Summary
ここでは、側方開胸による横方向の大動脈狭窄 (TAC) のプロトコルを提案します。この手法は、圧負荷および TAC 研究室の標準設定を利用したマウスの心臓障害をシミュレートすることを目指して低侵襲、閉胸手術です。
Abstract
心肥大・心不全研究頻繁、TAC による圧力オーバー ロード マウス モデルに基づいています。標準的な手順は、横方向の大動脈弓を視覚化する部分的な開胸手術を行うことです。ただし、開胸モデルにおける開胸手術による外科的外傷は、肋骨を切除し、左開胸後未接続呼吸生理を変更します。これを防ぐためには、側方開胸による低侵襲、閉胸アプローチを設立しました。ここに取り組んで大動脈弓 2nd肋間間隙を介して胸部キャビティを入力せず少ない外傷から回復すると、マウスを残しています。等しい生存率で開胸タック プロシージャの標準的な実験室の設定を使用してこの操作を行います。閉胸アプローチのための生理学的な呼吸パターンを維持し、離れてマウスは外傷後の免疫反応を減らすために高速治癒過程を容易にする表示されます低侵襲技術として急速な回復を示すことによって恩恵を受けるようです。
Introduction
マウス モデルは人間の病気1を模倣するために使われます。圧負荷を誘発する横方向の大動脈狭窄 (TAC) を使用し、左心室肥大2。ロックマンらによって検証されたマウスにおける開胸タック モデル3外科的処置は DeAlmeidaらによって、詳しく説明します。4します。 横方向の大動脈のバンディングは腹部大動脈狭窄と比較してより有利な循環のより大きい部分は、この後者の手順2の負の影響を補うことができますので。
昇順大動脈および腕頭動脈で、増加する動脈圧につながる大動脈横のバンディングが、(すなわち左総頸動脈、左鎖骨遠位血管を介して臓器の十分な血流を葉動脈および大動脈)。これは向上心後負荷と昇格した心臓壁のストレスに します。壁応力は、その後繊維肥厚5による減少します。慢性心臓血行動態変化は不適応と左の心室の膨張の結果します。こうすると、TAC は、最終的に心不全につながる心臓肥大の再現モデルを作成します。
DeAlmeideらによる記述で TAC の標準的な手順4肋骨または胸骨と縦隔と胸腔に入る郭清による部分上部開胸による大動脈弓に近づきます。大動脈弓とその側枝の良い表示が可能になります。残念なことに、切り裂かれた肋骨を再アタッチできません、それらの葉が浮遊していると、呼吸のダイナミクスを変更すること。
、我々 はしたがって、2nd肋間間隙を介して横外科的アプローチを使用して大動脈弓へ低侵襲閉じた胸アプローチを確立しました。このモデルの最大の利点は、肋骨を介しても切断せずに TAC を実行する機能です。周手術期は皮膚の切開と肋間筋の解剖に限定されます。このプロシージャは自体外傷を最小限に抑える、十分な胸の安定性を維持するのに役立ちます。
ここで我々 はマウスの合計または上部開胸を行わず TAC 手術を実行する詳細な手順をについて説明します。高周波ドップラーは、TAC の成功は前述した6,7を確保するためだった。
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Protocol
このプロトコルは、動物実験 LANUV レックリングハウゼン (#84-02.04.2016.A374) の倫理委員会によって承認されました。成体マウスでこの手順を実行する一般的には、> 10 週齢。しかし、若い動物と同様にこの手術を行うことが可能です。手術器具は、使用前に滅菌する必要があります、すべてのステップが無菌条件の下で実行されます。
1. 麻酔の挿管誘導
- 痛みを軽減するため腹腔内ブプレノルフィン 0.1 μ g/g の体重を注入します。手術後の次の 3 日にブプレノルフィン 0.1 mg/kg 8 時間毎の投与を繰り返します。
- 誘導、イソフルランの 3.0 の巻 %1 L/分の酸素流量の設定気化器に接続されている麻酔誘導ボックスにマウスを配置します。
- 触覚刺激を誘導することによって深い麻酔を確認します。
メモ: イソフルランの増加 Vol % まで 5%、麻酔導入に失敗した場合は麻酔は十分に深くないです。 - 反射がないことを確保するのには、マウスの尾をピンチします。反射の完全な不在は、最適な人工呼吸器設定のマウスの重量を量る (1.12 を参照)。
- プロシージャ全体で 37 ° C の体温を維持するために温度制御オペレーティング テーブルにマウスを移動します。
- 麻酔の維持麻酔誘導ボックスに接続されているプラスチック製のコーンに、マウスの鼻を配置します。
