombre/homología
XP_014293026.1 491 Vitelogenina-A1-como (Vg) (Posibles isoformas: isoforma de vitelogenina-2-como X1 XP_014291483.1; isoforma de vitelogenina-2-como X2 XP_014291484.1).
XP_014290953.1 545 Hormona juvenil ácido O-methyltransferase-como (JHAMT) (Homólogo del posible: hormona juvenil ácido XP_014283772.1 O-metiltransferasa).
Cartillas de
POLIMERIZACIÓN EN CADENA
Gen nombre/homología Primer nombre Secuencia de
VG BMSB Vitellog P2 F CAATTTGATCCACCGACTGTT
VG BMSB Vitellog P2 R CCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH P1 F GGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH P1 R GTATAGGATTGCCATTTTGG
T7 PCR
VG T7 BMSB Vitellog P2 4263 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCAAAGTTGGAAGGGAATGA
VG T7 BMSB Vitellog P2 4753 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH T7 P1 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH T7 P1 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATAGGATTGCCATTTTGG
LacZ T7 LacZ ARNi F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGAAAGCTGGCTACAGGA
LacZ T7 LacZ ARNi R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGGCTTCTGCTTCAAT
AK dsAK-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
AK dsAK 50-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK 50-R TAATACGACTCACTATAGGGAGTGAAGCCCTTGTGGTAGTC
AK dsAK 30-F TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGGACTCTGGAGTAGG
AK dsAK 30-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
GFP dsGFP-F TAATACGACTCACTATAGGGAGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTT
GFP dsGFP-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGTAATGGTTGTCTGGTAAAAGGA
qPCR
VG RT Vitellog P2 F TTGATAGTTGTTTGGATTTTGAAGGT
VG RT Vitellog P2 R TCTTACTTGATCAGCGCTCAGAA
JHAMT BMSB JH RT P1 F AGGAAAACCCAAAATGGCAAT
JHAMT BMSB JH RT P1 R ATGTATTCTTCTTTTGGATCTTTTCTTGAG
18 AÑOS F3 BMSB 18S ATGCCCCCGCCTGTCCTTATT
18 AÑOS R3 BMSB 18S TGAAAGCAGCCTGAATAGTGG
GFP GFP-F GGTAAAAGGACAGGGCCATC
GFP GFP-R TCAAGGAGGACGGAAACATC
AK AK quant-F CGGACTTGAGGGAGAACTGA
AK AK quant-R GTGGTAGATACCGCGACCAG
una bañera a Tina F GCGTCTCTTCGGTTTGACGG
una bañera una tina R CACTTCACCATCTGGTTGGC

Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos para RNAi. Listados son los genes y los oligonucleótidos utilizados para la generación de fragmentos PCR, dsRNA y cartillas de qPCR para analizar los niveles de transcripción.

1 Video complementario: agares y geles como absorbentes para entrega y liberación sostenida de dsARN. Agares sintéticos o naturales hidratados y geles con solución de dsRNA que puede usarse como cebo o dietas para diferentes artrópodos. Haga clic aquí para descargar este video

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Discussion

Arni ha demostrado para ser una herramienta importante para explorar la función biológica de genes y regulación, con gran potencial para ser utilizados para el manejo de plagas19,68,69,70, 71. el diseño y selección de un apropiado genes para silenciamiento de una determinada especie de insecto y el método de la entrega de la correspondiente dsRNA(s) al insecto son de suma importancia. El método óptimo para la entrega de dsARN en un insecto debe ser determinado empíricamente, junto con la selección de la dosis relativa para la entrega, como ciertos métodos pueden ofrecer ventajas y otras limitaciones. Para el desarrollo de un bioplaguicida molecular que finalmente puede ser adecuado para el lanzamiento ambiental, se requiere un método de entrega factibles, eficientes y ventajosas. Por ejemplo, dsRNA aplicación tópica ha demostrado ser eficaz para la entrega de dsRNA para control de insectos en cítricos y vid42,44. Estrategias innovadoras como el uso de cebos, soluciones de sacarosa, levadura o producción de dsARN bacteriana para ingestión directa, aplicación tópica de dsRNA en las plantas, o la producción de dsARNs específicos por plantas transgénicas modificadas, han avanzado en el desarrollo de controles efectivos basados en RNAi19,72.

Un buen ejemplo se demuestra aquí con el uso de judías verdes para entregar dsRNA (figura 1 y figura 2) diseñado para específicamente del impacto y reducir una plaga de insectos de importancia mundial. El vehículo desarrollado recientemente dsARN mediado entrega protocolo utilizando segmentos de ejotes inmerso y saturada de dsRNA se ha utilizado para efectivamente target genes específicos para el desarrollo larval en BMSB. Judías verdes son uno de los muchos vegetales que son devorados por BMSB y así que éstos fueron utilizados como un medio para entregar dsARN. Otros medios de entrega de dsARN fueron probados (datos no mostrados) pero eran fracasados en el suministro de nutrición a la BMSB posiblemente debido a diferencias en la textura de vascular. Por lo tanto, utilizamos segmentos de judías verdes para entregar en vitro sintetizadas dsRNA a las ninfas BMSB. Los ácidos nucleicos a través de una planta o vegetal técnica mediada puede ser potencialmente capaces de inducir RNAi en el insecto de la opción según lo observado aquí con agotamiento de genes JHAMT y Vg en BMSB (figura 2)62.

