Summary
Realizou-se uma tela de alta taxa de transferência de moléculas pequenas sintéticas sobre espécies a planta modelo Arabidopsis thaliana. Este protocolo, desenvolvido para um robô de manipulação de líquidos, aumenta a velocidade das telas de genética de química para a frente, acelerando a descoberta de novas moléculas pequenas, que afetam a fisiologia vegetal.
Abstract
Química genética é cada vez mais sendo empregada para decodificar traços nas plantas que podem ser recalcitrantes à genética tradicional devido à redundância de gene ou letalidade. No entanto, a probabilidade de uma pequena molécula sintética, sendo bioativos é baixa; Portanto, milhares de moléculas devem ser testados a fim de encontrar aqueles de interesse. Robótica, sistemas são projetados para lidar com um grande número de amostras, aumentando a velocidade com que uma biblioteca de química pode ser rastreada além de minimizar/padronização erro de manuseio de líquidos. Para obter uma tela de alta produtividade para a frente química genética de uma biblioteca de 50.000 moléculas pequenas em Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocolos usando um líquido de multicanal de bancada manipulação robô foram desenvolvidos que exigem mínima envolvimento de técnico. Com estes protocolos, 3.271 pequenas moléculas foram descobertas que causou alterações fenotípicas visíveis. 1.563 compostos induziram raízes curtas, coloração 1.148 compostos alterados, 383 compostos causados raiz do cabelo e outras, não-Categorizado, alterações e germinação de 177 compostos inibidas.
Introduction
Nos últimos 20 anos pesquisadores no campo da biologia vegetal tem feito grandes progressos usando abordagens química genética, tanto para diante e reversos, melhorando nossa compreensão da biossíntese da parede celular, o citoesqueleto, a biossíntese do hormônio e sinalização, geotropismo, patogênese, biossíntese de purinas e endomembranoso tráfico1,2,3,4,5. Empregando técnicas de genética para a frente de química permite a identificação de fenótipos de interesse e permite que os pesquisadores a entender os fundamentos genotípicos de processos particulares. Por outro lado, genética química inversa procura produtos químicos que interagem com uma proteína pré-determinado alvo6. Arabidopsis tem sido na vanguarda destas descobertas em biologia vegetal, porque o seu genoma é pequena, mapeado e anotado. Tem um tempo de geração curto, e existem várias linhas de mutante/repórter disponíveis para facilitar a identificação de máquinas subcellular aberrante7.
Existem dois grandes estrangulamentos que retardar o progresso da frente químicas genéticas telas, inicial processo de triagem e determinar o destino do composto de interesse8. Uma grande ajuda no aumento da velocidade de seleção pequena molécula é o uso de automação e equipamentos automatizados9. Robôs de manipulação de líquido são uma excelente ferramenta para a manipulação de grandes bibliotecas de moléculas pequenas e têm sido fundamentais para dirigir o progresso da ciências biológicas10. O protocolo aqui apresentado é projetado para aliviar o gargalo associado com o processo de seleção, permitindo a identificação de moléculas bioativas de pequenas em uma taxa rápida. Esta técnica diminui a carga de trabalho e tempo em nome do operador, enquanto também, diminuindo o custo econômico para o investigador de princípio.
Até então, bibliotecas mais químicas analisadas realizaram entre 10.000 e 20.000 compostos, alguns com até 150.000 e alguns com tão poucos como 709,11,12,13,14, 15 , 16. o protocolo apresentado neste documento foi implementado em uma biblioteca pequena molécula de 50.000 compostos (ver Tabela de materiais), um dos maiores genética química frente ecrãs conduzidos em Arabidopsis até à data. Este protocolo se encaixa com a atual tendência para aumentar a eficiência e velocidade sobre genética de química para a frente, especialmente no que tange a descoberta de herbicida, descoberta de inseticida, fungicida descubra, droga descoberta e a biologia do câncer17 ,18,19,20,21. Embora implementado aqui com Arabidopsis, este protocolo, poderia ser facilmente adaptadas às culturas de células, esporos e potencialmente até insetos em meio líquido, dentro de 96, 384- ou placas boas 1536. Devido ao seu pequeno tamanho, Arabidopsis é passível de triagem em 96 placas bem. No entanto, distribuir sementes uniformemente entre poços é um desafio. Semeadura de mão é preciso mas mão de obra intensiva, e embora existam dispositivos projetados para dispensar as sementes em placas de 96 poços, eles são caros para comprar. Aqui, nós mostramos como este passo pode ser contornado com apenas uma pequena perda de precisão.
