Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Optimaliseren van het gebruik van een Liquid Handling Robot uit te voeren van een hoge doorvoersnelheid vooruit chemische genetica scherm van Arabidopsis thaliana

Published: April 30, 2018 doi: 10.3791/57393

Summary

Een scherm met hoge doorvoersnelheid van synthetische kleine moleculen vond plaats op de model plantensoorten, Arabidopsis thaliana. Dit protocol, ontwikkeld voor een liquid handling robot, verhoogt de snelheid van voorwaartse chemische genetica schermen, versnellen van de ontdekking van nieuwe kleine moleculen beïnvloeden de plantenfysiologie.

Abstract

Chemische genetica wordt steeds ingezet om te decoderen van eigenschappen in planten die recalcitrante tot de traditionele genetica als gevolg van gen redundantie of letaliteit worden kunnen. Echter, de waarschijnlijkheid van een synthetische klein molecuul wordt bioactieve is laag; Daarom moeten duizenden moleculen worden getest om te vinden die van belang. Vloeistof behandeling robotics systemen zijn ontworpen om het verwerken van grote aantallen monsters, verhoging van de snelheid waarmee een chemische bibliotheek naast het minimaliseren/standaardiseren fout kan worden vertoond. Om een scherm high-throughput voorwaartse chemische genetica van een bibliotheek van 50.000 kleine molecules op Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocollen met behulp van een bank-top meerkanaals vloeistof waarvoor minimale handling robot werden ontwikkeld de betrokkenheid van de technicus. Met deze protocollen, werden de 3,271 kleine moleculen ontdekt dat zichtbaar fenotypische veranderingen veroorzaakt. 1,563 verbindingen geïnduceerde korte wortels, 1,148 verbindingen gewijzigd kleuring, 383 verbindingen veroorzaakt root haren en andere, niet-gecategoriseerd, verbouwingen en 177 verbindingen geremd kiemkracht.

Introduction

In de afgelopen 20 jaar hebben onderzoekers op het gebied van plantenbiologie grote vooruitgang met behulp van chemische genetica benaderingen, zowel voorwaartse als terugwaartse, geboekt verbetering van ons begrip van de celwand biosynthese, het cytoskelet, een hormoon biosynthese en signalering, Geotropie, pathogenese purine biosynthese en mensenhandel1,2,,3,,4,5endomembrane. Voorwaartse chemische genetica technieken maakt de identificatie van de fenotypen van belang en onderzoekers te begrijpen van de genotypische onderbouwing van bepaalde processen toestaat. Omgekeerde chemische genetica is daarentegen opzoekt van chemische stoffen die interactief met een vooraf bepaald eiwit doelstelling6 werken. Arabidopsis is in de voorhoede van deze ontdekkingen in plantenbiologie omdat haar genoom klein, is toegewezen en van aantekeningen voorzien. Het heeft een korte generatietijd, en er zijn meerdere mutant/verslaggever lijnen beschikbaar om de identificatie van afwijkende subcellular machines7te vergemakkelijken.

Er zijn twee belangrijke knelpunten die vertragen de voortgang van voorwaartse chemische genetische schermen eerste screening proces en het bepalen van het doel van de samengestelde rente8. Een belangrijke hulp bij het vergroten van de snelheid van klein molecuul selectie is het gebruik van automatisering en geautomatiseerde apparatuur9. Liquid handling-robots zijn een uitstekend hulpmiddel voor het afhandelen van grote bibliotheken van kleine moleculen en instrumenteel in het rijden van vooruitgang in de biologische wetenschappen10geweest. Het hier gepresenteerde protocol is ontworpen om te verzachten de bottleneck verbonden aan het screeningsproces, waardoor de identificatie van bioactieve kleine moleculen in een snel tempo. Deze techniek vermindert de belasting van arbeid en tijd namens de exploitant terwijl ook het verminderen van de economische kosten voor de onderzoeker principe.