Este protocolo de entrega de verduras dsARN mediada ha utilizado con éxito para inducir RNAi en BMSB, pero también en HB con berza (figura 3), aunque estrategias de entrega y métodos deben optimizarse para cada gen e insectos. Por lo tanto, es aconsejable probar varios métodos para la entrega, así como destino múltiples genes de interés individualmente o por apilamientos dsRNAs al menos dos con el fin de obtener mejor penetrancia fenotípica. Varios métodos han sido resumidos para la entrega de dsRNA a insectos y células de los insectos incluyendo alimentación13,22, remojo73,74, microinyección75y otras técnicas76 utilizado para absorción de dsRNA a inducir RNAi sistémica. Más nuevos métodos para la administración oral de dsARN inducir RNAi en otros insectos por ingestión de plantas no-transgénicas tratadas también han sido exploradas (figura 4, figura 5y figura 6). Árboles de cítricos se han demostrado para absorber dsRNAs ya sea a través de las raíces, tallo tap (inyecciones de tronco), o aplicaciones foliares42,44. Previamente, cítricos y vid maduras ha sido tratados con insectos dsRNA específico correspondiente al gen AK en ACP y GWSS. Estas plantas tratadas causaron un aumento en la mortalidad para la ACP y la GWSS por hasta varias longitudes del tiempo41,45. Juntos, estos resultados demuestran que dsRNA puede impedir la expresión de genes específicos de los insectos estudiados.

Retos que afectan el éxito de silenciamiento de la expresión génica son grupos únicos de dsARN nucleasas (dsRNases) expresados principalmente en el tejido intestinal de insectos y secreciones salivares o el pH del intestino que puede ser responsable de la degradación de dsRNA47 ,77,78. Sin embargo, para superar tal degradación, ARNi sistémica puede inducir eficientemente en insectos por utilizando concentraciones más altas de dsRNA o utilización de PEG en la dieta para la entrega oral de dsRNA gene-específicas para superar tal degradación62, 79. entrega y absorción de dsRNA pueden también ser estabilizados con la ayuda de moléculas de portador, tales como nanopartículas80 como Chitosan48, liposomas como Lipofectamine 2000 y Metafectene76, glicol de polietileno79, arcilla nanosheets81y carbono quantum dot50. La investigación es en curso mejorar la entrega eficaz de dsRNA utilizando agar y gel impregnada de dsRNA específico gene (datos no mostrados, ver Video suplementario 4). Esta técnica puede utilizarse para la entrega de una dosis efectiva de dsRNA a las hormigas que puede llevar el dsRNA infundido resina o agar al nido como alimento.

Además de estabilidad de dsRNA, persistencia a largo plazo de dsARN en tejidos de la planta es de importancia, especialmente para cultivos agrícolas. dsRNA distribuido a través de los tejidos vasculares de las plantas, frutas o verduras puede acumularse en el xilema y el floema con actividad enzimática reducida de antes de ser ingeridos por los insectos para inducir el mecanismo de RNAi. Puede ser necesario para ciertas aplicaciones que dsARN persisten durante un corto período, como por 6 días en judías verdes o más, para 36 h en el suelo62,82 para que la acumulación de los ácidos nucleicos en el medio ambiente se convierte en improbable. Sin embargo, Neena et al. , demostraron que nanosheets podría proteger grandes dsRNAs de degradación prematura así como mediar su liberación sostenida en las hojas durante un período de al menos 30 días81.

En general las estrategias de entrega de dsARN aquí podrían utilizarse para silenciar genes específicos insectos de las plagas. Suministro de dsARN a las plantas a través del agua de riego, aspersión de raíz o tronco inyección podría ser una estrategia efectiva para plagas de insectos, tales como alimentadores de la raíz, para que ningún método de control eficiente es actualmente disponible. Entrega de dsRNA usando un portador o estabilizadores como arcilla o agar puede añadirse directamente al suelo para la absorción por las plantas. Una de las principales causas de progreso lento en el desarrollo de bioplaguicidas molecular mediada por ARNi ha sido la falta de técnicas eficientes de administración oral iniciar ARNi eficiente y estabilidad bajo condiciones ambientales83. La entrega oral métodos descritos aquí pueden utilizarse en el futuro para entregar tratamientos de silenciamiento del gen mediada por ácido nucleico a sap de alimentación así como masticar insectos para reducir el daño por insectos en la producción mundial de alimentos y desarrollo sostenible de plagas ecológico gestión.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores reconocen agradecidos Donald Weber y Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) para proporcionar BMSB y HB para la experimentación y el mantenimiento de las colonias; y Maria T. Gonzalez, Salvador P. López, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) y Jackie L. Metz (Universidad de Florida, Fort Pierce, FL) para el mantenimiento de la Colonia, preparación de muestras y análisis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMSB (H. halys) insects  USDA
ACP (D. citri) insects  USDA
organic green beans N/A
Citrus plants USDA
sodium hypochlorite solution J.T. Baker
green food coloring  McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers  Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture) Sigma
Primers  IDT DNA
SensiMix SYBR Bioline
qPCR ABI 7500 Applied Biosystems 
Spray bottle N/A
Parafilm American Can Company
TaKaRa Ex Taq Clontech
QIAquick Qiagen

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Double-stranded RNA Oral entrega métodos para inducir la interferencia de ARN en floema e insectos Hemipteran alimentación planta de sap
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Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects. J. Vis. Exp. (135), e57390, doi:10.3791/57390 (2018).

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