Summary
Bu çalışmada domuz yavruları. vivo nörotransmitter etkinliğini izlemek için elektrot enzim tabanlı dizi (MEA) teknoloji romanı kullanımı araştırıyor Hipotez o Glutamat bozukluk anestezik nörotoksisite mekanizmasına katkıda olduğunu. Burada, MEA teknoloji anestezi kaynaklı nörotoksisite mekanizması çalışmaya uyum için bir protokol mevcut.
Abstract
Her yıl milyonlarca çocuk anestezi çok sayıda yordamlar için tabi. Ancak, insan ve hayvanlar çalışmalarda soru içine anestezi anestezi beyin geliştirme için potansiyel olarak zehirli olarak göstermek için çocuklarda Emanet çağrıda bulundular. Bugüne kadar hiçbir çalışmalar başarıyla mechanism(s) aydınlatılmamıştır hangi anestezi tarafından sinir hücrelerini tahrip olabilir. Hayvan çalışmaları bu tür mekanizmalar incelenmesi izin ve yenidoğan domuz yavruları bu etkileri nedeniyle kendi çarpıcı gelişimsel benzerlikler insan beyni için eğitim için mükemmel bir model temsil eder.
Bu iletişim kuralı elektrot enzim tabanlı dizi (MEA) teknoloji kullanımı anestezi kaynaklı nörotoksisite (değil) mechanism(s) eğitim için yeni bir yol olarak uyum sağlar. Bana gerçek zamanlı vivo nörotransmitter etkinliğini izlemeye etkinleştirin ve olağanüstü zamansal ve mekansal çözünürlüğü sunar. Anestezik nörotoksisite kısmen Glutamat bozukluk tarafından neden olduğu ve ölçü Glutamat ölçmek için bir yöntem sağlar onaylanmadığına karar. MEA teknoloji bir domuz yavrusu modelindeki roman uygulanması AIN incelenmesi için eşsiz bir fırsat sunuyor.
Introduction
Her yıl milyonlarca çocuk anestezi Amerika Birleşik Devletleri1' deki invaziv ve non-invaziv yordamları için tabi. Yıllardır, anestezi sağlayıcıları anestezikler, küçük çocuklar ve Yenidoğan Bebeklerin içinde bile emanet ebeveynlerinin güvence verdi. Ancak, 1999 yılında bu geçici bulundu N-metil-D-Aspartat (NMDA) alt türü ilk yılları sırasında Glutamat reseptörlerinin tıkanması fareler2' yaygın nöronal apoptoz neden olabilir. Son zamanlarda, genel anestezi ve 3 yaşından küçük çocuk gelişmekte olan beyin potansiyel olumsuz etkileri hakkında bir uyarı eklemek anestezik ilaçların etiketlerini gerektirecektir bir uyuşturucu Emanet iletişim FDA yayımlanan (u. s. gıda ve İlaç İdaresi, 2017). Ancak, hala mümkün mekanizmaları ve potansiyel nöroprotektif önlemleri aydınlatmak için gerek yoktur.
Nörotransmitter Glutamat ve gamma amino bütirik asit (GABA) gibi normal aktiviteye normal açıkların gerçekleşmesi kritiktir. AIN içinde yer alan yolları çoğu hala zor olmakla birlikte, sinir sistemleri çok anestezi bilinçsizlik üretmek için bu yolları modüle bilinen bu yana söz konusu muhtemeldir. Özellikle, faaliyete dysregulated olduğunda eksitatör nörotransmitter Glutamat excitotoxicity neden olur. Bu nörotransmitter normalde neurogenesis, nöral plastisite, sinaptik ve sinir büyüme ve diğer kritik düzeyde önemli beyin fonksiyonları bir dizi ilgilenmektedir. Ancak, uzun süreli Glutamat reseptörlerinin aktivasyonu excitotoxicity ve özellikle cerrahi, oksijen yetmezliği ve düşük enerji durumu3gibi stres koşullarında nöronal apoptoz neden olabilir. Glutamat NMDA için bağlama reseptör+ Na ve Cl− akını neden olduğu gösterilmiştir. Sonraki depolarizasyon Ca2 + kanal açılışına yol düşünülen ve serbest bırakmak-in hücre içi Ca2 + 4depolar. Bu işlev bozukluğu muhtemelen sonunda nöronal yayılması azaltmak inflamasyon artırmak ve nöronal ölüme yol metabolik dengesizliğini bir çağlayan yol açar. Bu hipotezler rağmen gerçek mechanism(s) Ain belirsiz5kalır. Apoptozis rolü nedeniyle, Glutamat bozukluk önceden belgelenen nöronal apoptoz, bir özellik Ain mekanizması için katkıda bulunabilir bir roman yolu temsil eder.
Nöronal işlemler çalışma engelleri nöronal geliştirme ortamında özellikle onların yüksek karmaşıklık biridir. Yaşamın ilk birkaç ay yaralanma, nöronal gelişim fizyolojik apoptosis (nöronal budama) gibi önemli adımları hangi lerin maksimum güvenlik açığı döneminde, synaptogenesis, gliogenesis ve myelination yer6 alın . Nöronal iletişim karmaşık doğası ve bu işlemlerin normal CNS işlevini bozmadan eğitim zorluğu göz önüne alındığında, yeni teknolojilerin hangi vivo algılama ve miktar önemli unsurlardan amacı geliştirilmiştir nöronal iletişim.
Enzim bağlı MEA teknoloji bu çalışmada AIN mekanizmaları bir klinik olarak ilgili piglet modeli eğitim için yeni bir yol olarak kullanılmıştır. Bu teknoloji karmaşık vivo içinde elektrokimyasal beyin süreçleri Glutamat bozukluk da dahil olmak üzere, çalışma için kullanılabilir. (2 Glutamat duyarlı siteleri ve 2 nöbetçi siteleri) ölçü dahil 4 kanallı Platin kayıt siteleri izin kendi kendine referans, hangi algılama doğruluk için katkıda bulunur. Ayrıca, bir dışlama katmanı elektroda için uygulanır,7olmaktan sokan diğer molekülleri önleme tarafından saldırıyı seçicilik algılandı. Ayrıca, önceki teknolojileri ile karşılaştırıldığında en az doku travması için MEA düşük profilli tasarımı sağlar. Bu aynı özellik için ölçü mikroskopik beyin bölgelerinde çalışma kolaylaştırır bir daha yüksek Uzaysal çözünürlük confers. Örneğin, Hipokampus (dentat gyrus, CA1, CA2) sahip ayrı bölge özellikle okudu8olabilir. Guinan işlevselliğini belirli ayrıntılara yukarıda açıklanan9olmuştur.
İle karşılaştırıldığında MEA elektrokimya, faiz çözüm arasında yerleştirilmiş bir membran microdialysis birleştirmek ve benzer kompozisyon, ekstraselüler sıvı olarak algılanmasını sağlayan bir çözüm10değiştirir. Microdialysis nörokimyasal bir dayanak ve uzun nörotransmitter tespiti için kullanılmış olsa da, düşük zaman çözünürlüğü, Glutamat değişim ve önemli doku travması11gecikmeli algılama dezavantajı vardır.
Guinan dolaylı olarak nörotransmiterler Glutamat, asetilkolin ve Kolin, gibi H2O2 veya O212,13 electroactive muhabir moleküllerin üretmek uygun oksidaz enzimler kullanarak algılayabilirsiniz .
MEA teknoloji yaygın sıçan ve insan dışı primatlar nörotoksisite AIN7,14dışındaki patofizyolojik işlemler bağlamında incelenmesi için kullanılmıştır. Bazı bu patofizyolojik süreçlerin arasında MEA teknoloji Alzheimer hastalığı, epilepsi, travmatik beyin hasarı ve farmakolojik bileşikler etkisi sinaptik iletişim8,15 çalışma için kullanılan , 16 , 17. her ne kadar beni bu patolojiler sıçan ve insan dışı primatlar eğitim için kullanılan, yüksek gelişimsel benzerliği piglet beyin ve insanlar arasındaki MEA teknoloji adaptasyonu domuzcuklar içinde çalışma için son derece uygun bir teknik yapar AIN mechanism(s)18.
Protocol
Domuz yavruları (Sus scrofa) Ohio Devlet Üniversitesi (OSU) kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından önceden onaylanmış yerel bir çiftlik aracılığıyla alınır. Onay iletişim kuralının hayvan Hollow'a IACUC ilkesi uyarınca yapılır.
1. domuz yavruları ve Piglet işleme
- Erkek ve dişi domuz yavruları herhangi bir potansiyel seks tabanlı kaynaklanan varış yönergeleri19uygun olarak ortadan kaldırmak için sistematik ve randomize bir şekilde kullanmak.
Not: maksimal beyin büyüme döneminde 3-5 gün içinde domuz yavrusu doğum olduğu için sizi ile domuzlar sadece 3-5 günlük deneme yapılır. - Vivaryum en az 24 s deneme calıştıkları çevre için izin vermek için önce domuz yavruları gelmek emin olun.
Not: Eğitimli hayvan hastalıklarıyla ilgili personelin rutin hayvan bakımı sağlar. Domuz yavruları ayrı ayrı sıcaklık muhafaza, sürekli izlenen kafeslerde tutulur ve hipoglisemi önlemek için bir süt beslenme tamamlamak replacer ad libitum alırsınız. Domuz yavruları de süt yedek (os başına sıfır), en az 3 h önce anestezi için saklanır ve battaniye ve stimülasyon normal düzeyde sağlamak için oyuncaklar ile sağlanır. Mümkünse, birden çok domuz yavruları sosyalleşme izin vermek için aynı kafeste tutma.
2. Kalkınma ve ölçü özelleştirme Piglet manken AIN Araştırmaları
Not: Bu enzim ile ön kaplamalı ve m-boya dihydrochloride (mPD) alaşımlı enzim tabanlı bana bu teknoloji kullanır. Elektrotlar bir 40 mm katı şaft ile tasarlanmış ve domuz yavruları (şekil 1) kullanım için üretilen özel edildi.
- Artıklık önlemek için lütfen bana hazırlık ve Kalibrasyon ayrıntılı açıklaması daha önce15 (Şekil 2) açıklandığı gibi bakın.
3. anestezi ve özel stereotaksik cihaz kullanım Piglet için
- Bir anestezi iş istasyonu ile uygun bir vantilatör kullanarak ve cihazları izleme hayvanları anestezi ve izlemek Nabız oksimetri, non-invaziv kan basıncı, Elektrokardiyografi ve sıcaklık boyunca gibi fizyolojik parametreler tamamen deneme daha önce19açıklandığı gibi. Entübasyon ve domuz yavruları havalandırmak ve sevoflurane anestezi 1 minimum alveoler konsantrasyon (MAC) (yaklaşık 2,5-%3), 3,5 h. üyeleridir eğitimli laboratuvar personeli bu deneyler için mevcut sağlamak için yönetmek. Cerrahi alan örten kürk deri hazırlanması önce elektrik makası kullanarak kaldırılır.