Tot nu toe de meeste chemische bibliotheken geanalyseerd hebben gehouden tussen 10.000 en 20.000 verbindingen, sommigen met maar liefst 150.000 en sommige met zo weinig als 709,11,12,13,14, 15 , 16. het protocol hierin geïntroduceerd werd uitgevoerd op een klein molecuul bibliotheek van 50.000 verbindingen (Zie Tabel of Materials), een van de grotere voorwaartse chemische genetica schermen uitgevoerd op Arabidopsis tot nu toe. Dit protocol past bij de huidige trend naar meer efficiëntie en snelheid met betrekking tot de voorwaartse chemische genetica, met name als het gaat om herbicide ontdekking, ontdekking van de insecticide, fungicide ontdekken, drug discovery and Kankerbiologie17 ,18,19,20,21. Hoewel ze hier zijn geïmplementeerd met Arabidopsis, kan dit protocol, gemakkelijk worden aangepast aan celculturen, sporen, en mogelijk zelfs insecten in vloeistof binnen 96-, 384 of 1536-Wells-platen. Vanwege zijn kleine omvang is Arabidopsis vatbaar voor screening in 96 goed platen. Echter is het verspreiden van zaden gelijkmatig onder wells een uitdaging. Hand loting klopt maar arbeidsintensief, en hoewel er inrichtingen die zijn ontworpen zijn om het uitdelen van zaden in 96-wells-platen, ze zijn duur om te kopen. Hier, laten we zien hoe deze stap kan worden omzeild met slechts een klein verlies in nauwkeurigheid.

Het algemene doel van deze methode is dat een grote chemische bibliotheek tegen Arabidopsis handelbaarder, zonder afbreuk te doen aan de nauwkeurigheid, via het gebruik van een liquid handling robot screening. Het gebruik van deze methode verbetert de efficiency van de onderzoeker door het verminderen van de tijd genomen om het volledige beheer van de reeks van de eerste verdunning en daaropvolgende fenotypische schermen, waardoor snelle visualisatie van monsters onder een Microscoop ontleden, en snelle identificatie van nieuwe bioactieve kleine moleculen. Figuur 1 toont de belangrijkste resultaten van dit protocol in 4 stappen.

Figure 1
Figuur 1: totale workflow van het scherm naar voren chemische genetica. Een overzicht van het protocol bij met één of ander detail voor elk van de 4 belangrijkste stappen worden beschreven. 1: ontvangst van de chemische bibliotheek, 2: maken de verdunning bibliotheek, 3: maken de Screening platen, en 4: broeden en visualiseren van de Screening platen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. het creëren van een verdunning bibliotheek