O objetivo geral deste método era fazer a triagem de uma grande biblioteca de química contra Arabidopsis mais gerenciável, sem comprometer a precisão, através do uso de um robô de manipulação de líquidos. O uso desse método melhora a eficiência do pesquisador, diminuindo o tempo levado para completar a gestão de séries de diluição inicial e subsequentes telas fenotípicas, permitindo a visualização rápida de amostras sob um microscópio de dissecação e rápida identificação de novas moléculas pequenas bioativas. A Figura 1 mostra os resultados-chave do presente protocolo em 4 passos.
Figura 1: fluxo de trabalho geral da tela frente química genética. Uma visão geral do protocolo a ser descrito com algum detalhe para cada uma das 4 principais etapas. 1: receber a biblioteca química, 2: fazendo a biblioteca de diluição, 3: fazendo as placas de triagem e 4: incubar e visualizando as placas de triagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
1. criação de uma biblioteca de diluição
- Rotule 625 placas de diluição biblioteca à mão, garantindo que eles correspondem à sua placa correspondente da biblioteca de química. Além disso, conectar-se no fluxo e mangueiras de fluxo para o multicanal dica lavagem automatizada Labware posicionador (ALP), passando-os através da unidade de Console para o reservatório de 5 galões (ver Tabela de materiais).
- Acessar o computador e ligue a bomba de lavagem através da conexão do controlador de dispositivo para o ALP lavagem dica multicanal para circular a água. Isto desliga-se automaticamente no final do protocolo.
- Carga, à mão, o empilhador 10 anexado para o carrossel de empilhador, na seguinte ordem Hotéis A - D (Figura 4, empilhador); uma caixa de pontas de pipetas de P20 AP96 na sala 1, quatro V 96 poços-placas de fundo em quartos de 2-5 com as duas placas superiores contendo concentrações estoque da biblioteca ordenada e as duas placas inferiores vazios (Figura 5, empilhador). Além disso, carregar uma caixa de pontas de pipetas de P20 AP96 no quarto 6 e quatro V 96 poços-placas de fundo nas salas 7-9 com as duas placas superiores contendo concentrações estoque da biblioteca ordenada e as duas placas inferiores vazios (Figura 5, empilhador).
- Definir, com a mão, o deck com um reservatório de água de 300 mL na P3, um banho de EtOH 70% 300 mL na P7, dica Loader ALP (TL1) e multicanal dica lavagem ALP (TW1) (Figura 4, Deck e Figura 5, Deck).
- Usando o software operacional, apresentar pontas de pipetas de P20 AP96 do 10 de empilhador e movê-los para o ALP carregador de ponta.
Nota: 1.5 através de 1.12 todos são feitos com o líquido manipulação software operacional do robô; consulte Tabela de materiais. - Apresentar 2 quarto de Hotel A e separar todos os quatro 96 poços V-fundo placas no convés, colocando a parte inferior dois P4 e P8 e os dois primeiros em P5 e P9 (Figura 4).
- Carrega AP96 P20, pontas de pipeta com o carregador de ponta ALP para a cabeça do 96-canal 200 µ l. Aspire 90 µ l do reservatório de água de 300 mL e dispense na V 96 poços-placa de diluição inferior em P4. Repita essa etapa para a placa na P8.
- Misture a placa biblioteca química na P5 por repetidamente por aspiração e dispensação 15 µ l três vezes. Além disso, o Aspire 10 µ l da placa de biblioteca química na P5 e dispense 10 µ l em chapa de diluição P4.
- Misture as soluções da placa em P4 por repetidamente por aspiração e dispensação 50 µ l, um total de três vezes. Uma vez misturado, limpe as pontas de pipetas de P20 AP96 por aspiração e dispensação 70 µ l de 70% EtOH da P7, então lavá-los no multicanal dica ALP de lavagem por aspiração e dispensação de um volume de 110% de água quatro vezes.
- Repita as etapas 1.8-1.9 para o segundo par de placas na P8 e P9. Após criar o segundo V 96 poços-placa de diluição inferior, pilha os pratos na seguinte ordem de baixo para cima: P4, P5, P8 e P9. Em seguida, coloque a pilha em um vazio estático ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 ou P13.
