Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Dubbelsträngat RNA Oral leveransmetoder att framkalla RNA-interferens i floem och växt-sap-utfodring Ditropis insekter

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57390
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Horticultural Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

Denna artikel visar nya tekniker utvecklas för muntliga leverans av dubbelsträngat RNA (dsRNA) genom vaskulära vävnader av växter för RNA-interferens (RNAi) i floem sap utfodring insekter.

Abstract

Phloem och växt sap utfodring insekter invadera integritet grödor och frukter att hämta näringsämnen, i den process som skadar livsmedelsgrödor. Ditropis insekter konto för ett antal ekonomiskt betydande skadedjur av växter som orsakar skada på grödor genom att mata på phloem sap. Bärfisen brun marmorated (BMSB), Halyomorpha halys (halvvingar: Zicrona) och den asiatiska citrus psyllid (AVS), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) är Ditropis skadeinsekter införs i Nordamerika, där de är en invasiv jordbruks skadegörare av högt värde specialitet, rad, och häfta grödor och citrusfrukter, liksom en olägenhet pest när de samlade inomhus. Insektsmedel motstånd hos många arter har lett till utvecklingen av alternativa metoder för skadedjursbekämpning förvaltningsstrategier. Dubbelsträngat RNA (dsRNA)-medierad RNA-interferens (RNAi) är en nedtystning mekanism för funktionella genetiska studier som har potentiella tillämpningar som ett verktyg för hantering av skadeinsekter. Exogent syntetiserade dsRNA eller små störande RNA (siRNA) kan utlösa högeffektiva nedtystning genom nedbrytning av endogena RNA, som är homolog till att presenteras. Effektiv och miljömässig användning av RNAi som molekylär biopesticides för Agrilus Ditropis insekter kräver i vivo leveransen av dsRNAs genom utfodring. Här visar vi metoder för leverans av dsRNA till insekter: lastning av dsRNA till gröna bönor genom nedsänkning och absorberande av gen-specifika dsRNA med muntliga leverans genom förtäring. Vi har också beskrivit icke-transgena växter leverans metoder använder foliar sprayer, roten drench, stammen injektioner samt lergranulat, alla kan vara avgörande för frisättningen av dsRNA. Effektiv leverans av oralt intagna dsRNA bekräftades som en effektiv dosering att inducera en betydande minskning i uttryck av riktade gener, såsom juvenil hormon syra O-metyltransferas (JHAMT) och vitellogenin (Vg). Dessa innovativa metoder representerar strategier för leverans av dsRNA att använda i växtskydd och övervinna miljömässiga utmaningar för växtskydd.

Introduction

Ditropis insekter utgör några av de ekonomiskt mest betydande skadedjur av agriculturebecause förmåga att uppnå förhöjda befolkningstillväxt och sprida sjukdomar i växter. BMSB, H. halys Stål, är en invasiv skadegörare som introducerades av misstag i den västra halvklotet i Allentown, Pennsylvania från Asien (Kina, Taiwan, Korea och Japan) med den första iakttagelsen rapporterade i 19961. Sedan introduktionen, BMSB har upptäckts i 43 stater, med den högsta befolkningen i mitten av Atlanten (DE, MD, PA, NJ, VA, och WV) samt i Kanada och Europa, och utgör ett potentiellt hot mot jordbruket2. Som en källor pest, kan BMSB anstiftar skador på cirka 300 identifierade växten varar värd inklusive värdefulla grödor såsom äpplen, druvor, prydnadsväxter, utsädesgrödorna, sojabönor och majs. Skador orsakas främst på grund av utfodring känd som text och färgdrag där djuret genomborrar värd grödan med dess nål-liknande mandrängen få tillgång till näringsämnen från kärlvävnader2,3. BMSB är också en inomhus skadegörare som de kan hitta residence i levande områden såsom skolor och hus under hösten och vintern2. Kemikalier och luftburna allergener släppt av BMSB rapporterades till olaglig allergisk reaktion i frukt gröda arbetstagare. BMSB kan också bidra till allergisk sjukdom leder till kontakteksem, konjunktivit och rinit hos känsliga individer4,5. En annan Ditropis insekt, den ACP, D. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) är en allvarlig skadegörare av citrusfrukter och överför phloem-begränsad bakterierna (Candidatus Liberibacter asiaticus) orsakar Huanglongbing (HLB), mer känd som citrus grönare sjukdom6,7. HLB rapporterades först från södra Kina och har spridit sig till 40 olika asiatiska, afrikanska, Oceanien, Syd och nordamerikanska länder7. Citrus grönare är ett världsomfattande problem med hotande ekonomiska och finansiella förluster på grund av citrusfrukter förlust; management av AVS-betraktas därför av yttersta vikt att förebygga och kontrollera HLB.

Åtgärder för effektiv kontroll av dessa skadeinsekter kräver oftast tillämpningen av kemiska bekämpningsmedel som är relativt korta bodde. Kemiska insektsmedel kontrollstrategier ofta saknar säker miljöledning strategier eller minskat känslighet på grund av bekämpningsmedel motstånd i pest populationer8,9. Därför den biologisk bekämpning av skadedjur med molekylär biopesticides ett potentiellt alternativ, men dess användning globalt sett fortfarande blygsam, och olika arter av parasiter (t.ex., Trisolcus japonicus) kan också vara effektivt som naturliga biologiska kontroller. RNAi är en potentiell ny teknik för att hantera invasiva skadeinsekter med molekylär biopesticides10. RNAi är en väl beskrivna gen reglerande mekanism som underlättar den effektiva postttransskriptionell nedtystning av endogena samt invaderar dsRNAs i en sekvens-specifika sätt, som så småningom leder till reglering av genuttryck på mRNA nivå11,12. Kort, när exogena dsRNA är internaliserad i en cell det bearbetas till siRNAs av en medlem av bidentate nuclease RNase III superfamiljen, kallas Dicer, som är evolutionärt bevarad i worms, flugor, växter, svampar och däggdjur13, 14 , 15. dessa 21-25 nukleotid siRNA duplex sedan utrullad och integrerade i RNA-inducerad ljuddämpningssystemet komplex (RISC) som guide RNAs. Detta RISC-RNA komplex tillåter Watson-Crick bas ihopkoppling att kompletterande rikta mRNA; Detta leder så småningom till klyvning av proteinet Argonaute, en multi-domän protein som innehåller en RNase H-liknande domän, vilket försämrar motsvarande mRNA och minskar protein översättning, vilket ledde till postttransskriptionell nedtystning16 , 17 , 18.

RNAi för växtskydd kräver införandet av dsRNA i vivo att tysta gen av intresse, att därmed aktiveras siRNA smittvägen. Olika metoder som har använts för dsRNA leverans till insekter och insekt celler för att inducera systemisk RNAi bland utfodring10,19, blötläggning20,21, Mikroskop22, transportörer såsom liposomer 23, och andra tekniker24. RNAi var första i Caenorhabditis elegans visat att tysta unc-22 genuttryck genom eld och Mello25, följt av knockdown i uttryck av frizzled generna i Drosophila melanogaster26. Inledande funktionella studier används Mikroskop för att leverera dsRNA i insekter, såsom Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29, H. halys30och fjärilsarter insekter (Recenserad av Terenius o.a. 31). Mikroskop är fördelaktigt att leverera en korrekt och exakt dos till platsen av intresse i insekten. Om än sådana septisk punkteringar kan framkalla immuna relaterade genuttryck på grund av trauma32, därför utesluta dess praktiska jordbruket biopesticides utveckling.