  1. Label 625 verdunning bibliotheek platen met de hand, ervoor te zorgen dat ze overeenkomen met hun bijbehorende plaat uit de chemische bibliotheek. Bovendien verbinden in de stroom- en stroom slangen aan de Multichannel Tip Wash geautomatiseerd Labware Positioner (ALP) door hen door het Console-station op de 5 Gallon Reservoir (Zie Tabel van materialen).
  2. Toegang tot de computer en de waspomp via de verbinding van de apparaatbesturing aan de Multichannel Tip Wash ALP inschakelen om het water circuleren. Dit zal automatisch uitgeschakeld aan het einde van het protocol.
  3. Laden, met de hand, de Stacker 10 gekoppeld aan de Stacker carrousel, in de volgende volgorde in de Hotels A - D (Figuur 4, Stacker); een vak van AP96 P20 Pipetteer Tips in kamer 1, vier 96-Wells-V-bodem platen in kamers 2-5 met de twee bovenste platen met voorraad concentraties uit de bestelde bibliotheek en de twee lagere platen leeg (Figuur 5, Stacker). Daarnaast laadt één vak van AP96 P20 Pipetteer Tips in kamer 6 en vier 96-Wells-V-bodem platen in kamers 7-9 met de twee bovenste platen met voorraad concentraties van de bestelde bibliotheek en de twee lagere platen leeg (Figuur 5, Stacker).
  4. Instellen up, met de hand, het dek met een waterreservoir van 300 mL op P3, een 300 mL 70% EtOH bad op P7, Tip Loader ALP (TL1) en Multichannel Tip Wash ALP (TW1) (Figuur 4, dek en Figuur 5, dek).
  5. Met behulp van de besturingssysteemsoftware, presenteren AP96 P20 Pipetteer Tips uit de Stacker 10 en verplaats ze naar de ALP Loader Tip.
    Opmerking: 1.5 via 1.12 alle klaar bent met de vloeistof behandeling van robot operationele software; Zie Tabel van materialen.
  6. Kamer 2 van Hotel A presenteren en scheiden van alle vier 96-Wells-V-bodem platen op het dek, plaatsen onder twee op P4 en P8 en de bovenste twee op P5 en P9 (Figuur 4).
  7. Laden AP96 P20 Pipetteer Tips met de Tip Loader ALP aan de 96-kanaal 200 µL hoofd. Gecombineerd 90 µL van het waterreservoir van 300 mL en afzien in de 96-Wells-V-verdunning bodemplaat op P4. Herhaal deze stap voor de plaat op P8.
  8. Meng de chemische bibliotheek plaat op P5 door herhaaldelijk zuigen en verstrekking van 15 µL driemaal. Daarnaast gecombineerd 10 µL van de chemische bibliotheek plaat op P5 en 10 µL afzien in de verdunning plaat op P4.
  9. Meng de oplossingen van de plaat op P4 door herhaaldelijk zuigen en verstrekking van 50 µL totaal drie keer. Eenmaal gemengd, schoon de uiteinden van de Pipet van het P20 AP96 door zuigen en verstrekking van 70 µL van 70% EtOH vanaf P7, hen daarna te wassen in de Multichannel Tip Wash ALP door zuigen en verstrekking van een 110% volume water vier keer.
  10. Herhaal stap 1.8-1.9 voor het tweede paar platen op P8 en P9. Bij het maken van de tweede 96-Wells-V-verdunning bodemplaat, stapel de platen in de volgende volgorde van beneden naar boven: P9, P5, P8 en P4. Dan de stack te plaatsen op een lege statische ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 of P13.
  11. Herhaal de stappen 1.6-1.10 om kamer 5 in Hotel A leeg is. Herhaal stap 1.5 op kamer 6 te bereiken, nieuwe AP96 P20 Pipetteer Tips verhuizen naar de ALP Loader Tip en plaatsen van de gebruikte AP96 P20 Pipetteer Tips op een lege statische ALP.
  12. Herhaal de stappen 1.6-1.10 om kamer 9 van Hotel A leeg is. Echter, om door te gaan naar Hotel B, de platen en tips op het dek moeten worden herladen in Hotel A.
  13. Opnieuw vullen, met de hand, het waterreservoir van 300 mL. Deze stap is cruciaal, en het computerprogramma kan nemen een pauze waarin dit bericht, vereisen dat de gebruiker te raken 'verder', voordat u de volgende stap uitvoert.
  14. Herhaal stap 1.5-1.13 voor de resterende hotels, zorgen voor een volledige 300 mL waterreservoir telkens voordat u verdergaat naar het volgende hotel.

2. het toevoegen van Media-zaad mengsel aan Screening van platen

  1. ½ Murashige en Skoog (MS) Media maken met 0,1% Agar door toevoeging van 4.3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar à 1 L DI H2O. Breng de pH op 5,7 hoewel de toevoeging van 5 M kaliumhydroxide terwijl controle met een pH-sonde.
  2. Steriliseren zaden door schudden ze in 1% bleekwater en SDS tussen 15 en 30 min en spoel na 4 keer met een gelijke hoeveelheid water door middel van centrifugeren. Nadat de zaden zijn steriel, plaats ze bij 4 ° C vanaf 24 uur tot 7 dagen voor de vernilization. Arabidopsis biologische resources extra worden methoden beschreven voor sterilisatie, vernilization en groei22.
  3. Zaden op toevoegen aan media met de hand een dichtheid van 0.1 g/100 mL. Deze dichtheid leidt tot een gemiddelde van 3-10 zaden per putje van een 96-wells-plaat.
  4. Plaats, met de hand, vier Flat van de 96-wells-platen van de bodem in kamers 1 en 2 van Hotel A (Figuur 6, Hotel A). Plaatsen van een doos van AP96 P250 Pipetteer Tips op de ALP Loader Tip, een 300 mL reservoir gevuld met het media-zaad mengsel gemaakt in stap 2.1-2.3 op P3 en een 300 mL reservoir gevuld met 70% EtOH op P7 (Figuur 4, dek en Figuur 6 Dek).
    Opmerking: 2.5 via 2.8 klaar bent met de besturingssysteemsoftware.
  5. Kamers 1 en 2 in Hotel A presenteren en scheiden de stapels van vier platen. Plaats een plaat op elk van de lege statische Alpen (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 en P12). Laden AP96 P250 Pipetteer Tips op het 96-kanaal 200 µL hoofd.
  6. Gecombineerd 90 µL van het reservoir van de media-zaad 300 mL op P3 en afzien in de eerste Flat van de 96-Wells-bodemplaat. Herhaal dit proces totdat alle acht platen bestaan uit de media-seed-mix.
  7. Reinig de AP96 P250 Pipetteer Tips door zuigen en verstrekking van 70 µL van het reservoir van de 300 mL gevuld met 70% EtOH op P7. De tips in de Multichannel Tip wassen ALP door zuigen en verstrekking van een 110% volume water viermaal wassen, lossen de tips op TL1 en verzamelen de platen met de hand.

3. het toevoegen van kleine moleculen aan Screening van platen

  1. Laden, met de hand, een doos van AP96 P250 Pipetteer Tips in kamer 1 van Hotel A, twee 96-Wells-V-bodem verdunning bibliotheek platen in kamers 2, 4, 6 en 8, en twee 96 goed Flat-Bottom Screening platen in kamers van 3, 5, 7 en 9 (Figuur 4 STAPELAARS en Figuur 7, Hotel A). Bovendien sluit slangen en naar de Multichannel Tip Wash ALP op de 5 Gallon Reservoir.
    Opmerking: 3.2 via 3.10 klaar bent met de besturingssysteemsoftware.
  2. Configureren van het dek om te bevatten een 300 mL 70% EtOH wassen reservoir op P7; het reservoir van de media-zaad kan worden verlaten op het dek bij P3 (Figuur 4, dek en Figuur 7, dek). Daarnaast zet de Console rit door de aansluiting van de apparaatbesturing circuleren van water via de Multichannel Tip Wash ALP. Dit zal automatisch uitgeschakeld aan het einde van het protocol.
  3. Het AP96 P250 Pipetteer Tip vak van Hotel A presenteren en verplaats het naar de ALP Loader Tip.
  4. Presenteren van de 96-Wells-V-bodem verdunning bibliotheek platen van kamer 2 van Hotel A op het dek en een op statische ALP P4 en één op P8. Presenteren van de 96-Wells-Flat-onderkant Screening platen van kamer 3 van Hotel A aan het dek en plaats één op statische ALP P5 en één op P9.
  5. Laden AP96 P250 Pipetteer Tips met de Tip Loader ALP aan de 96-kanaal 200 µL hoofd.
  6. Meng de 96-Wells-V-verdunning bodemplaat op P4 door zuigen en verstrekking van 50 µL driemaal. Na dat gecombineerd 10 µL van deze plaat en afzien in het appartement van 96-Wells-Screening bodemplaat op P5.
  7. Vermeng de oplossingen in de plaat duikt met P5 door zuigen en verstrekking van 50 µL driemaal. Reinig de AP96 P250 Pipetteer Tips met ethanol door zuigen en verstrekking van 70 µL van 70% EtOH uit het reservoir op P7 en daarna wassen met de tips in de Multichannel Tip Wash ALP door zuigen en verstrekking van een 110% volume van water vier keer.
  8. Herhaal stap 3.5 en 3.6 voor het tweede 96-Wells-V-verdunning bibliotheek bodemplaat (P8) en 96-Wells Flat-Screening bodemplaat (P9).
  9. Stapel de twee 96-Wells V-bodem verdunning bibliotheek platen samen en de twee 96-Wells vlakke onderkant Screening platen samen. Verplaats de platen naar statische Alpen P1, P2, P6, P10, P11, P12 of P13.
  10. Herhaal stap 3.4-3.9 driemaal, een totaal van acht keer verdunde chemicaliën toe te voegen aan screening platen. Tot slot, het aantal zaden in elk putje van de platen van de screening via visuele conformatie controleren en aan te vullen die putjes met minder dan drie zaden door extra gesteriliseerd en vernalized zaad.

4. incubatie en visualisatie van het screenen van platen

  1. Incubeer de 96-wells-platen voor het screenen van Flat-Bottom gedurende vier dagen in een milieu zaal bij 22 ° C op een 16/8 licht/donker cyclus in een uitdroging bewijs container. Visualiseer de 96-Wells Flat-Bottom Screening platen onder een Microscoop ontleden. Het opnemen van alle afwijkende fenotypen voor verder onderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De mogelijkheid om nauwkeurig en efficiënt karakteriseren fenotypen gebaseerd op de toevoeging van de kleine moleculen bij screening concentraties onder een Microscoop ontleden is het uiteindelijke doel van deze methode van voorwaartse chemische genetica op Arabidopsis. De fenotypen waargenomen wanneer alle 50.000 verbindingen had onderzocht is divers en kan worden onderverdeeld in meerdere verschillende klassen (Figuur 2). Figuur 3A -F toont voorbeelden van fenotypen die werden waargenomen bij lage vergroting onder een Microscoop ontleden. Sommige fenotypen twijfelachtige resultaten (Figuur 3 g, H) opgeleverd. Dit moest worden Nacontrole verricht bij lagere concentraties om ervoor te zorgen dat de chemische stof niet in een verschillende fenotype bij een lagere dosis voorzien.

Slechte resultaten kunnen om vele redenen ontstaan. Een is arme kieming tarieven van de zaden. Dit kan leiden tot een screening plate overwegend vertonen geen kiemkracht of onvolledige kiemkracht fenotypen (Figuur 3 g, H), die misleidend kan zijn. Om dit te verhelpen, vooraf testen kieming tarieven voor alle zaden gebruikt. Zodra kieming tarieven zijn vastgesteld, en meer dan 95% voor Arabidopsis zijn, is vernalisatie zaad voorafgaand aan chemische toevoeging een belangrijke stap zorgen voor gelijktijdige kiemkracht. Gebrek aan gelijktijdige kieming kan leiden tot valse positieven in fenotypering. Daarnaast kunnen slechte resultaten ontstaan als media is toegestaan te laten verdampen tijdens de incubatie. Dit gebrek aan hydratatie voorkomt dat zaden ontkiemen en kan worden vermeden door het gebruik van uitdroging-proof containers. Bovendien, DMSO en media oplossingen zijn in de twee externe kolommen van elke plaat, waarborgen van de goede micro klimaten en de kieming tarieven worden verkregen.

Bevredigende experimentele resultaten worden bereikt wanneer kieming tarieven > 95%, zaden zijn vernalized vóór toevoeging in 96-Wells flat-bodem platen, zorgen voor gelijktijdige kiemkracht, en media doet niet verdampen tijdens de incubatie. In het ideale geval chemische stoffen zou worden getest bij een concentratie waarmee alle zaden ontkiemen en fenotypen nauwkeurig worden beoordeeld (figuur 3A-F). De meerderheid van de behandelingen geproduceerd zaailingen met fenotypen die visueel niet te onderscheiden van mock besturingselementen met geen morfologische fenotypen (figuur 3A), met de overgrote meerderheid van afwijkende fenotypen bestaande waren uit gebleekte en ernstig onvolgroeide wortels (Figuur 2).

Figure 2
Figuur 2: de meest voorkomende fenotypen waargenomen en het aandeel van elke fenotype waargenomen. A) een totaal van 3,271 kleine moleculen bleken te zijn bioactieve op 100 µM na vier dagen incubatie. De kleur geeft aan de ernst van het fenotype (zwart = meer ernstige, wit = minder ernstige). Het meest waargenomen fenotype betrekking hadden op wortel morfologie, met meer dan 1500 verbindingen inducerende onvolgroeide wortels van verschillende ernst. Kleuring was het ook meestal beïnvloed door de verbindingen in deze bibliotheek, met 1,148 zaailingen die zijn vastgelegd als geheel gebleekt of gedeeltelijk verkleurd. Net onder 400 stoffen geproduceerd onderscheidend root haar fenotypen – ofwel onvolgroeide of beide onvolgroeide en felgekleurde. Ten slotte werd kiemkracht beïnvloed door amper 200 verbindingen. In deze gevallen zaden did niet volslagen kiemkracht of niet zelfs beginnen te ontkiemen. B) zaailingen exposeren abnormaliteiten in wortel morfologie, ofwel wordt onvolgroeide of ernstig onvolgroeide, bijna de helft van alle fenotypische aberrant zaailingen gevormd. De volgende grootste groep waren die in gebleekte of verkleurde zaailingen resulteerde. Fenotypen die betrekking op root haar afwijkingen maakte ook een aanzienlijk deel terwijl de remming van de kiemkracht, kieming of geen onvolledige kiemkracht hadden, kwam slechts bij een klein percentage van alle bioactieve stoffen. Tot slot, er waren een aantal fenotypen die plaatsvond op dergelijke een lage frequentie, ze werden gegroepeerd in de categorie 'andere', een voorbeeld daarvan de productie van groene mucilage was, te zien in Figuur 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: beelden van representatieve fenotypen waargenomen tijdens de voorwaartse chemische genetica scherm. Geen zichtbare morfologische afwijkingen (A), bruin wortel haren (B), onvolgroeide wortel (C), ernstig onvolgroeide wortel (D), gebleekt (E), groen mucilage (F), onvolledig kiemkracht (G) en geen kiemkracht (H). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: overzicht van de Stacker 10 en dek ingesteld vóór de inleiding van protocol. De Stacker carrousel bestaat uit vier Stacker 10's (Hotels A - D) die elk geschikt voor tien kamers. Het dek heeft een verscheidenheid van de Alpen: de Tip Loader, de Stacker Shuttle, the Wash Multichannel Tip en 13 statische Alpen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Stacker 10 en dek instellen nodig voor het maken van een verdunning Library. De vier Stacker 10's worden geladen met vakken voor AP96 P20 Pipetteer Tips in kamers 1 en 6 Hotels A - D en stapels van vier 96-Wells-V-bodem platen in kamers 2-5 en de kamers 7-9 Hotels A - D. De lay-out van het dek bestaat uit twee Reservoirs van 300 mL op statische Alpen P3 en P7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Stacker 10 en dek ingesteld voor Media-zaad mengsel toe te voegen aan Screening platen. De Stacker 10 is geladen met vier 96-Wells Flat-bodem platen in kamers 1 en 2 van Hotel A. De lay-out van het dek bestaat uit twee Reservoirs van 300 mL statische Alpen P3 en P7 en een doos van AP96 P250 Pipetteer Tips op TL1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: Stacker 10 en dek die zijn ingesteld voor het toevoegen van kleine moleculen aan Screening platen. De Stacker 10 is geladen met een doos met AP96 P250 Pipetteer Tips in kamer 1, een stapel van twee 96-Wells-V-bodem verdunning platen in kamers, 2, 4, 6, en 8 en een stapel van twee 96-Wells Flat-bodem platen gevuld met het media-zaad mengsel in de kamers 3 , 5, 7 en 9. De lay-out van het dek bestaat uit twee reservoirs van 300 mL op statische Alpen P3 en P7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol is ontworpen om steun van onderzoekers in het volbrengen van een voorwaartse chemische genetica scherm op Arabidopsis. Wij bieden representatieve resultaten van een scherm van 50.000 verbindingen (Figuur 2 en Figuur 3), een van de grootste voorwaartse chemische genetica schermen op Arabidopsis tot op heden9,13,23uitgevoerd. Het gebruik van een liquid handling robot ingeschakeld efficiënter verdunning bibliotheek en bibliotheek generatie screening, verbetering van de snelheid en de efficiëntie van de identificatie van nieuwe verbindingen. Vergroting van de capaciteit naar scherm in een hoge doorvoersnelheid natuur ging gepaard met het minderen van arbeid namens de onderzoeker. Deze techniek werd ontworpen om te worden gebruikt met 96-wells-platen, geschikt voor kleine zaden of planten zichtbaar onder een Microscoop ontleden. Met behulp van platen met grotere putten aan grotere zaden zou vereisen aanpassingen aan de doorvoer en het ontwerp.

Aanvullende beperkingen van deze techniek bevatten de moeilijkheid van het gebruik van dit stuk van apparatuur met aseptische technieken; echter deden we hoge percentages van besmetting als gevolg van ½ MS media sacharose ontbreekt niet tegenkomen. Een kan een verontreiniging probleem omzeilen door het plaatsen van de robot in een steriele ruimte, waardoor voor steriele omstandigheden en cultuur van de cel, of met behulp van een liquid handling robot met een steriele kamer24,25. Een andere beperking is de grootte van de tip en zaad aspiratie. Een kleine pipet tip zoals de AP96-P20 zou verstoppen met zaden; Daarom moet een grotere pipette uiteinde worden gebruikt voor verstrekking van zaad en oplossing mengen.

Kritische stappen binnen dit protocol bevatten de zorgvuldige etikettering van alle platen in de verdunning bibliotheek en bibliotheek van de screening, ervoor te zorgen zij in de juiste stand samen met de juiste volgorde bij het voederen van de robot. Duidelijke labeling en systematische verwerking is eenvoudig en dit probleem kunt overwinnen. Een andere belangrijke stap is ervoor te zorgen dat de juiste apparatuur op de juiste plaats vóór het begin van het experiment, zowel binnen de Stacker 10's en op het dek. Als de apparatuur niet correct op het dek geplaatst is, de 96-kanaal 200 µL hoofd kon verpletteren, beschadiging van het instrument en onderhoud vereisen. Een andere belangrijke stap is ervoor te zorgen dat de juiste hoeveelheid vloeistof in de reservoirs van 300 mL is geplaatst en dat dit bedrag in de software correct worden ingevoerd. Als de nummers niet overeenkomen, de tips zal de vloeistof niet bereiken en aspiratie zal niet gebeuren.

Het is ook noodzakelijk om te nemen stappen om ervoor te zorgen dat de resultaten kloppen. Een fout die ons opgevallen terwijl de ontwikkeling van het protocol werd gekoppeld aan de tip van leven. Na opeenvolgende laden en lossen, verliezen de tips hun vermogen om gecombineerd en nauwkeurig afzien. Het is daarom absoluut noodzakelijk dat elke set van 96 tips wordt een maximum van vier keer. Het is ook belangrijk om te veranderen het waswater regelmatig om te voorkomen dat het potentieel voor chemische stoffen per ongeluk worden toegevoegd aan de screening van de platen. Ten slotte hebben sommige chemische stoffen een neiging te precipiteren uit oplossing26. Om ervoor te zorgen dat elke chemische stof wordt toegevoegd aan de juiste concentratie, worden mengen stappen opgenomen in de verdunnings- en screening protocol. Niet te mengen kan resulteren in lage hoeveelheden chemische stoffen worden toegevoegd uit de bibliotheek naar de bibliotheek, uitdagende interpretatie van potentieel chemisch geïnduceerde fenotypen.

Met behulp van de juiste platen voor elk deel van het protocol is ook zeer belangrijk. V-bodem platen zijn ontworpen om ervoor te zorgen dat kleine hoeveelheden vloeistof kunnen worden aanzuiging en worden aanbevolen voor gebruik in de oprichting van de verdunning bibliotheek. Deze platen zijn echter niet geschikt voor het gedeelte van de screening van het protocol, aangezien hun weerkaatsing van het licht tot slechte visualisatie van fenotypen leidt. Om het observeren van de fenotypen van 3-4 dag oude zaailingen, moet het scherm in flat-bodem platen worden uitgevoerd.

Zodra de screening-platen zijn gemaakt, is visualisatie vereist. 96-Wells flat-bodem platen kunnen eenvoudige visualisatie onder ontrafeling van microscopen. Het is noodzakelijk dat de platen in uitdroging-proof containers naar vermindering van de verdamping van de media worden opgeslagen. Een alternatief voor microscopische visualisatie is een hoge resolutie scanner gebruikt. Beelden geproduceerd met hoge resolutie onthullen de meerderheid van de fenotypen waargenomen in dit scherm en bieden een archief van de resultaten die in de toekomst kan worden herzien. Zodra visualisatie voltooid is, en de bibliotheek van uw keuze gescreend, kan deze methode worden uitgevoerd op verschillende organismen of met een andere chemische bibliotheek. Wijzigingen in de apparatuur kunnen leiden tot steriele cultuur, waardoor ondernemingen naar de rijken van stamcellen, schimmels, insecten en kleine planten2,18,25,27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Wij danken Jozsef Stork, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue en Andrea Sanchez voor constructieve en kritische discussie. Dr. Sharyn Perry voor de fenotypische foto's. Dit materiaal is gebaseerd op werk gesteund door de National Science Foundation onder coöperatie overeenkomst nr. 1355438.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Keyboard Local Provider N/A Used for protocol design and operating the Biomek FX
Mouse Local Provider N/A Used for protocol design and operating the Biomek FX
Computer Screen Local Provider N/A Used for protocol design and operating the Biomek FX
Computer Local Provider N/A Used for protocol design and operating the Biomek FX
DIVERSet Diverse Screening Library ChemBridge N/A Chemical library
Biomek Software Beckman Coulter N/A Runs and designs the Biomek FX
Device Controller Beckman Coulter 719366 Operates the water pump/tip washing station
Stacker Carousel Pendent Beckman Coulter 148240 Manual operation of Biomek Stacker Carousel
Biomek Stacker Carousel Beckman Coulter 148520 Rotary unit that houses all FX Stacker 10's
FX Stacker 10 Beckman Coulter 148522 Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10 Beckman Coulter 148522 Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10 Beckman Coulter 148522 Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10 Beckman Coulter 148522 Elevator unit that houses components for screen
Biomek FX Beckman Coulter https://www.beckman.com/liquid-handlers Robot that performs the desired operations
Accuframe Artisan Technology Group 76853-4 Frames arm to place components corretly
Framing Fixture Beckman Coulter 719415 Centers arm in the Accuframe
Multichannel Tip Wash ALP Beckman Coulter 719662 Washes the tips after the ethanol bath
Tip Loader ALP Beckman Coulter 719356 Pneumatically loads tips onto the arm
Air Compressor Local Provider N/A Provides air for pneumatic tip loading
MasterFlex Console Drive Cole-Parmer 77200-65 Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer
Air Hose Local Provider N/A Provides air from air compressor to Tip Loader
Water Hose Local Provider N/A Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer
Static ALP's Beckman Coulter Comes with Biomek FX Supports equipment for the Screen
5 Gallon Reserviour Local Provider N/A Recirculates the dirty water from cleaning the tips
Grippers Beckman Coulter Comes with Biomek FX Grabs and moves the equipment to the correct places
96-Channel 200 µL Head Beckman Coulter Comes with Biomek FX Holds the 96 tips used within the screen
AP96 P200 Pipette Tips Beckman Coulter 717251 Used to make the screening library
96 Well Flat Bottom Plate Costar 9018 Aids in visulization of screen
96 Well V-Bottom Plate Costar 3897 Aids in storing of dilution library
AlumaSeal 96 Sealing Film MedSci F-96-100 Seals for storage both the chemicle library and dilution library
Plastic ziplock sandwich bags Local Provider N/A Used to ensure a humid environment for screen
AP96 P20 Pipette Tips Beckman Coulter 717254 Used in the dilution library creation
Growth Chamber Percival AR36L3 Germinates seeds for phenotypic visulization
Spatula Local Provider N/A Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly
Toothpick Local Provider N/A Pushes seeds from spatula to wells
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture PhytoTechnology Laboratories M524 Add to MS media mixture
MES Free Acid Monohydrate Fisher Scientific ICN19483580 Added to MS media to decrease pH
Agar Powder Alfa Aesar 9002-18-0 Increases thickness of media to support seed suspension
5M KOH Sigma-Aldrich 484016 Increases pH to adequate levels
1L Media Storage Bottle Corning 1395-1L Holds enough media for a screen
Polypropylene Centrifuge Tubes Corning 431470 Sterilizes seeds prior to vernilization
pH Probe Davis Instruments YX-58825-26 Used for making media
ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual Beckman Coulter PN 987836 Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX
Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide Beckman Coulter 609862-AA Aids in setting up the Stacker Carousel
Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual Beckman Coulter PN 987834 Used to frame the Multichannel Pod
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide Beckman Coulter PN B32335AB Used to aid in setting up the Biomek FX
Biomek Software User's Manual Beckman Coulter PN 987835 Used to set up and understand the Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
  2. Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
  3. McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
  4. Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
  5. Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
  6. De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
  7. Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
  8. Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
  9. Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
  10. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
  11. DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
  12. Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
  13. Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
  14. Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
  15. Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
  16. De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
  17. Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
  18. St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
  19. Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
  20. Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
  21. Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
  22. Center, A. B. R. Seed Handling. , The Ohio State University. Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013).
  23. Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
  24. Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
  25. Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
  26. Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
  27. Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).

Tags

Retractie kwestie 134 Plantenfysiologie plant groei remmers chemische bibliotheek kleine molecules synthetische verbindingen geautomatiseerde screening
Optimaliseren van het gebruik van een Liquid Handling Robot uit te voeren van een hoge doorvoersnelheid vooruit chemische genetica scherm van <em>Arabidopsis thaliana</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amos, B. K., Pook, V. G., Debolt, S. More

Amos, B. K., Pook, V. G., Debolt, S. Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (134), e57393, doi:10.3791/57393 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter