Summary
人类胚胎干细胞的自我更新和分化成人体的所有细胞类型的能力，表明他们持有为医疗作为解决发展和疾病的根本问题的研究工具的应用和巨大潜力。在这里，我们提供了一个简洁，为人类胚胎干细胞来自胚胎内细胞团由immunosurgical隔离的推导一步一步的协议。
Abstract
人类胚胎干细胞的自我更新和分化成人体的所有细胞类型的能力，表明他们持有为医疗作为解决发展和疾病的根本问题的研究工具的应用和巨大潜力。在这里，我们提供了一个简洁，为人类胚胎干细胞来自胚胎内细胞团由immunosurgical隔离的推导一步一步的协议。
Protocol
冷冻人类胚胎用于人类胚胎干细胞（HES）推导捐赠了研究，研究委员会人类受试者使用的胚胎干细胞研究监督委员会审查和批准在哈佛大学协议下的适当的知情同意。
书面协议，下面是基于考恩等人报告公布的参数。 2004年，稍作修改。
胚培养
解冻使用滴15％Plasmanate补充，直至发展到扩大囊胚阶段的全球性媒体奎因的优势解冻套件和文化的人类胚胎。
Immunosurgery基于隔离的内细胞团
制备方法：
- 准备拆除的透明带和immunosurgery（见下文）设立滴的解决方案中的每个10厘米板的板。与矿物油覆盖，以防止水分蒸发。准备单列推导打算每个胚胎。
- EmbryoMax酸性Tyrodes，使用的是。
- 胚胎干细胞衍生的媒体：KO - DMEM 75％，10％十五分血清替代，10％Plasmanate，2.5％的胚胎干细胞的测试胎牛血清（FBS），2MM Glutamax我，1％非必需氨基酸，50个单位/ ml青霉素，50μg/ml链霉素，0.055mM B -巯基乙醇，5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。
- 兔抗人红细胞抗体，重组，根据制造商的建议，在1:10稀释与胚胎干细胞衍生的媒体。
- 豚鼠补体血清，重组，根据制造商的建议，在1:10稀释与胚胎干细胞衍生的媒体。
- 至37 ° C的组织培养箱内培养，使用前所有板块平衡。
- 在传输胚胎中使用拉50μL-100μL毛细管移液器（VWR）。切割钻石笔，并配备了一个0.2微米的过滤器使用的口吸管管两端。
Immunosurgery程序：
注：
- 在此过程中，滋养层细胞进行了简短的接触对人体细胞的抗体在补体活性的同时的破坏。因此，协议的工作原理最好的一个完整的滋养层的高品质的胚胎，因为只有胚泡的结构完整性，防止也正在受到免疫反应的ICM。
- 所有的程序执行，使用配备加热阶段的清扫范围。
步骤：
- 漱口吸管与FBS的胚胎转移，以防止胚胎粘连。
- 囊胚从培养皿转移到胚胎举行的AT菜下降。
- 开始转移从胚泡的胚胎干滴通过一系列降的过程。在第三个下拉，看溶解透明带（通常是5-30秒）。小心，不要过度治疗或胚胎的完整性可能会受到影响。
- 通过一系列的胚胎干细胞衍生的媒体转移囊胚滴在冲洗。堆载预压与媒体的吸管是建议立即在反应中和。囊胚可以在这里举行，直到所有的加工。
- 通过一系列抗体滴胚泡转移，留在第三个下拉在37℃孵育30分钟一个组织文化的孵化器中的C。
- 通过一系列的胚胎干细胞衍生的媒体传输囊胚滴用清水冲洗干净小学。
- 通过一系列的补充滴胚泡转移，在第三个下拉留下来观看滋养层细胞裂解。 “冒泡”的滋养层细胞裂解，因为他们在舞台上的前30秒，观察囊胚。如果在这段时间内观察，裂解，保持菜在显微镜阶段监测的反应，直到完成。如果没有冒泡的前30秒时，返回到孵化器，检查每5分钟，直到大部分的滋养层有溶解。这可能需要5-15分钟。密切监控反应，以尽量减少反应时间和潜在的损害胚胎内细胞团。
- 通过一系列的胚胎干细胞衍生的媒体转移囊胚滴洗掉补体活性。
- 略高于囊胚（10μLVWR毛细管拉）小直径是使用玻璃吸管，吸取囊胚和向下剥离大部分裂解的滋养层。
G“ALT =”574_Figure - 0“宽度=”577“HEIGHT =”270“/> - 板ICM的隔离到饲养层细胞的分裂灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。 MEFs应准备推导前一天，并切换到胚胎干细胞衍生的媒体日。 4 NUNC菜很好的工作推导的最初步骤。
- 请勿打扰板第1-2天。此后，每天检查胚胎干细胞克隆的产物（通常1-2个星期内明显）。媒体应改变在半卷第3天开始隔日。
ES细胞的生长和传代
当胚胎干细胞的生长已达到大约0.5mm或更多，这是准备扩大机械采摘。
- 机械分散一半的生长和转移到含有新鲜馈线的新盘。胚胎干细胞团块应约30-50每一个细胞。保留一个备份为第一段（P1）另一半的产物。从几次，因为它的不断扩大，可以捡到的产物（P0）。
- 中学殖民地可以用同样的分散和扩大，直到通道3-5，此时新的细胞株可适应酶与胰酶传代，跨越更大的培养皿。血清培养基内容也应逐渐减少，在这些初步的通道，以1％和0％，以尽量减少胚胎干细胞的分化。
- 所有建立的胚胎干细胞系应冻结，为未来的扩展早期通道的一部分库存。
- 此外，每个单元格的行应为特征染色体核型分析，并在体外和体内的多能性和分化的研究证实。
Discussion
这里介绍的协议，为研究人员提供一个简洁，易于后续如何推导出由immunosurgical内细胞团分离人类胚胎干细胞系的轮廓。
Acknowledgments
AEC是一个简棺材尔兹纪念基金为医学研究和默克研究实验室的研究员。我们感谢D. Egli和C.考恩实验的意见和讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quinn’s Advantage Thaw Kit | Sage | ART-8016 | |
| Global medium | Life Global | GMGB-050 | |
| Plasmanate | Talecris | 61325 | |
| EmbryoMax Acidic Tyrodes | Chemicon International | MR-004-D | |
| KO-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KO-Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| ES cell-tested fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-079 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Recombinant human basic fibroblast growth factor | Invitrogen | 13256-029 | |
| Beta-mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| Rabbit anti-human red blood cell primary antibody | Rockland Immunochemicals | 109-4139 | |
| Guinea-pig complement serum | Sigma-Aldrich | S-1639 | |
| Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes | VWR international | ||
| Mouth pipettes with tubing | VWR international | supplied with capillary pipettes from VWR | |
| 0.2 microm Acrodisc syringe filter | Pall Corporation | PN4192 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-120 | |
| Tissue culture dishes | VWR international | ||
| Tissue culture dishes | Nalge Nunc international | ||
| Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (E12.5) |
References
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).