- ナイロン縫合糸で、マウスの上顎を固定します。粘着テープで手足を固定します。
- 十分な麻酔を再び確保する鉗子の先端で後肢に圧力を適用します。逃避反射の不在で、次の手順に進みます。
注: は麻酔導入が失敗するか、麻酔は十分に深くない場合イソフルランの容積 % を増加し、逃避反射の不在を待ちます。 - 麻酔下での乾燥を防ぐために角膜に滅菌眼科用潤滑剤を配置します。
- 直腸の外傷を避けるため直腸プローブを塗ります。37 ° C の体温を確保するための直腸温度プローブを挿入します。
- 喉と胸の上部と製造元の指示に従って脱毛クリームを depilate します。1 分後、クリームを拭き取る。必要な場合は、成功するまでこの手順を繰り返します。
注: は、出血した場合は綿棒を使用します。 - 70% のエタノールの depilated 領域を清掃します。ポビドン ヨードは、皮膚消毒 3 回、少なくとも 3 分を適用します。
- 生理学的パラメーターに人工呼吸器の設定を調整します。150/分と 8-10 μ L/g 体重 (BW) 換気量に呼吸速度を設定します。
- 滅菌手袋の新しいペアに置きます。手術顕微鏡下にマウスを置き、マウスより滅菌穴開きドレープを配置します。
- 正中 2ndリブまで下顎で約 3 mm の皮膚を切開します。正中線や顎下腺の結合組織を識別します。関節包内鉗子を使用して優しく 2 つの鉗子で露骨に正中線で腺を分割し、気管筋を探索します。
- パラ気管の筋肉を関節包内鉗子で露骨に離れて引っ張って気管をゆっくり準備します。
- 簡単に挿管条件の喉をまっすぐにし、気管内挿管カニューレ (外径 1.2 mm) をそっと挿入鉗子で舌を引っ張ってください。気管内チューブの直接可視化し、適切な胸の動きをチェックして、挿管を確認します。
- 1.0 L/分、100% O2の流れと 2% イソフルランに対する挿管後イソフルレンの濃度を調整します。
注: 呼吸運動が停止しない場合、マウス移動を開始最初 180/min まで呼吸数を増加します。必要に応じて、濃度を高めるイソフルラン 3.5% 第二マウスが独自に呼吸を停止するまで。最も一般的な問題として、漏出または気化器の不十分な詰物を評価します。 - また、次の sub 手順で推奨されている気管挿管を行います。
- 60 ° の角度でテーブルの上のマウスの位置。
- 固執粘着テープでマウスの四肢と頭部のリクライニングします。
- 喉頭の上肌に直接冷光光源を配置します。
- 声帯を視覚化するための鉗子で、舌を優しく引き出します。
- 声帯を介して IV 型カニューレ (24 G) のプラスチック製のチューブを挿入し、人工呼吸器設定にプラスチック製のチューブを接続します。
- シンクロン胸の動きによって挿管を確認するためカニューレに人工呼吸器を接続します。
注: 呼吸運動が停止しない場合、マウス移動を開始最初毎分 180 まで呼吸数を増加します。必要に応じて、濃度を高める二次イソフルラン 3.5% までマウスが独自に呼吸を停止するまで。最も可能性の高い問題として漏出または気化器の不十分な詰物を評価します。
2. 術前計測法
- 鉗子で結合組織を軽く引き離すによって気管を置く補助の両方の頸動脈を準備します。
- 左右 45 ° より小さい角度で左内頚動脈にいくつかの滅菌された超音波ゲル 20 MHz ドップラー プローブの先端を配置します。
- 外側と内側に検索しドップラー信号を信号を最適化するためにプローブを傾斜移動するプローブをゆっくりと回転させます。
- ドップラーのソフトウェアを使用して表示し、右と左総頚動脈コンピューター上で流速を格納します。
3. 開
- 手術部位感染を防ぐためにそれぞれの個々 のマウスの滅菌手袋のセットを使用します。
- ハサミで 2nd肋下切開を展開します。
- 肋骨を数えることで、2ndの肋間スペースを視覚的に識別および関節包内鉗子でこのスペースをにべもなく浸透します。
注: 1st肋骨、鎖骨の下にある、したがって表示されません最初目に見えるリブ (すなわち2ndリブ) と 3rdリブ間 2nd肋間スペースを見つけたので。 - 鉗子のヒントの助けを借りて 2nd肋間スペースを開き、リトラクターを挿入します。
- 胸腺の明確な見解を持っているオペレーティング テーブルに接続されているゴムバンドで、リトラクターを調整します。
- 出血の場合綿の先端を使用し、2 分の表在性の血管に押します。
4. 横方向の大動脈の縞模様
- 正中線や結合組織を識別するために 200% に倍率を調整します。鉗子を使って優しく胸腺を分割します。大動脈弓は明らかに見ることができるまでは、脂肪組織を削除します。
- 斜め下 (図 1参照) 腕頭動脈と左総頚動脈間横断の大動脈鉗子を結ぶトンネルを準備します。微細鉗子の助けを借りて 6.0 縫合糸の端を保持し、大動脈のアーチの下のスレッドを渡します。
- アーチの反対側から 2 番目の鉗子でスレッドを取る。
- 27 G の針を使用する長さは 3 mm 長い部分を切断、マウス マウス用スペーサーとして 19 25 g 体重 26 G 針と計量用 TAC 結紮用スペーサー > 25 g BW。
- 横方向の大動脈に平行スペーサーを慎重に配置します。
- スペーサーを緩い二重結び目を準備し、大動脈に平行にスペーサーの最適な配置を確保します。最初のスローを結び、すぐに 2 番目の逆スローを実行します。スペーサーを速やかに削除します。
- コントロールで偽マウスを実行するには、大動脈結紮を省略する同じプロトコルに従います。
- 6.0 ポリプロピレン縫合糸で 2nd肋を閉じます。縛ること鎖骨下動静脈に特別な注意を払います。
- 連続縫合パターンで 6.0 ポリプロピレン縫合糸を使用して皮膚を縫合します。
5. 横大動脈結紮の確認
- セクション 2 のように 45 ° の角度で首の両側に 20 MHz ドップラー プローブを配置します。
- それぞれの側に流速を文書化します。
注:図 2に示すように、成功した TAC はドップラー流速によって検証できます。左右の内頚動脈は通常間 4 - 10 フロー速度比により十分な TAC (図 2参照)。
6. 心の収穫
- 1.2 の手順に従って酔いを誘発します。1.3。
- 安楽死室にマウスを置き、ボリューム/分の 10-30% を転置する炭酸ガスの流量を調整します。
- 手術テーブル上でマウスを固定します。詳しく分析するためカニューレと下大静脈からハサミと収穫の血と腹部を開きます。
- 強力なハサミで、横隔膜と胸骨の骨をカットし、中心部を削除します。
- 心を計量する前に、すべての動脈と結合組織を削除します。
- 右心室と左心室の中隔を分離し、両方のサンプルの重量を量る。
- 両方の組織サンプルを液体窒素で凍結します。
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Representative Results
成功した TAC は、圧負荷、左室肥大の誘導を保証します。圧負荷のアドホック検証は、図 2に示すように、ドップラー流速測定を使用して実現できます。術前の血流速度は両方の頸動脈に等しいが、TAC は、拡張血速度左心室および大動脈圧の上昇により右頚動脈後狭窄弱毒血流速度を起こしながら、左頚動脈。
TAC とその結果肥大の効果は、心重量/体重比 (HW/BW; mg/g) c57bl/6 j 日 3、6、および 21 日後手術で男性マウスの計算によって検証されました。TAC マウス マウスの非バンドに比べて術後後 6 日目に有意に増加した HW/BW 比 (4.78 ± 0.18 vs7.66±1.43 mg/g, p < 0.0001)。21 日後、この比率はほぼ一定 (4.8 ± 0.11 vs7.81 ± 0.65 mg/g, p < 0.0001) (図 3参照)。生存率は主に術中出血に依存: 定期的な練習を 5% 以下に減らせます。21 日後の生存率は、主に遺伝子型に依存します。マウスの生存率金額機能的心臓病から苦しんでいない > 85%。21 日後発表した c57bl/6 j マウスの生存率は 88% に達した。
収縮期血圧と心機能は挿管麻酔で測定され、他の人が説明した 1.4 フランス圧力コンダクタンス カテーテル8で実行します。9心拍数 (HR) が左心室 (LV) 収縮に大きく影響します。大動脈バンドおよび非大動脈バンド マウスの心拍数 (HR) に差は認められなかった (p = 0.1456) 21 日 (図 4 aを参照してください)。大動脈の定数バンド (p = < 0.0001) 測定 (図 4 bを参照) 21 日後増加収縮期血圧によって証明されました。
文献で議論されていると c57bl/6 j マウスは TAC 後収縮機能障害10偏心肥大を開発する呼ばれます。また圧力体積測定の重要な表示される左室径の増加が発見されました。収縮末期容積 23.31 μ L (± 1.617µL) 16.25 μ L (± 1.935 μ L) から増加しました。この変更は有意であった (p = 0.0131) (図 4を参照)。末期容積幅 31.24 μ ± (1.093 μ L) 25.81 μ l (± 1.852 μ L) から増加しました。この変更は有意であった (p = 0.0268) (図 4を参照)。
TAC を比較して偽のグループ ボンフェローニのposthocテストに続いて一方向の分散分析を行った。圧力体積測定の場合グループは、ウェルチの補正と対になっていない t 検定を用いて比較した.± SEM (誤差範囲) のことを意味は、すべてのデータを提示されています。
図 1: 200% の倍率で 2nd肋間間隙を介して手術アプローチ。この写真は手術顕微鏡で撮影された、大動脈弓腕頭動脈と左総頚動脈間のスレッドを表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 代表的な両方の頸動脈 (TAC マウス対偽) からパルス波ドップラー イメージング。A)タックの前に左頚動脈のパルス波ドップラー イメージング。B) TAC 前に、右頚動脈のパルス波ドップラー イメージング。C)画像に関するパルスコロナ波 TAC 後左頚動脈のドップラー。血流速度は、図 2 a に比べ、.D)タック後右頚動脈のパルス波ドップラー。図 2 b と比較して血流速度が増加します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 心臓の重量/体重比をボディします。心臓肥大は、TAC により誘導されます。心重量/体重比の大幅な増加でこれを示します。大動脈バンディングせずマウス (すなわち。 偽マウス; 白いバー) 3、6、および 21 日後運営 TAC マウス (黒いバー) と比較されました。6 日 TAC 心重量/身体の重量比は TAC マウスで有意に増加した後。この効果は、わずか 21 日後顕著です。意義に p に設定された = < 0.05。ns = ではない重要です。p < 0.0001。データは、± SEM (誤差の範囲) を意味するように示されます。n = グループあたり 6-9。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 血行動態的パラメーター測定マウス (c57bl/6 j) における圧-容積カテーテルを介して TAC と術後後 21 日目: A)ビート/分 (bpm) の心拍数 (HR)。侵襲的な測定中に匹敵する麻酔を示す両方のグループの人事の違いはありませんでした。B)右総頸動脈 (sBP) 収縮期血圧。21 日後 sBP の大幅な増加は、大動脈弓の定数収縮を示します。C)収縮末期ボリューム (ESV) が有意に増加した (p = 0.0131) 21 日とショーの後、TAC による増加後負荷を心室の拡張を誘発します。D) 末期容積 (ESV) が増加 (p = 0.0268。意義に p に設定された = < 0.05。ns = ではない重要です。* p < 0.05;p < 0.0001。データを提示する意味 ± SEM (誤差の範囲);n = 8-13 グループごと。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
TAC による高血圧の急激な発症は、大動脈弁狭窄症や高血圧によって引き起こされる臨床的に関連の肥大によって異なります。それにもかかわらず、心不全を誘発する小さな動物モデルの使用は多くの利点し、は、したがって、多くの調査官11によって選ばれています。この閉胸モデル マウス4で横方向の大動脈狭窄を誘導する手技の既存モデルが向上します。
最も重要なステップは、大動脈のアーチの下の通路です。きつすぎる縫合腹部大動脈周囲腎臓など重要な臓器への血流の低下が致命的な可能性があります。ハーゲン ・ ポアズイユの法則に従って流れは主に半径に依存です。したがって、いくつかの体重に適応したスペーサーは、我々 のプロトコルで使用されました。この手順は、個々 の実験のセットアップに応じて、非常に若いまたは古いマウスについて、特により普遍的に適用可能なこのモデルを作る。
外科的外傷自体免疫応答を誘導して防ぐために絶対的な最小値に還元すべき歪曲的な効果。高速リカバリと高い生存率が複雑な動物モデルを中心に、必須です。歴史的に、人間の患者に開胸とは異なりマウスにおける胸郭は TAC 手術後は復元されません。したがって、生理的な呼吸運動に反発は胸骨に再接続されません無料の浮動肋骨のため限定されます。
TAC の低侵襲技術がまた12,13他の人によって使用されます。両方のモデルで大動脈弓は正中切開, 胸骨の上部部分切開を通して達されます。両方のモデルが開胸のモデルよりも低侵襲、外科医は肋骨や大動脈に到達する胸骨の部分を削除しなければなりません。全体胸郭エイズの迅速な復旧の生理機能を維持すると考えています。したがって、このプロトコルが既に既存のプロトコルを改善、外科的外傷自体を最小限に抑えること。
根尖外科アクセスによる肺、気胸や無気肺の予防のための手術後のインフレとして時々 記述されている4,14をされている必要はありません。このアクセスは、既存のモデルに無気肺を開く呼気管をクランプによって誘導されうる肺の barotrauma を防ぎます。このプロトコルには、個性の生理的な換気戦略も含まれています。Barotrauma など人工呼吸器関連の合併症を減らすことで個別に適応換気を助けることを推測する魅力的です。適応体重換気戦略15自体換気による全身性サイトカイン産生に及ぼす影響を避けるために使用されました。
結論としては、これらの技術は、マウスにおける心肥大を誘導するため代替、改良されたモデルを表します。
開胸の回避によって外傷を最小化すると、炎症の減少に関する優れた効果はこの文書で表示されません。残念ながら、動物保護の法律によって設定された制限ではこの低侵襲モデル年、すでに確立されているので、比較のための最小限の侵襲的な TAC と並行して開胸タックを実行する私たちを許可しませんでした。したがって、これらのステートメントは、当社の過去の経験に基づいています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
その技術支援、はなフレードとスザンヌ シュルツに感謝します。本研究は資金を受けてないです。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Pressure-volume catheter | Millar Instruments, USA | SPR-839 | |
Mouse ventilator | Harvard Apparatus GmbH, Germany | Minivent - TYPE 845 | |
Mouse ventilator | Harvard Apparatus GmbH, Germany | Y-connection with intubation cannula OD 1.2mm 73-2844 | |
Vaporizer | Dräger Medical AG&CO.KG, Germany | 19.3 Isofluran-Vaporizer (a newer version is available under catalog number D-877-2010) | |
Microscope | Leica Microsystems, Germany | MZ 7.5 | |
Light source | Schott AG, Germany | KL 1500 LCD | |
6-0 Prolene | Ethicon, USA | Polypropylene suture BV-1 9.3 mm 3/8c | suture for surgery |
Seraflex | Serag Wiessner, Germany | USP 5/0 schwarz; IC108000 | suture for constriction |
Homoeothermic Controlled Operating Tables | Harvard Apparatus GmbH, Germany | Typ 872/3 HT with tripod stand and homoeothermic controller Type 874; 73-4233 | |
Flexible Rectal Probe | Harvard Apparatus GmbH, Germany | 1.6 mm OD; 55-7021 | |
Doppler Signal Visualisation Instrument | Indus Instruments, USA | Doppler Signal Processing Workstation (DSWP) with 20MHz Pulsed Doppler Module | |
Arruga Intracapsular Forceps | Altomed, UK | A5400 | |
Doppler Probe | Indus Instruments, USA | 20MHz Tubing-mounted Probe | |
Jaffe Lid Retractor | Altomed, UK | A3513 |
References
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