En annan metod för att leverera dsRNA i vivo är genom blötläggning, som innebär intag eller absorption av dsRNA genom upphörande av djur eller celler generellt i extracellulär medium innehållande dsRNA. Blötläggning har använts effektivt inducera RNAi i Drosophila S2 vävnadsodling celler att hämma Downstream-av-Raf1 (DSOR1) mitogen-aktiverat protein kinase kinase (MAPKK)20samt i C. elegans att tysta POS-1 gen33. DsRNA levereras med hjälp av blötläggning är dock mindre effektiva att inducera RNAi jämfört med Mikroskop20. RNAi medierad tysta i en tugga insekt visades först i den västra havren rootworm (VCT) (Diabrotica virgifera virgifera) genom infusion av dsRNA in en konstgjord agar kost10. Tidigare rapporter har sammanfattat metoder för att leverera dsRNA infunderas i naturliga Dieter specifika för leddjur34. Dessa leveransmetoder fastställdes vidare att vara comparably effektiva att konstgjorda medel för leverans; såsom fallet av tsetseflugan (Glossina morsitans morsitans), där lika överväldigande av en immunrelaterade gen observerades när dsRNA levererades antingen genom blodmjöl eller microinjected35. Likaså, leverans av dsRNA via droppar i ljus brunt apple moth (Epiphyas postvittana)36, diamondback moth (Plutella xylostella) larver37, samt honung bin38,39 inducerad effektiv RNAi. Mest effektiva RNAi experiment i Ditropis har utnyttjat injektion av dsRNA40 eftersom muntliga leverans av dsRNA i Ditropis insekter är svåra eftersom det måste levereras genom värdväxts kärlvävnader. Effektiv RNAi observerades också i AVS-länderna och glasartade bevingade sharpshooter dvärgstritar (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA levererades genom citrus och vinrankor som hade absorberas dsRNA in vaskulära vävnader genom roten drench, blad sprayer, stammen injektioner eller absorption av sticklingar41,42,43,44,45,46. Detta resulterade också i det första patentet för dsRNA mot AVS-länderna (2016, oss 20170211082 A1). Leverans av siRNA och dsRNA använder bärare såsom nanopartiklar och liposomer förmedlar stabilitet, och ökningar av levererade dsRNA effekten framväxande snabbt23,47,48,49 ,50. En ny klass av nanopartiklar-baserade leveransfordon för nucleic syror för in vitro- och in-vivo som var sammanfattat speciellt för terapeutiska tillämpningar kan ge enorm potential som lämplig leverans vektorer51. Nanopartiklar som en leveransfordon för dsRNA kan ha nackdelar inklusive löslighet, vattenavvisande egenskaper eller begränsad bioackumulering52, men en lämplig polymer medhjälp leverans kan kompensera dessa nackdelar. Utveckling och användning av att själv leverera nukleotider framträder också kallas 'antisense oligonukleotider', som är enda stranded RNA/DNA duplex46.

Vitellogenesis i leddjur är en viktig process kontrollerande reproduktion och reglerade av juvenile hormon (JH) eller ecdysone, som är de viktigaste inducerare av Vg syntes av kroppsfett; Vg tas så småningom upp av den framkallande äggcellen via Vg receptor medierad endocytos53. VG är en grupp av polypeptider syntetiseras extraovarially, vilket är nödvändigt för utveckling av stora ägg äggula protein, vitellin54,55, och därför är det viktigt i reproduktion och åldrande56. VG har tystats framgångsrikt i nematoder57 samt i honungsbiet (Apis mellifera) där RNAi medierad utarmning av Vg observerades hos vuxna och ägg22. RNAi medierad postttransskriptionell nedtystning VG testades eftersom trodde dess utarmning skulle leda till en observerbar fenotypiska effekt såsom minskad fertilitet och fruktsamhet, till potentiellt stöd i BMSB kontroll. Den JHAMT genen som kodar den S-adenosyl-L-metionin (SAM)-beroende JH syra O-metyltransferas, katalyserar det sista steget av JH biosyntes vägen58. I denna väg farnesyl omvandlas pyrofosfat (FPP) sekventiellt från farnesol, till farnesoic syra följd av konvertering av metyl farnesoate till JH av JHAMT. Denna väg är bevarad i insekter och leddjur specifikt för metamorfos, en process som regleras utvecklingsmässigt hormoner59,60,61. I B. moriföreslår JHAMT genuttryck och JH biosyntetiska aktiviteten i de korpusar allata att transkriptionell undertryckandet av den JHAMT genen är avgörande för uppsägning av JH biosyntes58. Därför valdes JHAMT och Vg generna för riktade utarmning med hjälp av RNAi. RNAi testades också i citrus träd för kontroll av AVS-länderna och GWSS. Citrusträd behandlades med dsRNA genom roten drench, hejda tap (stammen injektioner), samt foliar sprayer med dsRNAs mot insekt specifika arginin kinase (AK) avskrifter42,44. Den lokal applicering av dsRNA upptäcktes över tak av citrusträd, som anger effektiv leverans genom växter vaskulära vävnaderna och resulterade i ökad dödlighet i AVS-länderna och GWSS41,42, 45.

I den aktuella studien har vi identifierat en naturlig kost leveransmetod för behandlingar såsom dsRNA. Denna nyutvecklade teknik användes därefter för ljuddämpning av JHAMT och Vg mRNA med gen specifika dsRNAs i BMSB nymfer som visat tidigare62. Dessa nya leverans protokoll visat här ersätter konventionella RNA leveranssystem som använder aktuell sprayer eller microinjections. Grönsaker och frukter, stem tap, jord dränkte och lera absorbenter i kan användas för leverans av dsRNA, vilket är avgörande för fortsatt utveckling av biopesticide pest och patogen management.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. BMSB uppfödning

  1. Bakre BMSB insekter enligt standard lab praxis och tidigare beskrivna63.
  2. Höja ACP (D. citri) insekter på Citrus macrophylla i ett växthus (22 ° C) och naturligt ljus. Användning vuxen AVS, på cirka 5-7 dagar efter eclosion.

2. Val av genen regioner och In Vitro syntes av dsRNA

  1. Välj specifika gener till BMSB från tidigare publicerade transkriptom profiler32.
  2. Se till att regionerna av intresse valt varierar mellan 200 till 500 baspar.
  3. Utföra polymeras-kedjereaktion (PCR) med de villkor som beskrivs nedan för att generera fragment som är associerad med den valda gen av intresse från genomiskt DNA. Se tabell 1 för de gen-specifika oligonukleotider.
    1. PCR-reaktionen: I en 0,25 mL PCR-rör, kombinera 5 µL 10 X PCR Buffer, 4 µL av dNTP blandning (2,5 mM varje), 2 µL av DNA mall (50 ng/µL), 2,5 µL varje grundfärg 1 och 2 (10 µM), 0,25 µL av DNA-polymeras (5 U/µL) , och DNAS/RNase gratis vatten upp till 50 µL.
    2. PCR-skick: cykla PCR-reaktionen för att förstärka regionen av intresse vid 95 ° C i 3 min följt av 30 cykler av 98 ° C för 10 s, 55 ° C för 30 s, 72° C under 1 min. Inkubera reaktionen vid 72 ° C för en ytterligare 10 min. rena den PCR-reaktion med en rening kit.
  4. Förstärka de erhållna PCR-fragmenten ytterligare med gen specifika primrar flankerad med T7 RNA-polymeras arrangören sekvens (5'-GAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA-3') som nämnts tidigare62.
  5. Använda Lindholm genen som en negativ kontroll (mock) för RNAi.
    Obs: Lindholm är en gen som kodar β-galaktosidas amplifierats från Escherichiacoli genomiskt DNA (primers används listas i tabell 1).
  6. Utför in vitro- transkription för att ge dsRNA som beskrivs tidigare62.
  7. Lös och resuspendera den resulterande dsRNA i 150 µL DNAS/RNase gratis vatten, mäta koncentrationen och förvaras vid-80 ° C för framtida bruk.

3. leverans av dsRNA med gröna bönor

  1. Välj tidigt 4th instar BMSB nymfer kläckts från samma ägg massa och svälta dem för 24 h före dsRNA utfodring.
  2. Välj smal certifierade ekologiska gröna bönor (Phaseolus vulgaris L.) och tvätta med 0,2% natriumhypokloritlösning för 5 min.
    Obs: Smal gröna bönor valdes så att bönorna kan enkelt rymmas i 2 mL mikrocentrifugrör.
  3. Tvätta 3 gånger med ddH2O och låt lufttorka.
  4. Trimma den grön bönor från blomfoder slutet till en total längd på 7,5 cm med en ren rakblad.
  5. Fördjupa den tvättade och putsade gröna bönor i ett cap-mindre 2 mL mikrocentrifug rör som innehåller 300 µL kontrollösning (en 1:10 utspädning av grön karamellfärg (ingredienser: vatten, propylenglykol, Fd & C gul 5, Fd & C blå 1 och Propylparaben som konserveringsmedel)).
  6. Gör utspädningar av in vitro- syntetiseras Lindholm, JHAMT eller Vg dsRNAs genom att späda 5 µg eller 20 µg i 300 µL RNase/DNAS gratis vatten att ge slutliga koncentrationer av 0.017 µg/µL eller 0,067 µg/µL, respektive.
  7. Fördjupa den tvättade och putsade gröna bönor i ett cap-mindre 2 mL mikrocentrifug rör som innehåller 300 µL dsRNA lösning (från steg 3.6).
  8. Linda och försegla kanterna av mikrocentrifugrör omslutande nedsänkt bönorna att undvika avdunstning av dsRNA lösningen och för att hindra djuren från att ange mikrocentrifug röret.
  9. Placera dessa rör på ett upprätt sätt i rumstemperatur i 3 h att tillåta dsRNA lösningen laddas hela den gröna bönan av kapillärkraften.
  10. Placera dessa rör i ren odlingskärl (polypropen). Plats tre svalt 4th instar BMSB nymfer i odlingskärl.
  11. Behandla tre djur per kultur fartyg varje innehållande tre gröna bönor med grön mat färg eller dsRNA lösning. Upprätthålla insekterna vid 25 ° C och 72% relativ luftfuktighet, under en 16 L: 8 d fotoperiod i en inkubator.
  12. Tillåta insekter att mata på den gröna bönor (nedsänkt och absorberas med dsRNA) i 5 dagar men fylla på med färska Dieter av dsRNA behandling gröna pärlor efter 3 dagar.

4. realtid kvantitativ (qPCR) analys av uttryck följande RNAi medierad nedtystning i BMSB

  1. Mäta effekten av RNAi på nivåerna av avskrifter uttryck av qPCR.
  2. Isolera den total-RNA från dsRNA behandlade djur och syntetisera den cDNA62.
  3. Setup qPCR reaktionerna med en realtids PCR-system och primers som anges i tabell 1. Använda villkoret som följande qPCR cykling: 95 ° C i 10 min följt av 40 cykler av 95 ° C under 15 s, 60 ° C i 1 min, tillsammans med dissociation steg inklusive 95 ° C under 15 s, 60 ° C i 1 min, 95 ° C under 15 s , och 60 ° C under 15 s.
  4. Fastställa standarder qPCR: Använd serial utspädning av cDNA beredd från total-RNA isoleras från ett normalt djur som referensstandard för kvantifiering.
  5. Använda BMSB 18s RNA som intern standard för att rätta till skillnader i RNA återhämtning från vävnader32.

5. bladspray tillämpning i stor kruka Citrus träd och plantor

Obs: Växter av citrus sorten 'Carrizo' citrange (Citrus sinensis XPoncirus trifoliata, Rutaceae) kvarstod i ett växthus under naturligt ljus och temperatur, odlas i 1,2 L behållare. Växterna var ständigt beskäras för att främja tillväxten av nya blad skott, kallas 'färg'. ACP föredrar foder och ovipositionen på den nya tillväxten av citrus64.

  1. Välj växter eller plantorna och vattna dem inte för 2-3 dagar före användning att låta jorden torka ut fukt men inte helt torr.
  2. Använd en hand pump sprayflaska att applicera en 200 mL dsRNA lösning (0,5 mg/mL) lägre trädkronorna (figur 4A).
    Obs: Förbereda ovan nämnde dsRNA lösningar i DNAS/RNase gratis vatten.
  3. Spraya efter ansökan, att tillämpad dsRNA lösningen absorberas helt av bladen.
    Obs: Citrusträd absorberas den tillämpad dsRNA, och sedan bladen från antingen ny tillväxt eller grenar som täcktes före applicering, utvanns; dsRNA detekteras med hjälp av qPCR och visade systemisk rörelse in trädet trädkronornas topp bladen i 3-4 h44,45,46.
  4. Prova den nya tillväxten från tidigare toppad träd efter 25-40 dagar genom att samla cirka 10 lämnar från tips av fyra grenar. Extrahera den total-RNA och analysera det genom omvänd Transkription PCR (RT-PCR) och qPCR för förekomst av tillämpad dsRNA utlösaren med primers som anges i tabell 1 och tidigare beskrivna metoder46.
    Obs: Den provtagning, total RNA isolering, RT-PCR och qPCR utfördes som tidigare beskrivits46.
  5. På samma sätt lokalt spraya 10 mL dsRNA i nedre regionen av en planta eller litet krukväxt träd lövverk.
    Obs: Ditropis insekter (AVS-länderna och GWSS) fick utfodring tillgång normalt på 24 h, post behandlingar på ny tillväxt (blad) som inte hade sprutats direkt eller som växte veckor senare eller hela plantor. Detta producerade insekter som testat positivt för dsRNA på 3, 6 och 10 dagar, efter utfodring.

6. jord/Root Drench tillämpning i stor eller liten krukväxt Citrus träd och plantor

  1. Välj plantor eller plantor och vattna dem inte för 2-3 dagar före användning att låta jorden torka ut på fuktig men inte helt torr (Detta skapar luftar utrymme för att hålla den flytande lösningen tillämpas).
  2. Lägg 1 L dsRNA lösning (0,2 mg/mL) till smutsa av stora krukväxter (ca 2,5 m) och 1 L vatten (chaser) efter 1 h.
  3. Tillämpa 100 mL dsRNA lösning (1.33 mg/mL) på smutsa av 1 m hög krukväxt träd i delvis torra jordar.
  4. För små plantor, applicera 10 mL dsRNA lösning (1 mg/mL) till jorden i kottar eller bare rötterna (figur 4B, C).
  5. Låt växterna som får dsRNA lösningen appliceras som en jord drench i blöt i 30 min. Applicera sedan vanligt vatten enda behandling för att underlätta absorptionen av rötter (20 mL för växter i gul behållare) eller 100 mL om större krukor är > 1 gallon.
    Obs: Lokalt applicerad dsRNA till lövverk resulterade i upptäckten mest distala spetsarna på grenarna inom 3-6 h post behandlingar, visar systemisk rörelse genom träden. Nya tillväxt grenar testade positivt för dsRNA på 60-90 dagar post behandlingar. Sticklingar finns till insekter (AVS-länderna och GWSS) i en dsRNA utfodring bioassay44.

7. stem Tap (Tree Trunk injektion) tillämpning i stor krukväxt Citrus träd och plantor

  1. Välj citrus plantor, nya, eller cirka 3,5 år gamla plantor för att injicera dsRNA använder stammen tryck (stammen injektioner) metod.
  2. Borra hål i citrus växterna med hjälp av en borrmaskin och en 10 mm borr, noga med att inte överstiga 2 cm, eller ungefär halva diametern på stammen.
  3. Wrap koppar spetsen av varje insprutare 4 - 6 gånger med en 0,6 cm (¼ tum) breda band för tätning film för att förhindra läckage nära spetsen.
  4. Fyll tree trunk spridarna med 6 mL (1,7 mg/mL) av dsRNA lösning utspädd i DNAS/RNase gratis vatten (betecknas här som färgad lösning).
  5. Injicera lösningen i stammen på trädet och lämna injektorn i stammen för 6-10 h att absorptionen av dsRNA lösningen. Tillåta insekter att mata på sticklingar från behandlade träd på 3, 10 och 30 dagar efter behandling.
    Obs: Den dsRNA injiceras med metoden stammen injektion framhärdade i träden under en period av 30-60 dagar41,42,44. Validering för RNAi framfördes av qPCR med primers som anges i tabell 1.

8. dsRNA behandlat lergranulat för leverans till insekter genom jord

  1. Häll ut leran absorberande i en 50 mL konisk röret till 35 mL märket (cirka 30 g av lera absorberande) på röret.
  2. Häll 20 mL av dsRNA lösningen utspädd i DNAS/RNase gratis vatten (100 µg/mL) i röret till våt alla absorbenten. Cap koniska röret, spets röret för att ta bort luft och cap röret.
  3. Placera röret upprätt och låt det stå i 1-2 min för lera partiklarna att absorbera lösningen.
  4. Lägg tillräckligt dsRNA-indränkt lera i marken mixen att fylla en 1 gallon pott.
  5. Blanda och slå i marken för hand för att kunna blanda dsRNA-indränkt lera i marken.
  6. Använd denna jord för att plantera plantor som valts för dsRNA behandling.
  7. Vatten marken med 200 mL vanligt vatten utan dsRNA. Efter 30 min till 1 h, Följ med 100 mL vanligt vatten. Efter 24 h, sätta anläggningen på en normal vattning schema.
  8. Testa 4-6 blad av behandlade krukväxter med lera absorbermedel och dsRNA varje månad efterbehandling för dsRNA genom att samla de mest apikala blad nya växters tillväxt.
    Obs: Växter eller sticklingar från dessa behandlade växter matas till insekter som helst efter 24 h efterbehandling och har kunnat RNAi för leverans upp till ett år till insekter (opublicerade data).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vegetabiliska medierad dsRNA leverans genom utfodring i BMSB 4th instar nymfer testades för utveckling av molekylära biopesticides med hjälp av RNAi för invasiv skadeinsekter. BMSBs foder med sin nål-liknande stylets genom en mekanism som kallas lacerate och spola, som orsakar betydande skador på grödor. Slanka ekologiska gröna bönor, P. vulgaris L., användes för att testa om näringsämnen eller dsRNA kunde levereras i vivo till BMSB genom utfodring3. Segment av gröna bönor var nedsänkt i DNAS/RNase gratis vatten eller en lösning av vatten och grön karamellfärg att testa leverans i BMSB (figur 1A). Den grön karamellfärg användes som en visuell indikation för att imitera dsRNA. Kärlvävnad av den gröna bönan var mättad med grön karamellfärg på grund av flödet av gröna färgade lösningen genom phloemen av kapillärkraften62. BMSB nymfer sågs utfodring på segmenten på gröna bönor genom att infoga sin stylets i vaskulära vävnader i den gröna bönan (figur 1B). Gröna färgade exkret droppar observerades efter dag 2 och 3 i insekter som matades på bönor mättad med grön mat färg indikerar det levererade materialet hade intas oralt och passerade genom tarmen före utsöndring (figur 1 c, D ).

Därefter testade vi om betydande utarmning av riktade genuttryck var fulländad med gröna bönor medierad leveransen av BMSB specifika dsRNA genom förtäring i BMSB. Gröna bönor segment var nedsänkt och absorberas en lösning av antingen 0,067 µg/µL (20 µg i 300 µL av DNAS/RNase gratis vatten) eller 0.017 µg/µL (5 µg i 300 µL av DNAS/RNase gratis vatten) in vitro syntetiseras dsRNA specifika för BMSB JHAMT och Vg , respektive. Gröna bönor var också nedsänkt i enbart vatten, 0,067 µg/µL eller 0.017 µg/µL Lindholm dsRNA (Mock) som respektive kontroller. Avskrift nivåer utvärderades med hjälp av qPCR som anger detta uttryck av JHAMT och Vg mRNA var betydligt reducerad i vivo av nästan 4,5 - och 2,2, respektive (figur 2A, B). Följaktligen visar resultaten att dsRNA kan levereras genom gröna bönor att inducera framgångsrika RNAi vaskulära vävnader.

En annan Ditropis pest, av Harlequin bugg (HB) (Murgantia histrionica), som orsakar skador på cole grödor testades också om framgångsrik leverans av näringsämnen eller dsRNA behandlingar kunde levereras med grönsaken medierad leverans. 4th instar HB nymfer tilläts att livnära sig på baby grönkål (Brassica oleracea var. viridis) nedsänkt i vatten eller en lösning av vatten med grön karamellfärg. Resultaten indikerade att HB utfodras och intas i grön karamellfärg, vilket framgår av deras gröna färgade utsöndringar, jämfört med HB som intas grönsakerna nedsänkt i vatten, som hade tydliga exkrementer (figur 3).

Ytterligare tekniker för övergående leverans av dsRNA sprutning eller rot/jord blötläggning resultat i dsRNA upptag i alla av växt vävnader65,66. Sprejbara RNAi-baserade produkter är under utveckling och kan vara tillgänglig snart väntar på godkännande. Leverans av dsRNA i fälten med hjälp av sprayer eller rot drench får stöd i att hantera invasiva insekter42,67. Fullstora citrus träd och plantor utsattes för dsRNA bladspray, eller via jord eller bare root dränkte, respektive (figur 4). Resultaten indikerade att dsRNAs levereras av antingen sprayer eller jord/bare root drench kunde detekteras i citrusväxter (2,5 m lång) 7 veckor efter en enda exponering 2 g dsRNA42. Leverans och intag av psyllid dsRNA-AK (20 ng/µL) ökade psyllid dödlighet med 30-45% (figur 4 d)42.