- Repita as etapas de 1.6-1.10 até 5 quarto em Hotel A esvaziar. Repita a etapa 1.5 atingindo o quarto 6, movendo-se pontas de pipetas de P20 AP96 novo para o ALP Loader dica e colocando as pontas de pipetas de P20 AP96 usado em um vazio estático ALP.
- Repita as etapas de 1.6-1.10 até 9 quarto de Hotel A esvaziar. No entanto, para poderem passar ao Hotel B, as placas e dicas sobre o pavimento devem ser recarregadas no Hotel A.
- Voltar a encher, com a mão, o reservatório de água de 300 mL. Esta etapa é crucial, e o programa de computador pode incorporar uma pausa detalhando esta mensagem, exigir que o usuário atingiu 'continue', antes de efectuar o próximo passo.
- Repita as etapas 1.5-1.13 para os restantes Hotéis, assegurando um reservatório de água cheio de 300 mL cada vez antes de prosseguir para o próximo hotel.
2. adicionando a mistura de sementes de mídia para placas de triagem
- Fazer ½ Murashige e Skoog (MS) Media com 0,1% ágar pela adição de 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g de ágar para 1 L DI H2O. ajustar o pH a 5.7 embora a adição de hidróxido de potássio 5m enquanto monitora com uma sonda de pH.
- Esterilizar as sementes agitando-los em 1% de alvejante e SDS entre 15 e 30 min e depois enxaguar 4 vezes com igual volume de água por centrifugação. Uma vez que as sementes são estéreis, colocá-los em 4 ° C de 24 horas a 7 dias para vernilization. Centro de recursos biológicos de Arabidopsis descreve métodos adicionais de esterilização, vernilization e crescimento22.
- Adicione sementes a media com a mão em uma densidade de 0,1 g/100 mL. Esta densidade resulta em uma média de 3-10 sementes por alvéolo de uma placa de 96 poços.
- Lugar, à mão, quatro televisões de 96 poços-placas de fundo nas salas 1 e 2 do Hotel A (Figura 6, A do Hotel). Coloque uma caixa de pontas de pipetas P250 AP96 sobre a dica Loader ALP, um reservatório de 300 mL preenchida com a mistura de sementes de mídia criada em passos 2.1-2.3 no P3, e um reservatório de 300 mL preenchidos com 70% EtOH no P7 (Figura 4, Deck e Figura 6 Baralho).
Nota: 2.5 através de 2.8 são feitas com o software operacional. - Apresentar salas 1 e 2 num Hotel e separar as pilhas de quatro pratos. Coloque uma placa em cada um dos Alpes vazio estático (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 e P12). Carrega AP96 pontas de pipetas P250 na cabeça 96-canal 200 µ l.
- Aspire 90 µ l do reservatório de mídia-semente de 300ml na P3 e dispensar o primeiro flat de 96 poços-placa inferior. Repita este processo até que todos os oito placas contêm a mistura de sementes de mídia.
- Limpe as pontas de pipeta P250 AP96 por aspiração e dispensação 70 µ l do reservatório de 300 mL, preenchido com 70% EtOH no P7. Lave as dicas no multicanal dica lavar ALP por aspiração e dispensação de um volume de 110% de água quatro vezes, descarregar as gorjetas no TL1 e recolher os pratos à mão.
3. a adição de pequenas moléculas para placas de triagem
- Carga, à mão, uma caixa de pontas de pipetas AP96 P250 na sala 1 do Hotel A, dois V 96 poços-placas de biblioteca de diluição inferior em quartos de 2, 4, 6 e 8 e 2 96 bem fundo plano de triagem placas em quartos de 3, 5, 7 e 9 (Figura 4 Empilhador e Figura 7, um Hotel). Além disso, conecte as mangueiras de e para o ALP multicanal dica lavagem para o reservatório de 5 galões.
Nota: 3.2 através de 3.10 são feitas com o software operacional. - Configurar o convés para conter um reservatório de lavagem 300 mL 70% EtOH no P7; o reservatório de mídia-semente pode ser deixado no chão, aos P3 (Figura 4, Deck e Figura 7, Deck). Além disso, ligue a unidade de Console através da conexão do controlador de dispositivo para circular a água através do multicanal dica lavagem ALP. Isto desliga-se automaticamente no final do protocolo.
- Apresentar a AP96 P250 pipeta dica caixa do Hotel A e movê-lo para o ALP carregador de ponta.
- Apresentar o V 96 poços-fundo biblioteca diluição placas de 2 quarto de Hotel A para o convés e coloque um na P4 ALP estático e um na P8. Apresentar o plano de 96 poços-placas de triagem de fundo de quarto 3 do Hotel a plataforma e coloque uma em ALP estático P5 e outra na P9.
- Carrega AP96 P250, pontas de pipeta com o carregador de ponta ALP para a cabeça do 96-canal 200 µ l.
- Misture o V 96 poços-placa de diluição inferior em P4 por aspiração e dispensação 50 µ l de três vezes. Em seguida, Aspire 10 µ l desta placa e dispensar para o apartamento de 96 poços-placa de rastreio inferior na P5.
- Misture as soluções na placa na P5 por aspiração e dispensação 50 µ l de três vezes. Limpe as pontas de pipeta P250 AP96 com etanol por aspiração e dispensação 70 µ l de 70% EtOH do reservatório no P7 e depois lavar as dicas no ALP multicanal dica lavagem por aspiração e dispensação de um volume de 110% de água quatro vezes.
- Repita as etapas de 3.5 e 3.6, para o segundo V 96 poços-placa de biblioteca de diluição inferior (P8) e 96 poços Flat-placa inferior de triagem (P9).
- Pilha os dois 96 poços V-fundo biblioteca diluição placas juntas e as placas de triagem de fundo liso 96 poços dois juntas. Mova as placas para estático Alpes P1 P2, P6, P10, P11, P12 e P13.
- Repita os passos três vezes 3.4-3.9, Adicionar produtos químicos diluídos para triagem chapas um total de oito vezes. Finalmente, verifique o número de sementes em cada poço das placas de triagem através de conformação visual e completar os poços com menos de três sementes por semente esterilizada e vernalized adicionais.
4. incubação e visualização das placas de triagem
- Incube as placas de triagem de fundo plano de 96 poços para quatro dias em uma câmara ambiental a 22 ° C em um ciclo claro/escuro de 16/8 em um recipiente à prova de dessecação. Visualize as placas de triagem 96 poços fundo plano sob um microscópio de dissecação. Grave todos os fenótipos aberrantes para maiores investigações.
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Representative Results
A capacidade de precisão e eficiência caracterizam fenótipos baseados a adição de pequenas moléculas em concentrações sob um microscópio dissecação de triagem é o objetivo final deste método de frente química genética em Arabidopsis. Os fenótipos observados quando todos os 50.000 compostos tinham sido selecionados era diversos e pode ser dividida em várias classes distintas (Figura 2). Figura 3A -F mostra exemplos de fenótipos observados na ampliação baixa sob um microscópio de dissecação. Alguns fenótipos fornecido resultados inconclusivos (Figura 3, H). Estas tinham que ser reanalisada em concentrações inferiores para garantir que o produto químico não fornece um fenótipo diferente em uma dose mais baixa.
Maus resultados podem surgir por muitas razões. Um é taxas de pobre de germinação das sementes. Isso pode causar um prato de rastreio apresentar predominantemente não germinação ou fenótipos incompleta de germinação (Figura 3, H), que pode ser enganosa. Para superar isso, pré-teste taxas de germinação para todas as sementes utilizadas. Uma vez que taxas de germinação foram estabelecidas e são mais de 95% de Arabidopsis, vernalização de sementes antes da adição de química é um passo chave, garantindo a germinação simultânea. Falta de germinação simultânea pode levar a resultados falsos positivos fenotipagem. Além disso, os maus resultados podem surgir se a mídia for permitida evaporar durante a incubação. Esta falta de hidratação impede a germinação de sementes e pode ser evitada através da utilização de recipientes à prova de dessecação. Além disso, soluções de DMSO e mídia estão nas duas colunas externas de cada placa, garantindo adequadas micro climas e obtêm-se taxas de germinação.
Resultados experimentais satisfatórios são obtidos quando as taxas de germinação são > 95%, as sementes são vernalized antes da adição em placas de 96 poços de fundo plano, garantindo a germinação simultânea, e meios de comunicação não evapora durante a incubação. Idealmente, os produtos químicos seria testados em uma concentração que permite que todas as sementes para germinar e fenótipos a avaliar com precisão (Figura 3A-F). A maioria das mudas produzidas de tratamentos com fenótipos que eram visualmente indistinguíveis dos controles simulados com nenhum fenótipos morfológicos (Figura 3A), com a grande maioria dos fenótipos aberrantes, consistindo de branqueada e severamente atrofiado raízes (Figura 2).
Figura 2: os fenótipos mais comuns observados e a proporção de cada fenótipo observado. A) um total de 3.271 pequenas moléculas foram encontrados para ser bioativos em 100 µM após quatro dias de incubação. A cor indica a severidade do fenótipo (preto = mais grave, branco = menos grave). O mais comumente observado fenótipo pertencia a morfologia da raiz, com mais de 1.500 compostos indução atrofiadas raízes de gravidade variável. Coloração foi também comumente afetada pelos compostos nessa biblioteca, com 1.148 mudas registradas como branqueada totalmente ou parcialmente descoloridos. Pouco menos de 400 compostos produzidos fenótipos distintivo de raiz de cabelo – ou atrofiados ou ambos atrofiado e coloridos. Finalmente, germinação foi afetada pelo menos 200 compostos. Nestes casos, as sementes não fizeram concluída a germinação ou ainda não começou a germinar. B) mudas apresentando anormalidades na morfologia da raiz, também sendo atrofiadas ou severamente atrofiadas, constituíam quase metade de todas as mudas fenotipicamente aberrantes. O próximo grupo maior foram os que resultaram em mudas branqueadas ou descoloridas. Fenótipos que pertenciam ao anormalidades de pelos radiculares também feitas uma parte considerável, enquanto a inibição da germinação, ou não germinação ou germinação incompleta, só ocorreram em uma pequena percentagem de todos os compostos bioativos. Finalmente, havia um número de fenótipos que ocorreu numa frequência tão baixa, eles foram agrupados na categoria 'outra', um exemplo do que foi a produção de mucilagem verde, vista na Figura 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagens de fenótipos representante observaram durante a tela de frente química genética. Sem anormalidades morfológicas visíveis (A), raiz marrons pelos radiculares (B), atrofiado raiz c, severamente atrofiado (D), descorado (E), verde de mucilagem (F), germinação incompleta (G) e não germinação (H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: visão geral da plataforma e empilhador 10 configurar antes do início do protocolo. O carrossel de empilhador é composto por quatro empilhador do 10 (Hotéis A - D) que acomodar dez quartos cada. O Deck possui uma variedade dos Alpes: o carregador de ponta, o serviço de transporte do empilhador, lavagem de multicanal dica e 13 Alpes estático. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: empilhador 10 e Deck configurar necessária para a criação de uma biblioteca de diluição. Os quatro 10 empilhador são carregados com caixas de pontas de pipetas AP96 P20 em salas 1 e 6 de hotéis A - D e pilhas de quatro V 96 poços-placas de fundo nas salas 7-9 2-5 e quartos de hotéis A - m. O layout do baralho é composto por dois reservatórios de 300 mL na estática Alpes P3 e P7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: empilhadeira 10 e Deck configurar para mistura de sementes de mídia adicionando para placas de triagem. 10 o empilhador é carregado com quatro televisões de 96 poços-placas de fundo nas salas 1 e 2 do Hotel A. O layout do baralho é composto por dois reservatórios de 300 mL estático Alpes P3 e P7 e uma caixa de pontas de pipetas AP96 P250 na TL1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: empilhador 10 e Deck configurado para adição de pequenas moléculas para placas de triagem. 10 o empilhador é carregado com uma caixa de pontas de pipetas AP96 P250 na sala 1, uma pilha de dois V 96 poços-fundo diluição placas em quartos de 2, 4, 6 e 8 e uma pilha de duas televisões de 96 poços-placas de fundo preenchido com a mistura de sementes de mídia em 3 quartos , 5, 7 e 9. O layout do baralho é composto por dois reservatórios de 300 mL na estática Alpes P3 e P7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo é projetado para ajudar os pesquisadores a conseguir uma tela frente química genética em Arabidopsis. Nós fornecemos resultados representativos de uma tela de 50.000 compostos (Figura 2 e Figura 3), uma das maiores telas frente química genética realizada em Arabidopsis até à data de13,9,23. O uso de um robô de manipulação líquido habilitado mais eficiente biblioteca de diluição e geração de biblioteca de triagem, melhorando a velocidade e a eficiência de identificação de novos compostos. Aumentando a capacidade de tela na natureza alta taxa de transferência foi acompanhada pela diminuição do trabalho em nome do pesquisador. Esta técnica foi projetada para ser usado com placas de 96 poços, que podem acomodar pequenas sementes ou plantas visíveis sob um microscópio de dissecação. Utilizar placas com poços maiores para caber as sementes maiores exigiria modificações para a taxa de transferência e design.
Limitações adicionais desta técnica incluem a dificuldade de usar esta peça de equipamento com técnicas assépticas; no entanto, não tenhamos encontrado altas porcentagens de contaminação devido aos meios MS ½ falta de sacarose. Um poderia contornar qualquer problema de contaminação, colocando o robô em uma sala estéril, permitindo condições estéreis e cultura de células, ou usando um robô de manipulação de líquidos com uma câmara estéril de24,25. Outra limitação é o tamanho da ponta e aspiração de semente. Uma ponta de pipeta pequenas tais como o AP96 P20 iria entupir com sementes; Portanto, uma maior ponta da pipeta deve ser usada para distribuição de sementes e mistura de solução.
Passos críticos neste protocolo incluem a rotulagem cuidadosa de todas as placas na biblioteca de diluição e biblioteca de triagem, garantindo que eles estão na orientação adequada junto com a ordem correta quando alimentando o robô. Clara a rotulagem e tratamento sistemático é simples e pode superar esse problema. Outro passo crítico é assegurar que o equipamento certo esteja no lugar correto antes de iniciar o experimento, tanto dentro do 10 empilhador e no convés. Se o equipamento não está devidamente colocado no convés, o 96 canais de 200 µ l cabeça podia falhar, danificando o instrumento e que exigem manutenção. Outro passo crítico é assegurar que a quantidade correta de líquido é colocada dentro dos reservatórios de 300 mL e que este montante é inserido corretamente o software. Se os números não batem, as dicas não atingirá o líquido e aspiração não ocorrerá.
Também é necessário tomar medidas para assegurar que os resultados obtidos sejam precisos. Um erro que notamos durante o desenvolvimento do protocolo estava ligado a vida de ponta. Após sucessiva carga e descarga, as pontas perdem a capacidade de aspirar e dispensar com precisão. Portanto, é imperativo que cada conjunto de 96 dicas é usado um máximo de quatro vezes. Também é importante mudar a água de lavagem regularmente para evitar o potencial de produtos químicos inadvertidamente ser adicionado a pratos de triagem. Finalmente, algumas substâncias químicas têm uma tendência a precipitar a solução26. Para garantir que cada produto químico é adicionado na concentração correta, etapas de mistura são incorporadas a diluição e o protocolo de triagem. A mistura pode resultar em baixas quantidades de produtos químicos sendo adicionado de biblioteca para biblioteca, desafiante interpretação de potencial químico induzido fenótipos.
Usando a placa correta para cada parte do protocolo também é muito importante. Placas de V-Bottom são projetadas para garantir que os pequenos volumes de líquido podem ser aspirados e são recomendados para uso na criação da biblioteca de diluição. No entanto, estas placas não são adequadas para a triagem de parte do protocolo, desde que seu reflexo de luz conduz a pobre visualização dos fenótipos. A fim de respeitar os fenótipos de 3-4 dias velhas mudas, a tela deve ser efectuada em placas de fundo plano.
Uma vez que as placas de triagem foram criadas, a visualização é necessária. placas de 96 poços de fundo plano permitem a fácil visualização sob microscópios de dissecação. É imperativo que as chapas são armazenadas em recipientes à prova de dessecação para reduzir a evaporação dos meios de comunicação. Uma alternativa para visualização microscópica é usando um scanner de alta resolução. Imagens produzidas em alta resolução revelam a maioria dos fenótipos observados nesta tela e fornecem um arquivo dos resultados que pode ser revisitada no futuro. Uma vez que a visualização está completa, e a biblioteca de sua escolha selecionados, este método então podia ser feito em diferentes organismos, ou com uma biblioteca de química diferente. Modificações no equipamento podem permitir para cultura estéril, permitindo empreendimentos nos reinos de células-tronco, fungos, insetos e plantas pequenas2,18,25,27.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Agradecemos a cegonha Jozsef, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue e Andrea Sanchez para discussão crítica e construtiva. Dr. Sharyn Perry para as fotografias fenotípicas. Este material é baseado em trabalho, apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob cooperativa acordo n. º 1355438.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
- Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
- Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
- De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
- Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
- Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
- Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
- Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
- Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
- Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
- De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
- Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
- Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
- Center, A. B. R. Seed Handling. , The Ohio State University. Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013).
- Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
- Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
- Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).