Not: Konsantrasyon ve kullanılan anestezi süresi fiili anestezi pozlama süresi uzunluğu bir cerrahi işlem sırasında benzetimini yapmak deneme sağlar. Ayrıca, sevoflurane en yaygın genel anestezi son derece önemlidir onun Emanet çevreleyen soruşturma yapma Pediatrik popülasyonda kullanılan biridir. - Stereotaksik çerçeveye yerleştirme önce 2.5 mg/kg doz ve infüzyon 1.5 mg/kg yükleme bir rocuronium başlamak/s çerçevede güvenli iken hayvan hareket önlemek için.
- Yeterli bir anestezi derinliği toe-çimdik tarafından onaylandıktan sonra piglet domuz yavrusu özgü stereotaksik çerçevesine yerleştirin.
- Stereotaksik çerçevesi içinde yeterli padding ek doldurma (örneğin, Akışkan Pozisyoner) yatak yaralarını önlemek için zorla-hava ısınma paneliyle piglet yerleştirerek sağlar.
- Üst çene dişleri diş üzerinde yer bar (şekil 3).
Not: Diş bar kafatası çok sıkıca tutmak için yeterli düzeyde olmalıdır. - Düzeltmek ve delici kulak çubuklarını piglet orta hat konumda olduğundan emin olmak için dikkat çekici kulakları içinde sıkın. Lateral sivri uçları tutan kulak kanalı ve kulak kulak zarı penetrasyon ile ilişkili "pop" sesi duymak için yeterince sıkıca barlar Ekle içinde konum. Sıkıca kafatası kulak çubuklarını eklemek ve hareket kafatası (şekil 4Panel A) deneme sırasında önlemek için her iki tarafında eşit derinlik için ekleyin.
Not: Piglet sıcak tutmak hayati önem taşımaktadır (~ 37.8-38,6 ° C) ve sürekli bakım normothermia için bütün prosedür sırasında sıcaklık monitör. Bu başarılı üzerinden bir battaniye ve/veya a ısı lamba olabilir. Hayvanın derisi yanan önlemek için uygun bir mesafede ısı lamba yerleştirdiğinizden emin olun.
- 4-6 cm Ensizyon neşteri ile kafatası puanlama önlemek için dikkatli kullanarak kafatası boyunca oluşturun. Belgili tanımlık kesme yapıldıktan sonra nazik tekzip ve künt diseksiyon kafa derisi kafatasından birisini seçmek için kullanın. Herhangi bir bağ dokusu kaldırmak ve dikiş hatları (şekil 4Masası B) maruz bir gazlı bez pad ile kafatası yavaşça kaydırın.
Not: Kısırlık sigara hayatta kalma deneyler sırasında korumak için gerekli değildir. Ancak, kısırlık hayatta kalma deneyler sırasında muhafaza edilmelidir. - Daha fazla kafa derisi, gerekirse, ilgi alanı ortaya çıkarmak ve kranyotomi (şekil 5Panel A) amaçlanan konumunu belirlemek yansıtır. Yaklaşık 0.25 cm2 (-ebilmek var olmak daha büyük veya daha küçük deneysel hedeflerine bağlı olarak) bir kranyotomi pencere oluşturmak için bir cerrahi matkap kullanmak ilgi, beyin zarı veya alttaki beyin (şekil 5 incitmek değil dikkatli kullanarak yapısını örten , Panel B). Beyin dokusu (şekil 5Panel C) örten dura tüketim için iyi Cerrahi makas kullanın.
- Elektrot olarak dikey olarak piglet stereotax micromanipulator için headstage metal kol güvence tarafından bregma üzerinde konumlandırın. Kafatası yüzeyine dokunmadan elektrot mümkün olduğu kadar düşük. Bregma (şekil 6Panel A) koordinatlarını kaydedin.
- Medial-lateral ve anterior posterior belirlemek bregma için ilişkili oldukları sürece faiz yapısını derinlik yanı sıra koordine eder. Bir tür ve yaşına uygun stereotaksik atlas kullanarak stereotaksik koordinatları belirleyin. Bu durumda, özellikle domuz yavruları20için geliştirilen bir stereotaksik atlas kullanın.
- Uygun ön-arka ve medial-lateral yerleşim, elektrot ve aparatı yüzeye dik sağlama içerir elektrot yeniden konumlandırın. Sahte referans elektrot (şekil 6Masası B) hayvan ile temas sağlamak kafa derisi altında yerleştirin.
- Yavaş ve nazikçe, uygun derinlik için elektrot stereotaksik kol kullanarak beynine indirin. Son 2 mm için daha fazla sürücü elektrot için hidrolik microdrive kesin konumuna (şekil 6Panel C) kullanın.
Not: Elektrot pozisyon kranyotomi pencere kaplamasını. Elektrot derinliği faiz beyin yapısına bağlı olarak değişir. İnsizyon olmayan hayatta kalma deneylerde veri toplamasının tamamlanmasından sonra kapatmak gerekli değildir.
4. Sevoflurane anestezi altında ekstraselüler Glutamat ölçümü
- Altında sürekli fizyolojik bu yordamı tamamı izlenmesi domuzcuk olduğundan emin olun. Domuz yavruları inhalationally (yüz koni) yordamı için hazırlık anestezi.
- MEA implantasyonu sonra elektrot doğru ölçüm 3 h (Şekil 7) elde edilir sağlamak için temel ulaşmak izin vermek için 30 dk bekle.
- % 0.25 bupivacaine (1 mL/kg) subkutan ameliyat ameliyat sonrası ağrı yönetimi için yerinde yönetilir. Buna ek olarak, sürekli yayın buprenorfin subkutan gerektiği gibi q72h verilir.
5. perfüzyon ve kurban
- Perfüzyon ve beyin dokusu koleksiyonu yordamları yukarıda açıklanan21gerçekleştirmek. Hayatta kalma ameliyatları için hayvan are euthanized hemen sonra ise genel anestezi altında hala deneme.
- Brüt kesit sabit piglet beynin alın ve ışık mikroskobu elektrot kavramını MEA yerleştirme, ilgi alanında uygun yerleştirme sağlanması doğrulanmasına izin vermek için önceden açıklanan22 görselleştirmek için kullanın.
Representative Results
Bu prototip, çalışma ile enzim tabanlı seramik MEA teknoloji bir domuz yavrusu modelindeki AIN temel Glutamat dynamics olağanüstü içgörü sağlayabilir. Bu çalışmada daha fazla enzim-esaslı MEA teknoloji başarıyla piglet modeli nörotransmitter etkinliğinde yüksek hassasiyetle ve yüksek kayma ve temporal fizyolojik ve anestezi ilişkili değişiklikleri ölçmek için adapte edilebilir gösterir Çözünürlük. Fizyolojik homeostazı klinik yöntemleri ve Standartlar kullanılarak deneylerimiz devam edildi ve fizyolojik tedirginlikler belirtileri yok piglet sergiledi.
Elde edilen veriler bana kesin ve dağınık şekilde kortikal ve alt kortikal beyin yapıları ölçümlerde nörotransmitter gidermek yeteneği gösterir. Stereotaksik aparatı kullanın piglet boyutu ve anatomi bireysel farklılıkları ne olursa olsun sürekli faiz, bölgenin bulmak için bir başvuru yüzey yapısı (bregma) açık kimliği sağlar. Dikiş Açık görselleştirme MEA tutarlı bölgesel yerleşimini ölçüm aralığı (şekil 4) doğruluk ile kolaylaştırır. Beynin kortikal yüzeyi erişim sağlamasını herhangi bir vivo içinde Glutamat dynamics kasıtsız sistemik veya yerel hakaret nedeniyle (şekil 5) sağlayarak önemsiz kanama ile en az travmatik olduğunu. Özel, katı MEA sonra hizalanır piglet (şekil 6) ön boyutunda dik. Başarısızlık MEA ekleme önce düzgün hizalamak için özellikle subcortical bölgeler için hedeflenen bölgeye doğru kayma kayıt engelleyebilir.
Gerçek zamanlı vivo Glutamat ölçümler 3-4 günlük eski domuz yavruları hippocampi alınmıştır (n = 4) altında % 2.5-3 sevoflurane anestezi (yaklaşık 1 MAC). Amperometry ölçümler 4 Hz'de kaydedilen ve konsantrasyon (şekil 8Panel A) kalibrasyon parametreleri temel alınarak bir doğrusal regresyon kullanılarak dönüştürülür. Her zaman noktası için düzeltilmiş Glutamat sinyal vermeye ortalama sentinel sinyal çıkarılmadan önceki iki Glutamat duyarlı sitelerden sinyalleri ortalama. Bu sürekli ölçümler genel eğilim (şekil 8Masası B) Zaman içinde daha iyi görmek için bir hareketli ortalama uygulayarak düzeltti. Ortalama Bazal Glutamat konsantrasyonu 4,61 ± 0,02 µM olarak hesaplanır ve anestezik pozlama boyunca nispeten sabit kalmıştır. Geçici glutamatergic aktivite sentinel sinyal ile ilişkili değil sinyal Peaks'e analiz ederek bir hayvan tespit (R2 < 0.5) ve bir sinyal-gürültü oranı 3 (Şekil 9Panel A) aşıldı. Toplam 116 geçici zirvesinin 3,5 h (şekil 10Panel A) bir süre içinde algılandı. Elde edilen geçici pik genlik genellikle 1 µM (şekil 10Masası B) aralığında olmak gözlendi. Her geçici süresini ölçmek için % 80 çürümeye her maksimum en yüksek değer için gereken süre (t80) (Şekil 9Masası B) elde edildi. Tüm Glutamat geçişler 3,5 saat kayıt süresi boyunca ortalama t80 4,68 ± 0,82 s (şekil 10Panel C) yapıldı. Bu veriler doğru imzalat piglet beyin subcortical bir bölgede her iki uzun süreli ve geçici nörotransmitter etkinliği ölçmek mümkün olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: görsel SG-2 elektrot dizi türleri karşılaştırılması. SG-2 dizileri iki Glutamat duyarlı site ve iki Glutamat-duyarlı sentinel site (site başına 150 µm x 20 µm) içerir. (A) esnek şaft elektrot dizi sol tarafta gösterilir. Şaft katı elektrot dizi büyük hayvanlar domuz yavruları ve izinleri daha derin implantasyonu olarak kullanılmak üzere özel olarak tasarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: elektrot dizi hazırlık ve Kalibrasyon işlemine genel bakış. Toplam MEA hazırlık ve Kalibrasyon yaklaşık bir hafta son. Kaplama enzim, dışlama katmanı ve Kalibrasyon analitler faiz nörotransmitter için özeldir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: piglet stereotaksik aparatı olarak yerleşimini. Piglet ağız ağız çubuğu üzerinde köpek dişleri doğrudan arka yerleştirilir. Delici kulak çubuklarını kulak kafatasının arka uç güvenliğini sağlamak için kanallar eklenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: piglet stereotaksik cihazları kranyotomi için yerleşimi. (A) domuz yavrusu'nın kafası sıkıca MEA tutarlı yerleşimini sağlanması özel stereotaksik çerçeveye altına alınır. Delici kulak çubuklarının eşit uzaklıkta yerleşim görülür. (B) ön-arka Ensizyon kafa derisi boyunca. Kafatası puanlama koronal ve sagittal dikiş görselleştirmek ve görsel bregma olarak en iyi duruma getirmek için kaçınılmalıdır. Ölçek çubuğu belgili tanımlık kesme göreli boyutunu ve kranyotomi pencere konumunu belirtmek için gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: erişim için hipokampüs kranyotomi. (A) kafa derisi daha da yansıyan MEA ekleme stereotaksik koordinatları göre yaklaşık konumunu göstermek için. Daire içinde alan (siyah nokta) kranyotomi rehberlik için işaretlenir. (B) kafatası ile kranyotomi pencere (0.25 cm2) kapak alttaki dura mater ortaya çıkarmak için kaldırıldı. (C) meninkslerde yüzeysel serebral korteks doku travması olmadan ortaya çıkarmak için dikkatli bir şekilde kaldırıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: MEA konumlandırma ve Hipokampus içine ekleme. (A)yerleşim, Hipokampus göre stereotaksik konumunu belirlemek için MEA adlı bregma. (B) Hipokampus ekleme derinliğini belirlemek için MEA beyin yüzeyinde stereotaksik yerleşimi. Gümüş sahte referans elektrot güvenli bir şekilde (okla gösterilen) kafa derisi altında yer. (C) MEA gerçek zamanlı, elde etmek için uygun derinlikte vivo içinde ekstraselüler Glutamat ölçümleri Hipokampus içinde takılı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: 30-dk baselining dönemde MEA davranış. İlk hızlı artış MEA iniş için micromanipulator kullanarak Hipokampus karşılık gelir. Bana uygun derinlik (noktalı çizgi) ulaşmış bir kez temel süresi başlar. Ekstraselüler Glutamat ölçümler bir 30 dk boyunca azalacak ve fizyolojik okuma yorumlanmalıdır değil. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: hippocampus gerçek zamanlı ekstraselüler Glutamat ölçümlerde yenidoğan domuz sevoflurane anestezi altında. (HareketA) ortalaması (10 veri noktalarını kullanarak) sevoflurane anestezi altında bir yenidoğan domuz Glutamat konsantrasyonu oluşur içinde. Ölçümleri 4 Hz 3 h için bir kısa 30 dk baselining süre sonra çekildi. (B) yumuşatma Glutamat ölçümler 100 puan her 15 dakikada bir hareketli ortalama eğilim daha iyi görmek için kullanma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9: hippocampus sevoflurane anestezi altında yenidoğan domuz bir geçici Glutamat faaliyetinin tanımlaması. (A)geçici Glutamat Peaks'e (kırmızı) gerçek zamanlı Glutamat izleme üzerinde gösterilir. Zirveleri kabul önemli sinyal gürültü oranı 3 aşıldı ve onların sinyal sentinel sinyal ile ilişkili değil (R2 < 0.5). (B) A temsilcisi geçici tepe Şekil 9Panel Atespit. Noktalı çizgiler % 80 çürümeye zirve için gerekli toplam süresini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 10: hippocampus sevoflurane anestezi altında yenidoğan domuz bir Glutamat geçişler karakterizasyonu. (A) A geçici Glutamat doruklarına 15dk depo gözlerindeki sayısı. Zirveleri kabul önemli sinyal gürültü oranı 3 aşıldı ve onların sinyal sentinel sinyal ile ilişkili değil (R2 < 0.5). (B) geçici Glutamat genliği tepeler. Hata çubukları ortalama standart hatasını gösterir. (C) demek T80 geçici Glutamat doruklarına. Hata çubukları ortalama standart hatasını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Deneme başından itibaren piglet's fizyolojik homeostazı bu laboratuar önceki yayın21' açıklandığı gibi muhafaza edilmelidir. En az izleme Nabız oksimetri, Elektrokardiyografi, capnography, non-invaziv kan basıncı ve sıcaklığı içermelidir. Eğitilmiş müfettişler fizyolojik tedirginlikler (örneğin, hipo/hipertermi, hipoksi, hipotansiyon, ritim bozukluğu) uygun şekilde düzeltilmesi gereklidir.
İndüksiyon öncesi, vitro MEA kalibrasyonlar işlevsellik ve bilinen koşullar altında MEA selectivity kurmak için gerçekleştirilir. Kalibrasyon ve kaplama Guinan, teknolojinin etkili kullanımı için önemlidir. Kalibrasyon sırasında meydana gelebilecek birçok olası hataları vardır. Kalibrasyon yanı sıra yanlış interferent yanıt-e doğru uzanan uygunsuz kaplama, bu sorunları teşhis edebilirim. Bana yanıt olarak ortaya çıkabilecek hataları daha ayrıntılı tablo hesabını derlenmiş, boyunca önemli nedenleri ve önerilen çözümler, hangi büyük olasılıkla (Tablo 1) sorun giderme için yararlı bir araç olduğunu kabul etmelisin. Kalibrasyon ve kaplama öncesi cam referans elektrot hava kabarcıkları veya beyaz renk değişikliği, varlığı için kontrol edilmelidir ya olumsuz etki MEA işlevi ve doğruluk kayıt olarak unutmamak önemlidir.
| Belirti | Neden | Düzeltici eylem |
| Sinyal yok | Elektrot bağlı değil | Düzgün elektrot headstage ve headstage hızlı amperometry sistemine bağlayın. |
| HIZLI amperometry sistemine güç yok | HIZLI sistem geri üzerinde güç anahtarı açın | |
| Sinyal gürültü | Kanla kontamine elektrot | Sürekli elektrot ekleme sırasında beyin yüzeyi sulamak |
| Durulama elektrot hemen dH2O | ||
| Enzim kaplama gevşemiş | Temiz ve elektrot recoat | |
| Referans elektrot eklenen veya kaplı | Ceket ve referans elektrot kafa derisi altında daha uzağa yerleştirin | |
| Elektrot beyin yüzeyinin hareket algılama | Genellikle yüzeysel yapılarda oluşur. Elektrot daha derin (bir süre 1 mm) mümkünse yerleştirin | |
| Hayvan hareketi | Hayvan yetersiz sabitlenir | Hayvan kafatasında için daha güvenli earbars posterior yönünde taşır. Gerekirse, daha iyi vücut hizalama için izin vermek için gövde yükseltmek. |
| Hayvan yetersiz anestezi | Anestezik cihazın bütünlüğünü doğrulayın. Etkili bir doza anestezik titre ve bir kas içi rocuronium doz (5 mg/kg) | |
| Yanlış elektrot yerleştirme | Elektrot doğru uyumlu değildir | Elektrot headstage için uygun bağlantı korunarak yeniden ayarlayabilirsiniz. |
| Stereotaksik koordinatları yanlış | Başvurulan piglet atlas başka bir referans noktası veya hizalama düzlemi kullanmadığından emin olun. | |
| Dikiş işaretleri kafatası puanlama tarafından belirsiz değil dikkatli olun. |
Tablo 1: MEA sorun giderme yönergeleri kullanın içinde domuzcuklar. Olası nedenler ve düzeltici faaliyetlerin en iyi duruma getirme ve sorun giderme yardımcı olmak için.
Stereotaksik atlas piglet için bregma18gibi bilinen bir noktaya göre ilgi alanı stereotaksik koordinatlarını belirlemek için kullanılır. Kulak çubuğu düzgün kafatası düzey ve tam immobilize olması için güvenliği sağlanmalıdır. Kafa derisi Ensizyon sırasında bu dikiş hatları görselleştirme etkileyebilir gibi kafatası puanlama önlemek için özen gösterilmelidir. Kranyotomi pencere MEA kapsayacak kadar büyük olmalıdır.
Bu iletişim kuralı iyi stoklanmış bir çalışma paketi ve bir araştırmacı/takım protokol cerrahi ve anestezik açıdan yetenekli gerektiren teknik sorunlar bir dizi sunuyor. Piglet modeli daha kemirgen modeli daha pahalı olmasıdır modeli ayrıca mali sınırlamalar sunar; Ancak, önemli ölçüde daha az binlerce dolar mal olabilir insan dışı primatlar kullanımı pahalı. MEA teknoloji kullanımı kendi sorunları kaplama yordam sunar ve elektrotlar el ile kaplama gerektiren vasıflı araştırmacı veya yeterli seçicilik ve güvenilir fonksiyonu sağlamak için bir asistan. Onlar seramik yapılmış ve uygun dikkat değil gözlem yapılırsa böylece kolayca zarar microelectrodes kendilerini kırılgandır. Parazit gürültü kayıtları oluşturabilirsiniz, diğer elektrikli cihazlara ve kayıt siteleri tıkamanın operatif sitesinde kan microelectrodes tabidir. Stereotaksik cerrahi çerçeveyi piglet kafatası implantasyonu-hareketsiz için inşa özel olması gerekir gibi özel ekipman ihtiyacını ek bir yük sunar. Stereotaksik çerçeve, Glutamat oksidaz ve Elektrotlar kendilerini tüm maliyetlidir. Ayrıca, son on yıl içinde bir domuz yavrusu stereotaksik atlas-en eksikliği piglet beyinde derin yapıların özel bir konum belirlemek için belirli uzmanlık gerektiren teknik sınırlamalar teşkil etmektedir. Belki de manyetik rezonans görüntüleme, kullanarak yeni bir stereotaksik atlas gelişimi büyük ölçüde bu teknoloji içinde domuz yavruları kullanma yeteneğini geliştirmek istiyorsunuz.
Her ikisi de benzer beyin yapısı ve geliştirme sahip gibi piglet AIN çalışma nedeniyle büyük ölçüde bu tür ve insan kardiyolojik arasında paralellikler için klinik bir modeldir. Fare ya da sıçan gibi yaygın olarak kullanılan modeller farklı olarak piglet hangi model sonuçlarını translatability için ödünç insanlara, büyük bir CNS benzerlik vardır. Piglet modeli ayrıca ucuzdur ve insan dışı primat modeli daha az karmaşık işleme içerir. Piglet modeli işlem incelemek için tasarlanmıştır hangi anestezi tarafından gelişimsel nörotoksisite ikna etmek, nörolojik hasar katkısı ölçmek ve değişkenleri semptomlarıdır tarafından neden olduğu hasar konu ile mücadele. Örneğin, hipoksi beyin üzerinde küresel etkileri vardır gibi anestezi tarafından neden olduğu hasar için yanlış. Piglet sonuçları kalitesini sağlamak için insan Tıpta kullanılan aynı cerrahi ve anestezi koşulları ile kullanılmaktadır.
Seramik tabanlı MEA teknoloji kullanımı birkaç microdialysis çağdaş tekniği ile ilişkili dezavantajları ortadan kaldırır. Microdialysis zamansal ve mekansal çözünürlüğü gibi sürekli Glutamat olaylarını çoklu kaydedebilir, MEA amperometric yöntemleri ile karşılaştırıldığında sınırlı mikroskobik bölgeleri en çok 10 Hz23. Bu hızlı örnekleme hızı yavaş-örnekleme yöntemleri microdialysis24gibi doğasında vardır yerelleştirilmiş nörotransmitter Difüzyon karıştırıcı faktörü ortadan kaldırır. Ayrıca, MEA önemli gliosis ekleme sırasında neden olabilir ve nörotransmitter etkinlik ekleme sitesi22değiştirebilir bir microdialysis sonda daha az invaziv bir yöntemdir.
Önceki çalışmalarda çeşitli memeli modelleri, ölçüm teknikleri ve beyin bölgelerinde kullanan Bazal Glutamat düzeyleri bulunanlar için bu tekniği kullanarak karşılaştırılabilir göstermiştir. Bu ne zaman piglet modeline adapte MEA teknolojisi, in vivo Glutamat konsantrasyonu (Tablo 2) geçerli kayıtları sağlar göstermektedir.
| Yazar (yıl) | Kayıt tekniği | Hayvan modeli | Yaş | Beyin Region(s) | Bazal Glutamat konsantrasyonu (µM) demek |
| Hascup vd (2008)23 | MEA (enzim tabanlı) | Kemirgen | 20 - 24 hafta | Prefrontal korteks, Striatum | 3.3 ± 1,0; 5.0 ± 1.2 |
| Hascup vd (2010)25 | MEA (enzim tabanlı) | Kemirgen | 3 - 6 ay | Hipokampus | 4.7-10,4 |
| Rutherford ve ark. (2007)9 | MEA (enzim tabanlı) | Kemirgen | 3 - 6 ay | Prefrontal korteks, Striatum | 44,9 ± 4,7; 7.3 ± 0.9 |
| Miele vd (1996)26 | Microdialysis (enzim tabanlı) | Kemirgen | - | Striatum | 3.6 ± 0.5 |
| Gün et al. (2006)27 | MEA (enzim tabanlı) | Kemirgen | 3 - 6 ay | Frontal korteks, Striatum | 1,6 ± 0,3; 1.4 ± 0.2 |
| Quintero vd (2007)28 | MEA (enzim tabanlı) | İnsan - primat | 5.3-5.5 yıl | Premotor korteks, Motor korteks | 3.8 ± 1.7; 3.7 ± 0.9 |
| Stephens ve ark. (2010) 29 | MEA [Spencer-Gerhardt-2 (SG-2)] | İnsan - primat | 11 - 21 yıl | Putamen | 8,53 |
| Kodama vd (2002)30 | Microdialysis (enzim tabanlı) | İnsan - primat | - | Prefrontal korteks | 1.29-2.21 |
| Galvan et al. (2003)31 | Microdialysis (enzim tabanlı) | İnsan - primat | Juvenil | Striatum | 28.74 ± 2.73 |
| Sırasında ve Spencer (1993)32 | Microdialysis (enzim tabanlı) | İnsan | 18 - 35 yaş | Hipokampus | 20,3 ± 6,6 |
| Reinstrup vd (2000)33 | Microdialysis (enzim tabanlı) | İnsan | - | Frontal korteks | 16 ± 16 |
| Cavus vd (2005)34 | Microdialysis (enzim tabanlı) | İnsan | 15 - 52 yaş | Yeni korteksimiz | 2.6 ± 0,3 |
Tablo 2. Bazal ekstraselüler Glutamat şirketler karşılaştırılması çeşitli hayvan modelleri. Seçili çalışmaların gözden geçirilmesi normal ekstraselüler Glutamat düzeyleri sağlıklı uyanık ve imzalat hayvanlar microdialysis veya microelectrodes kullanarak oluşturma.
Vivo Glutamat konsantrasyonu piglet modelindeki izlemek için MEA teknoloji kullanımı piglet Nörolojik sonuçlar sonrası anestezi gelecekteki değerlendirilmesi için izin verebilirsiniz. Hayatta kalma deneyler planlanmış, hangi-ecek anestezi nörobilişsel iyi olmak insan Yenidoğan Bebeklerin üzerinde uzun vadeli etkisi bir anlayış daha fazla. Hayatta kalma deneyler davranış test ve Glutamat izleme için sağlayacak değişiklikleri uzun anestezi maruz kaldıktan sonra. Ayrıca nereye onlar-ebilmek deneyim cerrahi müdahale şeklinde fizyolojik stres koşullarında anestezi geçmesi çocuklar için yaygındır. Nörotoksisite içinde cerrahi nörolojik hasarı ve artış açısından etkisi adresleme gelecekteki çalışmaları için ortak klinik ayarı çocuklar için modelleme daha doğru sağlayacak. Çalışma Kronik implantasyonu, bize nörotoksisite ile ilişkili davranış değişiklikleri izlemek için izin aracılığıyla çeşitli bu modellerin olduğu gibi diğer hayvan modelleri kullanımını da mümkün. MEA teknolojinin kendisi bu yüzden çok yönlü, gelecekte Glutamat düzeyleri analiz için sınırlı olması gerekmez (örneğin, GABA, Kolin, lizin, vb çözümlenmesi).
Disclosures
Greg Gerhardt Quanteon LLC asıl sahibidir. Jorge Quintero ve Jason Burmeister Quanteon LLC için danışman olarak görev almıştır.
Acknowledgments
Yazarlar elektrot teknoloji (CenMeT) University of Kentucky Merkezi ve Ohio Devlet Üniversitesi laboratuvar hayvan Kaynak Merkezi (değil) katkıları kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advance Liqui-Wean Pig Milk Replacer | PBS Animal Health | 292-13 | |
| Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
| Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
| Sevoflurane | Ultane | 0074-4456-04 | |
| Rocuronium Bromide Injection | Hospira | 0409-9558-05 | |
| Medfusion 4000 IV Infusion | Smiths Medical | ||
| Model 1530 Heavy-Duty Research Model Stereotax | Kopf | custom made | |
| Model 1541 Piglet Adaptor | Kopf | custom made | |
| Infrared Spot Lamp | Amazon | B000HHQ94C | |
| Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
| Bair Hugger | 3M | 750 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Carbon Steel Rib-Back Surgical Blade | Bard-Parker | #10 | |
| Scalpel Handel | Havel's | HAN-G4 | |
| Surgical Scissors | World Precision Instruments | 504615 | |
| Mosquito Forceps | Sklar Surgical Instruments | 17-1225 | |
| Gauze Pads | Fisherbrand | 22-246-069 | |
| Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
| Dremel 111 Engraving Cutter | Amazon | Dremel 111 | |
| Microelectrode Array | Center for Microelectrdoe Technology, University of Kentucky | S2 4Ch MEA; custom made | |
| Headstage | Quanteon | 2pA/mV | |
| Wire, silver, PFA, .008" Bare, .0110" coated | A-M Systems | 786500 | |
| Fine Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | MO-8 |
References
- Hall, M. J., DeFrances, C. J., Williams, S. N., Golosinskiy, A., Schwartzman, A. National hospital discharge Survey: 2007 summary. Natl Health Stat Report. (29), 1-24 (2010).
- Ikonomidou, C., et al. Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science. 283 (5398), 70-74 (1999).
- Mattson, M. P. Glutamate and neurotrophic factors in neuronal plasticity and disease. Ann N Y Acad Sci. 1144 (1), 97-112 (2008).
- Atlante, A., et al. Glutamate neurotoxicity, oxidative stress and mitochondria. FEBS Lett. 497 (1), 1-5 (2001).
- Kavitha, J., Durga, P., Ramachandran, G. Inhalational agents in anesthesia induced developmental neurotoxicity - Recent advances. Trends in Anaesthesia and Critical Care. 11 (1), 14-18 (2016).
- Zanghi, C. N., Jevtovic-Todorovic, V. A holistic approach to anesthesia-induced neurotoxicity and its implications for future mechanistic studies. Neurotoxicol Teratol. 60 (2), 24-32 (2017).
- Fan, X., et al. In situ real-time monitoring of glutamate and electrophysiology from cortex to hippocampus in mice based on a microelectrode array. Sensors (Basel). 17 (1), 1-8 (2016).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Strömberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Benveniste, H. Brain microdialysis. J Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).
- Kohno, T., et al. An improved method for the detection of changes in brain extracellular glutamate levels. J Neurosci Methods. 81 (1-2), 199-205 (1998).
- Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comp Med. 64 (4), 249-255 (2014).
- Rooij, N. F., Koudelka-Hep, M., Frey, O. Biosensor microprobe array for in vivo monitoring of neurotransmitters. EPFL. , Lausanne. (2010).
- Fan, X. T., et al. Cortical glutamate levels decrease in a non-human primate model of dopamine deficiency. Brain Res. 1552, 34-40 (2014).
- Hunsberger, H. C., et al. Using enzyme-based biosensors to measure tonic and phasic glutamate in Alzheimer's mouse models. J Vis Exp. (123), (2017).
- Hill, A. J., Jones, N. A., Williams, C. M., Stephens, G. J., Whalley, B. J. Development of multi-electrode array screening for anticonvulsants in acute rat brain slices. J Neurosci Methods. 185 (2), 246-256 (2010).
- Defranchi, E., et al. Feasibility assessment of micro-electrode chip assay as a method of detecting neurotoxicity in vitro. Front Neuroeng. 4 (6), (2011).
- Whitaker, E. E., et al. Use of a piglet model for the study of anesthetic-induced developmental neurotoxicity (AIDN): A translational neuroscience approach. J Vis Exp. (124), (2017).
- Kilkenny, C., et al. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Salinas-Zeballos, M., Ceballos, G., Gootman, P. A stereotaxic atlas of the developing swine (Sus scrofa) forebrain. , 887-906 (1986).
- Whitaker, E. E., et al. A novel, clinically relevant use of a piglet model to study the effects of anesthetics on the developing brain. Clin Transl Med. 5 (1), (2016).
- Hascup, E. R., et al. Histological studies of the effects of chronic implantation of ceramic-based microelectrode arrays and microdialysis probes in rat prefrontal cortex. Brain Res. , 12-20 (2009).
- Hascup, K. N., Hascup, E. R., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Second-by-second measures of L-Glutamate and other neurotransmitters using enzyme-based microelectrode arrays. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 324 (2), 725-731 (2008).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Dopamine spillover after quantal release: rethinking dopamine transmission in the nigrostriatal pathway. Brain Res Rev. 58 (2), 303-313 (2008).
- Hascup, E. R., et al. Rapid microelectrode measurements and the origin and regulation of extracellular glutamate in rat prefrontal cortex. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1608-1620 (2010).
- Miele, M., Boutelle, M. G., Fillenz, M. The source of physiologically stimulated glutamate efflux from the striatum of conscious rats. J Physiol. 497 (Pt 3), 745-751 (1996).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).
- Quintero, J. E., et al. Amperometric measures of age-related changes in glutamate regulation in the cortex of rhesus monkeys. Exp Neurol. 208 (2), 238-246 (2007).
- Stephens, M. L., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A., Zhang, Z. Real-time glutamate measurements in the putamen of awake rhesus monkeys using an enzyme-based human microelectrode array prototype. J Neurosci Methods. 185 (2), 264-272 (2010).
- Kodama, T., Hikosaka, K., Watanabe, M. Differential changes in glutamate concentration in the primate prefrontal cortex during spatial delayed alternation and sensory-guided tasks. Exp Brain Res. 145 (2), 133-141 (2002).
- Galvan, A., Smith, Y., Wichmann, T. Continuous monitoring of intracerebral glutamate levels in awake monkeys using microdialysis and enzyme fluorometric detection. J Neurosci Methods. 126 (2), 175-185 (2003).
- During, M. J., Spencer, D. D. Extracellular hippocampal glutamate and spontaneous seizure in the conscious human brain. Lancet. 341 (8861), 1607-1610 (1993).
- Reinstrup, P., et al. Intracerebral microdialysis in clinical practice: baseline values for chemical markers during wakefulness, anesthesia, and neurosurgery. Neurosurgery. 47 (3), 701-710 (2000).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