In vitro transkriberas dsRNA effektivt kan levereras till källor insekter med stamceller kran (stammen injektioner) av genen specifika dsRNA direkt till vaskulära vävnader i anläggningen, som kan förvärvas genom insekter när jagar på sådana växter44 (Figur 5). För citrusträd som utsattes för dsRNA av stammen injektioner, kunde dsRNA detekteras i åldern citrusväxter (ca 1 m lång) för 7 veckor efter en enda exponering med 6 mL 1,7 mg/mL av dsRNA i en lösning av DNAS/RNase gratis vatten (figur 5A B). Phloem-utfodring Ditropis insekter fick sedan att livnära sig på dessa värdväxter behandlas med dsRNA. Det antas att dsRNA framgångsrikt infunderas och flyttade genom det vaskulära systemet av citrus växterna för förtäring av AVS, som visade dödlighet när matas på dsRNA-AK42.

Bioassays har framkallade från 2008 till 2012, granskats över ett brett utbud av krukväxter och visat att tillhandahålla dsRNA leverans på ett sätt som växter kan absorbera och translocate dsRNA för systemisk dsRNA spridning41,42 . En metod använder en lera absorberande komponent med dsRNA adsorption till matrisen lera; Detta inkluderar en mängd olika leror, Fuller's jorden, Zeolit och andra, som liksom andra absorberande material, cellulosa, agar, bioplaster, etc. lera partiklar är damm gratis nukleinsyra bärare som kan användas för att leverera aktiva ingredienserna såsom dsRNA till jordar för anläggningen upptag och slutligen leverans till insekter (figur 6). Leran komplex kan också konfigureras kemiskt för att släppa dsRNA under specifika pH eller Joniska villkor. Lera leveransmetoder av dsRNA i anläggningar har visat sig ge dsRNA in krukväxter citrus träd och andra växter i över 14 månader (inga data anges). Detta leveranssystem kan användas för att ändra anläggningen drag, såsom blomma färger, växt höjd (dwarfing) eller andra. För närvarande är den primära användningen av denna metod för utveckling av en effektiv insekt pest och patogener (virus) kontroll eller ledning. Metoden kan vara kostnadseffektivt för daghem och husägare och är en icke-transgena metod.

Figure 1
Figur 1 . Leverans av näringsämnen eller dsRNA genom haricots. (A) segment av slanka ekologiska gröna bönor var nedsänkt och absorberas lösningen i en 2 mL mikrocentrifug rör som innehåller 300 µL av antingen ddH2O ensam eller ddH2O med grön karamellfärg, för 3 h. Tre 4th instar BMSB nymfer var svalt för 24 h och placeras i odlingskärl tillsammans med 3 gröna bönor per fartyg. (B) BMSB foder på segment av gröna bönor nedsänkt i vatten av piercing genom den gröna bönor att nå näringsämnen med deras stylets. (C) dag 2 av den BMSB utfodring bioassay, pilar beteckna exkret. (D) dag 3; Ökad BMSB exkrementer (betecknas med pil) observerats efter intag av en lösning av ddH2O och grön karamellfärg genom gröna bönor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Kvantitativ RT-PCR analys för att mäta graden av avskrift efter RNAi-medierad utarmning av JHAMT och Vg i BMSB. Total-RNA från 3 individuella BMSB 4th instar nymfer matas på JHAMT (A) 20 µg (0,067 µg/µL), och Vg (B) 5 µg (0,017 µg/µL) dsRNAs i 300 µL ddH2O levereras genom segment av gröna bönor, var isolerad och avskrift nivåerna mättes av qPCR. Lindholm dsRNA (Mock) tjänade som en negativ kontroll. BMSB 18s RNA användes som intern standard för att rätta till skillnader i RNA återhämtning från vävnader. Rapporterade resultaten från tre biologiska replikat och felstaplar visar SEM. En envägs variansanalys (ANOVA) utfördes för att testa för statistisk signifikans av data, p < 0,0001. Resultaten återges från Ghosh o.a. 62 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Muntliga leverans behandling i Harlequin bugg (M. histrionica ) använder baby grönkål. Ekologiska baby grönkål var tvättas med 0,2% natriumhypoklorit, trimmas och nedsänkt i en 2 mL cap-mindre mikrocentrifug rör som innehåller 300 µL lösning av (A) DNAS/RNase gratis ddH2O eller (B) DNAS/RNase gratis ddH2 O lösning med grön karamellfärg, under en period på 3 h. Tre 4 instar HB nymfer var svalt för 24 h och sedan placeras i odlingskärl och att livnära sig på dessa grönkål i 3 dagar. Vita pilar indikerar exkret som observerats på dag 3 post utfodring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Bladspray och rot drench tillämpning i citrus träd och plantor. De utvalda plantor eller plantor tidigare använda är inte vattnas för 2-3 dagar att låta jorden torka ut fukt men inte helt torr. (A) träden var först toppad och 200 mL dsRNA lösning (0,5 mg/mL) i DNAS/RNase gratis vatten var appliceras för hand pump sprayflaska lägre trädkronorna. (B) 100 mL dsRNA lösning (1 mg/mL) i DNAS/RNase gratis vatten tillämpades på smutsa av plantor i delvis torra jordar. (C), 100 mL dsRNA lösning (1 mg/mL) i DNAS/RNase gratis vatten tillämpades på plantor för cirka 3 h. (D) nakna rötter ACP utfodring på plantor som hade absorberas dsRNA av nakna rötter, visade ökad ACP dödlighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Citrus plantor tree trunk injektion. Citrus plantor ca 1 m höga injicerades med 1,7 mg/mL av dsRNA. (A) borra hål i citrus plantor med en 10 mm diameter borr för att infoga injektorn i stammen av anläggningen. Den exponerade koppar spetsen av spridarna var insvept med en 0,6 cm (¼ tum) breda band för tätning film för att förhindra läckage. (B) spridare fylld med 6 mL färgad lösning tillämpades på stammen (stam) av plantor. Injektorer var kvar i cirka 6-10 h för komplett upptag av lösningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 . Lera jord ändring leverans av dsRNA i växter genom marken. En ny linje av leverera material: lera som är damm gratis nukleinsyra bärare för att leverera aktiva ingredienser såsom dsRNA till jord för upptag i växter och i slutändan till insekter. (A) obakade lera och (B) bakad lera föreställande tolerans/vätskeansamling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Potentiella H. halys målgener
Anslutning Storlek Gen namn/homologi
XP_014293026.1 491 Vitellogenin-A1-liknande (Vg) (Möjligt isoformer: vitellogenin-2-liknande isoform X1 XP_014291483.1; vitellogenin-2-liknande isoform X2 XP_014291484.1).
XP_014290953.1 545 Juvenile hormon syra O-methyltransferase-liknande (JHAMT) (Möjligt homolog: juvenil hormon syra O-metyltransferas XP_014283772.1).
Grundfärger
PCR
Gen namn/homologi Primer namn Sekvens
VG BMSB Vitellog P2 F CAATTTGATCCACCGACTGTT
VG BMSB Vitellog P2 R CCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH P1 F GGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH P1 R GTATAGGATTGCCATTTTGG
T7 PCR
VG T7 BMSB Vitellog P2 4263 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCAAAGTTGGAAGGGAATGA
VG T7 BMSB Vitellog P2 4753 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH T7 P1 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH T7 P1 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATAGGATTGCCATTTTGG
Lindholm T7 Lindholm RNAi F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGAAAGCTGGCTACAGGA
Lindholm T7 Lindholm RNAi R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGGCTTCTGCTTCAAT
AK dsAK-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
AK dsAK 50-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK 50-R TAATACGACTCACTATAGGGAGTGAAGCCCTTGTGGTAGTC
AK dsAK 30-F TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGGACTCTGGAGTAGG
AK dsAK 30-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
GOD JORDBRUKARSED dsGFP-F TAATACGACTCACTATAGGGAGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTT
GOD JORDBRUKARSED dsGFP-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGTAATGGTTGTCTGGTAAAAGGA
qPCR
VG RT Vitellog P2 F TTGATAGTTGTTTGGATTTTGAAGGT
VG RT Vitellog P2 R TCTTACTTGATCAGCGCTCAGAA
JHAMT BMSB JH RT P1 F AGGAAAACCCAAAATGGCAAT
JHAMT BMSB JH RT P1 R ATGTATTCTTCTTTTGGATCTTTTCTTGAG
18S BMSB 18S F3 ATGCCCCCGCCTGTCCTTATT
18S BMSB 18S R3 TGAAAGCAGCCTGAATAGTGG
GOD JORDBRUKARSED GFP-F GGTAAAAGGACAGGGCCATC
GOD JORDBRUKARSED GFP-R TCAAGGAGGACGGAAACATC
AK AK quant-F CGGACTTGAGGGAGAACTGA
AK AK quant-R GTGGTAGATACCGCGACCAG
a-badkar a-badkar-F GCGTCTCTTCGGTTTGACGG
a-badkar a-badkar-R CACTTCACCATCTGGTTGGC

Tabell 1. Oligonukleotid sekvenser för RNAi. Listas de gener och oligonukleotider som används för att generera PCR-fragmenten, dsRNA och qPCR primers för att analysera avskrift nivåerna.

Kompletterande Video 1: agar och geler som absorbenter för leverans och frisättningen av dsRNA. Hydrerade syntetiska eller naturliga agar och geler med dsRNA lösning som kan användas som bete eller dieter för olika leddjur. Klicka här för att ladda ner denna video

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RNAi har visat sig vara ett viktigt verktyg för att utforska genen biologisk funktion och reglering, med stor potential att utnyttjas för hantering av skadeinsekter19,68,69,70, 71. konstruktion och val av en lämplig gene(s) för ljuddämpning i en given insektsarter och metoden för leverans av de motsvarande dsRNA(s) till insekten är båda av yttersta vikt. Den optimala metoden för att leverera dsRNA in en insekt måste bestämmas empiriskt, tillsammans med relativ dos valet för leverans, som vissa metoder kan erbjuda fördelar och andra begränsningar. För utvecklingen av en molekylär biopesticide som i slutändan kan vara lämplig för ESVOC, krävs en realistisk, effektiv och fördelaktig leveransmetod. Till exempel har lokalt applicerad dsRNA visat sig vara effektiv för dsRNA leverans för insektskontroll på citrus och vinrankor42,44. Innovativa strategier såsom användning av beten, sackaros lösningar, svampinfektion eller bakteriell dsRNA produktion för direkt förtäring, topikal applicering av dsRNA på växter, eller produktion av specifika dsRNAs av transgena växter, har avancerad utveckling av effektiva RNAi-baserade kontroller19,72.

Ett bra exempel är visat här med användning av gröna bönor att leverera dsRNA (figur 1 och figur 2) för att konkret påverka och minska en insekt skadegörare av global betydelse. Den nyutvecklade vegetabiliska medierad dsRNA leverans protokoll med hjälp av segment av gröna bönor nedsänkt och mättad med dsRNA har använts för att effektivt målgener specifika för larval utveckling i BMSB. Gröna bönor är en av de många grönsaker som slukas av BMSB och så dessa användes som ett medium för att leverera dsRNA. Andra medier av dsRNA leverans var testade (inga data anges) men misslyckades i att leverera näring till BMSB möjligen på grund av skillnader i vaskulär textur. Därför använde vi segment av gröna bönor för att leverera in vitro- syntetiseras dsRNA till BMSB nymfer. Nukleinsyror levereras genom en växt eller vegetabiliska medierad teknik kan potentiellt kunna inducera RNAi i insekten av val som observerats här med utarmning av JHAMT och Vg gener i BMSB (figur 2)62.

Detta vegetabiliska medierad dsRNA leverans protokoll har använts framgångsrikt att inducera RNAi inte bara i BMSB utan också i HB använder grönkål (figur 3), dock leverans strategier och metoder måste optimeras för varje gen och insekt. Det rekommenderas därför att olika metoder testas för leverans samt att rikta flera gener av intresse individuellt eller genom stapling minst två dsRNAs för att erhålla bättre fenotypiska penetrans. Flera metoder har sammanfattats för dsRNA leverans till insekter och insekt celler inklusive utfodring13,22, blötläggning73,74, Mikroskop75och andra tekniker76 används för dsRNA upptag att inducera systemisk RNAi. Nyare metoder för muntliga leverans av dsRNA inducera RNAi i andra insekter vid förtäring på behandlade icke-transgena växter har också varit utforskas (figur 4, figur 5och figur 6). Citrusträd har påvisats att absorbera dsRNAs antingen genom rötter, stam tryck (stammen injektioner), eller foliar sprayer42,44. Tidigare, citrusträd och mogen vinrankor har behandlats med insekt specifika dsRNA motsvarar AK genen i både AVS- och GWSS. Dessa behandlade växter orsakade en ökning i dödlighet för både ACP och GWSS för upp till olika längder på tiden41,45. Tillsammans visar dessa resultat att dsRNA kan hindra uttrycket av specifika gener i de studera insekterna.

Utmaningar som påverkar framgångsrika ljuddämpning av genuttryck inkluderar unika grupper av dsRNA nukleaser (dsRNases) uttryckte främst i tarmen vävnaden av insekter och saliv sekret eller gut pH som kan vara ansvariga för nedbrytningen av dsRNA47 ,77,78. Men för att övervinna sådana nedbrytning, systemisk RNAi kan induceras effektivt i insekter genom utnyttja högre koncentrationer av dsRNA använda PEG i kosten för muntliga leverans av gen-specifika dsRNA för att övervinna sådana nedbrytning62, 79. leverans och upptag av dsRNA kan också stabiliseras med hjälp av bärare molekyler, såsom nanopartiklar80 som Chitosan48, liposomer som Lipofectamine 2000 och Metafectene76, polyetylenglykol79, lera nu81och kol quantum dot50. Forskning pågår för att förbättra den effektiva leveransen av dsRNA använder agar och gel bitar infunderas med gen specifika dsRNA (data som inte visas, se kompletterande Video 4). Denna teknik kan användas för leverans av en effektiv dos av dsRNA till myrorna som kan bära den dsRNA infunderas harts eller agar till boet som mat.

Förutom stabiliteten av dsRNA är långsiktig uthållighet av dsRNA i anläggningar vävnader av betydelse, särskilt för jordbruksgrödor. dsRNA distribueras via kärlvävnader av växter, frukter eller grönsaker kan ackumuleras i xylem och floem med nedsatt enzymaktivitet före att förtäras av insekter att inducera RNAi mekanismen. Det kan vara nödvändigt för vissa program att ha dsRNA kvarstå under en kort period, såsom i 6 dagar i gröna bönor eller längre, för 36 h i den jord62,82 så att ansamling av nukleinsyror i miljön blir osannolikt. Dock Neena et al. visade att nu kunde skydda stora dsRNAs från tidig nedbrytning som samt medlar deras frisättningen på leaf ytor under en period av minst 30 dagar81.

Övergripande kunde dsRNA leverans strategier diskuteras här användas för att tysta insekt specifika gener för växtskydd. Leverans av dsRNA för växter genom bevattning, roten drench eller trunk injektion kan vara en effektiv strategi för skadedjursbekämpning insekter, såsom rot matare, som ingen effektiv kontrollmetod är för närvarande tillgänglig. Leverans av dsRNA använder en bärare eller stabilisera medium som lera eller agar kan läggas direkt till marken för upptag av växter. En av de främsta orsakerna till långsamma framstegen i utvecklingen av RNAi medierad molekylär biopesticides har varit bristen på effektiv oral leverans tekniker att inleda effektiva RNAi och stabilitet under miljöförhållanden83. Den muntliga leverans metoder som beskrivs här kan i framtiden användas för att leverera nukleinsyra medierad nedtystning behandlingar för att plantera sap utfodring samt tugga insekter för att minska insektsangrepp i globala livsmedelsproduktionen och utveckla hållbara ekologiska pest hantering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna erkänna tacksamt Donald Weber och Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) för att tillhandahålla BMSB och HB för experiment och upprätthålla kolonierna; och Maria T. Gonzalez, Salvador s. Lopez, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) och Jackie L. Metz (University of Florida, Fort Pierce, FL) för kolonin underhåll, provpreparering och analyser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMSB (H. halys) insects  USDA
ACP (D. citri) insects  USDA
organic green beans N/A
Citrus plants USDA
sodium hypochlorite solution J.T. Baker
green food coloring  McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers  Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture) Sigma
Primers  IDT DNA
SensiMix SYBR Bioline
qPCR ABI 7500 Applied Biosystems 
Spray bottle N/A
Parafilm American Can Company
TaKaRa Ex Taq Clontech
QIAquick Qiagen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoebeke, E. R., Carter, M. E. Halyomorpha halys (Stǻl)(Heteroptera: Pentatomidae): a polyphagous plant pest from Asia newly detected in North America. , (2003).
  2. Leskey, T. C., Hamilton, G. C., et al. Pest Status of the Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha Halys in the USA. Outlooks on Pest Management. 23 (5), 218-226 (2012).
  3. Peiffer, M., Felton, G. W. Insights into the Saliva of the Brown Marmorated Stink Bug Halyomorpha halys (Hemiptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (2), e88483 (2014).
  4. Anderson, B. E., Miller, J. J., Adams, D. R. Irritant contact dermatitis to the brown marmorated stink bug, Halyomorpha halys. Dermatitis : contact, atopic, occupational, drug. 23 (4), 170-172 (2012).
  5. Mertz, T. L., Jacobs, S. B., Craig, T. J., Ishmael, F. T. The brown marmorated stinkbug as a new aeroallergen. The Journal of allergy and clinical immunology. 130 (4), 999-1001 (2012).
  6. McClean, A. P. D., Schwarz, R. E. Greening or blotchy-mottle disease of citrus. Phytophylactica. 2 (3), 177-194 (2012).
  7. Bové, J. M. Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
  8. Kuhar, T., Morrison, R., Leskey, T., Aigner, J. Integrated pest management for brown marmorated stink bug in vegetables. , (2016).
  9. Tiwari, S., Mann, R. S., Rogers, M. E., Stelinski, L. L. Insecticide resistance in field populations of Asian citrus psyllid in Florida. Pest management science. 67 (10), 1258-1268 (2011).
  10. Baum, J. A., Bogaert, T., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nature Biotechnology. 25 (11), 1322-1326 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418 (6894), 244-251 (2002).
  12. Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  13. Macrae, I. J., Zhou, K., et al. Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science(New York, N.Y.). 311 (5758), 195-198 (2006).
  14. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., Hannon, G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 (6818), 363-366 (2001).
  15. Ketting, R. F., Fischer, S. E., Bernstein, E., Sijen, T., Hannon, G. J., Plasterk, R. H. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes & development. 15 (20), 2654-2659 (2001).
  16. Agrawal, N., Dasaradhi, P. V. N., Mohmmed, A., Malhotra, P., Bhatnagar, R. K., Mukherjee, S. K. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 67 (4), 657-685 (2003).
  17. Martinez, J., Patkaniowska, A., Urlaub, H., Lührmann, R., Tuschl, T. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell. 110 (5), 563-574 (2002).
  18. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  19. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
  20. Clemens, J. C., Worby, C. A., et al. Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6499-6503 (2000).
  21. Saleh, M. C., van Rij, R. P., et al. The endocytic pathway mediates cell entry of dsRNA to induce RNAi silencing. Nature cell biology. 8 (8), 793-802 (2006).
  22. Amdam, G. V., Simões, Z. L. P., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC biotechnology. 3, 1 (2003).
  23. Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (11), 824-832 (2009).
  24. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 227-235 (2010).
  25. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  26. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
  27. Gatehouse, H. S., Gatehouse, L. N., Malone, L. A. Amylase activity in honey bee hypopharyngeal glands reduced by RNA interference. Journal of Apicultural. , (2004).
  28. Jaubert-Possamai, S., Le Trionnaire, G., Bonhomme, J., Christophides, G. K., Rispe, C., Tagu, D. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC biotechnology. 7, 63 (2007).
  29. Martín, D., Maestro, O., Cruz, J., Mané-Padrós, D., Bellés, X. RNAi studies reveal a conserved role for RXR in molting in the cockroach Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 52 (4), 410-416 (2006).
  30. Bansal, R., Mittapelly, P., Chen, Y., Mamidala, P., Zhao, C., Michel, A. Quantitative RT-PCR Gene Evaluation and RNA Interference in the Brown Marmorated Stink Bug. PloS one. 11 (5), e0152730 (2016).
  31. Terenius, O., Papanicolaou, A., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57 (2), 231-245 (2011).
  32. Sparks, M. E., Shelby, K. S., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Invasive Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha halys (Stål) (Heteroptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (11), e111646 (2014).
  33. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science (New York, N.Y.). 282 (5388), 430-431 (1998).
  34. Baum, J. A., Roberts, J. K. Chapter Five - Progress Towards RNAi-Mediated Insect Pest Management. Insect Midgut and Insecticidal Proteins. 47, 249-295 (2014).
  35. Walshe, D. P., Lehane, S. M., Lehane, M. J., Haines, L. R. Prolonged gene knockdown in the tsetse fly Glossina by feeding double stranded RNA. Insect Molecular Biology. 18 (1), 11-19 (2009).
  36. Turner, C. T., Davy, M. W., MacDiarmid, R. M., Plummer, K. M., Birch, N. P., Newcomb, R. D. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Molecular Biology. 15 (3), 383-391 (2006).
  37. Bautista, M. A. M., Miyata, T., Miura, K., Tanaka, T. RNA interference-mediated knockdown of a cytochrome P450, CYP6BG1, from the diamondback moth, Plutella xylostella, reduces larval resistance to permethrin. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (1), 38-46 (2009).
  38. Maori, E., Paldi, N., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with Colony Collapse Disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
  39. Hunter, W., Ellis, J., Hayes, J., Westervelt, D., Glick, E. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), e1001160 (2010).
  40. Christiaens, O., Smagghe, G. The challenge of RNAi-mediated control of hemipterans. Current Opinion in Insect Science. 6, 15-21 (2014).
  41. Hunter, W. B., Hail, D., Tipping, C., Paldi, N. RNA interference to reduce sharpshooters, the glassy-winged sharpshooter, and the Asian citrus psyllid. Symposium. , 24-27 (2010).
  42. Hunter, W. B., Glick, E., Paldi, N., Bextine, B. R. Advances in RNA interference: dsRNA treatment in trees and grapevines for insect pest suppression. Southwestern Entomologist. , (2012).
  43. Hail, D. A., Dowd, S., Hunter, W. H., Bextine, B. R. Investigating the transcriptome of the potato psyllid (Bactericera cockerelli): toward an RNAi based management strategy. Proceed. 10th Annual Zebra Chip Reporting Session, San Antonio TX, , 183-186 (2010).
  44. de Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNA Interference-Natural Gene-Based Technology for Highly Specific Pest Control (HiSPeC). RNA INTERFERENCE. , (2016).
  45. Taning, C. N. T., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian Citrus Psyllid RNAi Pathway - RNAi evidence. Scientific reports. 6, 38082 (2016).
  46. Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNAi feeding bioassay: development of a non-transgenic approach to control Asian citrus psyllid and other hemipterans. Entomologia Experimentalis et Applicata. 162 (3), 389-396 (2017).
  47. Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi Efficiency, Systemic Properties, and Novel Delivery Methods for Pest Insect Control: What We Know So Far. Frontiers in physiology. 7, 553 (2016).
  48. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Molecular Biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  49. Li-Byarlay, H., Li, Y., et al. RNA interference knockdown of DNA methyl-transferase 3 affects gene alternative splicing in the honey bee. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12750-12755 (2013).
  50. Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, Carbon Quantum Dot, and Silica Nanoparticle Mediated dsRNA Delivery for Gene Silencing in Aedes aegypti: A Comparative Analysis. ACS applied materials & interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
  51. Nimesh, S. Recent patents in siRNA delivery employing nanoparticles as delivery vectors. Recent patents on DNA & gene sequences. 6 (2), 91-97 (2012).
  52. Draz, M. S., Fang, B. A., et al. Nanoparticle-mediated systemic delivery of siRNA for treatment of cancers and viral infections. Theranostics. 4 (9), 872-892 (2014).
  53. Swevers, L., Raikhel, A. S., Sappington, T. W. Vitellogenesis and post-vitellogenic maturation of the insect ovarian follicle. Comprehensive. , (2005).
  54. Tufail, M., Takeda, M. Molecular characteristics of insect vitellogenins. Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).
  55. Hagedorn, H. H., Kunkel, J. G. Vitellogenin and vitellin in insects. Annual review of entomology. , (1979).
  56. Brandt, B. W., Zwaan, B. J., Beekman, M. Shuttling between species for pathways of lifespan regulation: a central role for the vitellogenin gene family? Bioessays. , (2005).
  57. Murphy, C. T., McCarroll, S. A., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  58. Shinoda, T., Itoyama, K. Juvenile hormone acid methyltransferase: a key regulatory enzyme for insect metamorphosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 11986-11991 (2003).
  59. Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual review of entomology. 55, 111-128 (2010).
  60. Nouzova, M., Edwards, M. J., Mayoral, J. G., Noriega, F. G. A coordinated expression of biosynthetic enzymes controls the flux of juvenile hormone precursors in the corpora allata of mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 41 (9), 660-669 (2011).
  61. Huang, J., Marchal, E., Hult, E. F., Tobe, S. S. Characterization of the juvenile hormone pathway in the viviparous cockroach, Diploptera punctata. PloS one. 10 (2), e0117291 (2015).
  62. Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA delivery system for plant-sap-feeding insects. PloS one. 12 (2), e0171861 (2017).
  63. Khrimian, A., Zhang, A., et al. Discovery of the aggregation pheromone of the brown marmorated stink bug (Halyomorpha halys) through the creation of stereoisomeric libraries of 1-bisabolen-3-ols. Journal of natural products. 77 (7), 1708-1717 (2014).
  64. Hall, D. G., Richardson, M. L., El-Desouky, A., Halbert, S. E. Asian citrus psyllid, Diaphorina citri, vector of citrus huanglongbing disease. Entomologia Experimentalis et Applicata. 146 (2), 207-223 (2012).
  65. Murphy, K. A., Tabuloc, C. A., Cervantes, K. R., Chiu, J. C. Ingestion of genetically modified yeast symbiont reduces fitness of an insect pest via RNA interference. Scientific reports. 6, 22587 (2016).
  66. San Miguel,, K,, Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest management science. 72 (4), 801-809 (2016).
  67. Li, H., Guan, R., Guo, H., Miao, X. New insights into an RNAi approach for plant defence against piercing-sucking and stem-borer insect pests. Plant, cell & environment. 38 (11), 2277-2285 (2015).
  68. Hull, D., Timmons, L. Methods for delivery of double-stranded RNA into Caenorhabditis elegans. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 265, 23-58 (2004).
  69. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  70. Burand, J. P., Hunter, W. B. RNAi: future in insect management. Journal of Invertebrate Pathology. 112 Suppl, S68-S74 (2013).
  71. Rodrigues, T. B., Figueira, A. Management of Insect Pest by RNAi-A New Tool for Crop Protection. , (2016).
  72. Baumann, A. M. T., Bakkers, M. J. G., et al. 9-O-Acetylation of sialic acids is catalysed by CASD1 via a covalent acetyl-enzyme intermediate. Nature communications. 6, 7673 (2015).
  73. Araujo, R. N., Santos, A., Pinto, F. S., Gontijo, N. F., Lehane, M. J., Pereira, M. H. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect biochemistry and molecular biology. 36 (9), 683-693 (2006).
  74. Wuriyanghan, H., Rosa, C., Falk, B. W. Oral Delivery of Double-Stranded RNAs and siRNAs Induces RNAi Effects in the Potato/Tomato Psyllid, Bactericerca cockerelli. PloS one. 6 (11), e27736 (2011).
  75. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 30 (4), 313-321 (2003).
  76. Yu, N., Christiaens, O., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions). Insect Science. , (2012).
  77. Allen, M. L., Walker, W. B. Saliva of Lygus lineolaris digests double stranded ribonucleic acids. Journal of Insect Physiology. 58 (3), 391-396 (2012).
  78. Wynant, N., Santos, D., Verdonck, R., Spit, J., Van Wielendaele, P., Vanden Broeck, J. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect biochemistry and molecular biology. 46, 1-8 (2014).
  79. Ghosh, S. K. B., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA-mediated RNA interference through feeding in larval gypsy moth, Lymantria dispar (Lepidoptera: Erebidae). European Journal of Entomology. 114, 170-178 (2017).
  80. Baigude, H., Rana, T. M. Delivery of therapeutic RNAi by nanovehicles. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 10 (15), 2449-2454 (2009).
  81. Mitter, N., Worrall, E. A., et al. Clay nanosheets for topical delivery of RNAi for sustained protection against plant viruses. Nature plants. 3, 16207 (2017).
  82. Dubelman, S., Fischer, J., et al. Environmental fate of double-stranded RNA in agricultural soils. PloS one. 9 (3), e93155 (2014).
  83. Kola, V. S. R., Renuka, P., Madhav, M. S., Mangrauthia, S. K. Key enzymes and proteins of crop insects as candidate for RNAi based gene silencing. Frontiers in physiology. 6, 119 (2015).

Tags

Miljövetenskap fråga 135 leverans brun marmorated bärfisen Asiatiska citrus psyllid RNA-interferens förtäring Hemiptera
Dubbelsträngat RNA Oral leveransmetoder att framkalla RNA-interferens i floem och växt-sap-utfodring Ditropis insekter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B.,… More

Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects. J. Vis. Exp. (135), e57390, doi:10.3791/57390 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter