Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Yalıtım Normal kolon ve kolorektal Karsinom - gelişmiş bir iletişim kuralı üzerinden insan endotel hücrelerinin

Published: April 4, 2018 doi: 10.3791/57400
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4, 4, 2, *2, *1
1Division of Molecular and Experimental Surgery, Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 3Division of Nephropathology, Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 4Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg
* These authors contributed equally

Summary

Tümör endotel hücrelerinin tümör microenvironment önemli belirleyicileri ve hastalığın seyrini vardır. Burada, saf ve uygun endotel hücre insan kolorektal karsinom ve uyuşturucu testi ve Patogenez araştırmalarda kullanılmak üzere normal kolon yalıtımı için bir protokol açıklanmıştır.

Abstract

Primer hücre insan karsinomlar izole patojenik mekanizmaları hastalık gelişme ve ilerleme katkıda bulunan tanımlamak için değerli araçlardır. Özellikle, endotel hücreleri (EC) oluşturan gemiler, iç yüzeyine doğrudan oksijen teslim, besin kaynağı ve kaldırma atık ürünlerin için ve tümör üzerinden dahil olmak ve böylece belirgin tümör Anayasada yer microenvironment (TME). Tümör endotel hücreleri (TECs) tümör ve stromal hücreler arasındaki iletişimi tarafından kurulan intratumoral microenvironment hücresel biyosensörler olarak kullanılabilir. TECs aynı zamanda tedavi hedefleri olarak hizmet. Buna göre kültür yanıt ya da anti-anjiogenik tedaviye karşı direnç mekanizmaları üzerindeki çalışmalar bu hücreler izin. Son zamanlarda, bu TECs sergi bellek benzeri efektler onlar elde edilmiştir belirli TME dayalı insan kolorektal Karsinom (CRC) izole bulundu. Ayrıca, bu TECs aktif belirli bir TME kurulması için farklı faktörlerin salgılanmasını tarafından katkıda bulunmak. Örneğin, bir prognostically olumlu Th1 TME TECs anti-anjiogenik Tümör baskılayıcı faktör salgılanan protein, asitli ve sistein benzeri 1 (SPARCL1) zengin salgılar. SPARCL1 gemi homeostazı düzenleyen ve tümör hücre çoğalması ve göç engeller. Bu nedenle, saf, uygun TECs insan solid tümör izole kültürleri tumorigenesis damar sisteminde rolünü fonksiyonel çalışmalar için değerli bir araç vardır. Burada, yeni bir güncel iletişim kuralı üzerinden normal kolon birincil EC hem de CRC izolasyonu için kullanılmıştır. Teknik doku mekanik ve Enzimatik sindirim, immunolabeling ve floresan aktif hücre (FACS) sıralama dayalı-üçlü pozitif hücrelerinin (CD31, VE-cadherin, CD105) sıralama. Bu iletişim kuralı ile uygun TEC veya normal endotel hücre (NEC) kültürleri 62.12 FACS sıralamaya tabi zaman % başarı oranı kurcalayarak kolon yalıtılmış olabilir (41 saf EC kültürler 66 doku örneği). Buna göre bu iletişim kuralını normal kolon ve CRC insan EC kültürler yalıtmak için sağlam bir yaklaşım sağlar.

Introduction

Tümör microenvironment (TME) tümör hücreleri yakın bir etkileşim ile endotel hücreleri (EC), perisitlerden, fibroblastlar, düz kas hücreleri veya bağışıklık hücreleri gibi hücrelerin oluşan tümör stroma olarak tanımlanır. Bu hücresel kompartmanlarda arasındaki iletişimi parakrin faktörler (Örneğin, anjiogenik büyüme faktörleri, sitokinler), hücre dışı matriks veya doğrudan hücre-hücre kişi tarafından kurulabilir. Stromal bölme teşvik veya tümör başlatma veya ilerlemeyi bağlı olarak kurulan belirli TME karşı koymak.

Damar sistemi ile bağlanma olanağı tümör ilerleme ve metastaz hastalığın anahtarıdır. Damar sistemi tümör ağırlıklı olarak oksijen ve besin teslim yanı sıra atık ürünlerin1,2,3kaldırılması erişim sağlar. EC damarlarının iç yüzey oluşturur ve bu nedenle bu sürece aktif olarak katılmak önemli hücresel bileşenleri. İyi tümör endotel hücreleri (TEC) karşılık gelen normal endotelyal hücreler (NEC) tarafından rahatsız hiyerarşisi ağacının damar, damar leakiness, gibi pek çok özellik için farklı veya azaltılmış bir takım tarafından olarak olgunlaşma azalmış olduğu bilinmektedir Sadece gevşek EC4' e bağlı perisitlerden/duvar hücreleri.

Bu nedenle, TECs karsinojenezis çalışmaya değerli hücresel araçlardır. TECs öncelikle tümör büyüme ve3teşvik etmek için kabul edildi. Böylece, TECs izleme izin biyosensörler ve patojenik işlemleri başlatmak, teşvik veya tumorigenesis karşı koymak tanımlaması kullanılabilir. Ayrıca, onlar5klinik tedavi hedefleridir. Sonuç olarak, izole TECs ve karşılık gelen NECs da araçları olarak yanıt ya da anti-anjiogenik tedaviye karşı direnç mekanizmaları anlamak için kullanılabilir.

Geçmişte, bu hücreleri6,7 yalıtmak için bir protokol geliştirilen ve TECs sadece NECs farklı değildir, ancak aynı zamanda birbirinden farklı8elde edilmiştir TME bağlı olarak teşhis etti. Bu yaklaşımla, bu belirli br TECs aktif tümör büyüme ve önlemek SPARCL1 gibi anti-anjiogenik Tümör baskılayıcı proteinlerin salgılanmasını tarafından gösterilmiştir. Bu TECs aktif insan kolorektal Karsinom (CRC)8prognostically olumlu bir TME kurulmasına katkıda belirtti.

Önceki çalışmalarda insan TECs solid tümör dan izole etmek çalıştı. Bu çalışmaların önemli bir hedefi olduğunu, Örneğin, yeni tümör endotel hücre işaretleri (TEMs)9tanımlaması. TEC fenotip kültür kaybı veya lazer mikrodiseksiyon değişiklik önlemek için uygulandıktan sonra TECs hemen kullanım stratejisi. Ancak, izleme çalışmaları duvar hücreleri bulaşıcı bir popülasyon bu yaklaşım10ciddi bir dezavantaj olarak tespit edilmiştir. Bizim laboratuvar saf, uygun TECs insan CRC hastalar6,7yalıtım izin bir protokol geliştirmek için ilk oldu. Bir yaklaşım ile birden fazla manyetik hücre seçimi (Mac) tur izole EC kültürlerin yüksek saflıkta sağlamıştır TECs seçildi. Ancak, bu yaklaşım kültür kaynaklı eserlerin riskini yükselten bir nispeten uzun yetiştirme dönemi (ortalama 6 hafta), gerekli. Bu nedenle, bir sonraki adımda, cerrahi ve hasat ilk saf kültür arasında yetiştirme süresini azaltmak için amaç oldu. Bu hedefe ulaşmak için ilk tümör kombine mekanik ve enzimatik tabanlı doku ayrılma istihdam gelişmiş bir iletişim kuralı takip (FACS) sıralama Floresans aktif hücre tarafından-üçlü etiketli EC sıralama geliştirilmiştir. Bu yalıtım zaman ortalama üç hafta için saf TEC ve NEC kültürlerde fonksiyonel çalışmalar için artan canlılık ile sonuçlanan azaltılmış. Yalıtım kültürlerin saf uygun TEC ve NEC yüksek başarı oranları ile insan dokulara gelen hastaya özgü ilaç bireyselleştirilmiş tedavi rejimlerinin geliştirilmesi sırasında test için yeni yollar açılabilir. Yalıtım yaklaşım aşağıdaki paragrafta detaylı.

Protocol

Yalıtım işlem Üniversitesi Tıp Merkezi Erlangen (#159_15 B, TuMiC-çalışma) yerel Etik Komitesi tarafından onaylandı. Hasta katılım kriterleri vardı şöyle: CRC, Bulunmuştur aşama ı-IV, iltihabi bağırsak hastalığı öyküsü ve neoadjuvan tedavi yok.

1. ameliyat ve tek hücre izolasyon için doku hazırlanması

  1. Bir CRC hastadan numune cerrahi ile elde edilir (Karsinomu doku > 0,5 g, merkezi olmayan nekrotik tümör; normal kolon doku > 10 cm uzak tümör sitesinden).
  2. Alınan doku parçaları çoğunlukla < Karsinom için 1 g ama > normal kolon için 1 g. Eğer parçaları > 1 g taze neşterden daha fazla doku işleme için kullanarak birden çok 1 g parçalara bölüp elde edilir.
    Not: tümör doku parça 0.5 g başlangıçlı dan aşağıda yalıtım genellikle başarısız olur.
  3. Sabitlenmemiş toplamak taze buz soğuk Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) penisilin/streptomisin/amphothericin ile B takıma 40 ml steril forseps kullanarak doku parçaları (%1 HBSS-kalem/strep/ampho) 50 mL santrifüj tüpler ve hızlı aktarmak Laboratuvar.
    Not: İki nokta üstüste doku sık sık yüksek bakteri/mantar başlaması ile kirlenmiş durumda. Yalıtım tüm prosedürü sırasında kalem/strep/ampho tüm çözümler için bulaşıcı organizmaların ortadan kaldırmak için eklenmiş olması gerekir.
  4. Her bir doku parçası en az 4 kez 40 mL buz ile yıkayın soğuk HBSS-kalem/strep/ampho (bkz. Adım 1.3) 50 mL santrifüj tüpler doku parçaları sırayla bir santrifüj tüpü steril forseps kullanarak sonraki tüp aktarma tarafından..
    1. Her defasında % 70 etanol ile temiz forseps.
    2. Ayrı forseps karsinom ve normal kolon doku parçaları için kullanın.
    3. Tüm doku parçaları tartın.
      Not: doğrudan bir ölçekte tartmak için doku parçaları koymak değil. Yıkandıktan sonra önce ve doku parçaları girdikten sonra doku içeren son santrifüj tüpü tartın. Bireysel doku parçaları ağırlığını çıkarma tarafından hesaplayın.

2. nesil tek hücre süspansiyon

Not: Bu her zaman nemli dokusu tutmak için tavsiye edilir.

  1. Varsa, ekli fat, diğer sigara tümör dokusu veya potansiyel olarak nekrotik doku parçaları cerrahi numune steril hücre kültür petri kabına steril forseps kullanarak doku parçaları aktararak kaldırın.
    1. Her zaman, 3-5 mL HBSS-kalem/strep/ampho ekleyerek nemli doku parçaları tutmak.
    2. Taze steril neşter (şekil 1) kullanarak doku parçalar trim. Doku kimliği belirsiz olması durumunda bir patolog başvurun.
  2. Küçük parçalar halinde kalan doku kıyma (yaklaşık olarak 2 × 2 × 2 mm3) taze bir neşter ile eğri bir bıçak kullanarak. Önceden ısıtılmış (37 ° C) hücre kültür (Dulbecco´s kartal orta [DMEM] Bazal orta değiştirilmiş) orta üretici göre önceden dolu doku parçaları doku ayrılma tüpler (örneğin, gentleMACS C tüpler) içine steril Forseps ile Aktarım talimatları.
    Not: neşter gibi sallanan bir araç kullanmayı deneyin. Hücreleri doku hasarı önlemek için sıkmak değil.
  3. Program "37C_h_TDK_1" manufacturer´s aşağıdaki yönergeleri kullanarak insan dokusu tümör ayrılma kiti ile birlikte bir doku dissociator (gibi gentleMACS sekiz Dissociator) kullanarak doku parçaları Özet/ayırmak.
  4. Ayrılma tüpler için 300 x g oda sıcaklığında (RT) de 1 dk santrifüj kapasitesi.
  5. Önceden ısıtılmış (37 ° C) % 0.5 fetal sığır serum (FBS) (DMEM-düşük) serolojik pipet kullanarak her tüp ile takıma DMEM 10 mL ekleyin ve hücre pipetting tarafından 50 mL santrifüj tüpü üstüne bir hücre süzgeç (100 µm gözenek boyutu) kullanarak hücre süspansiyon filtre süspansiyon filtre üstüne.
  6. DMEM-düşük 10 mL tekrar her MAC'ler tüp tarafından serolojik pipet ekleyin. ve kalan hücreleri hücre süzgeç 50 mL santrifüj tüpü üzerine aktarın.
  7. Hücre süzgeç ek bir 10 mL DMEM-düşük orta serolojik pipet kullanarak hemen ile yıkayın.
  8. Hücre süspansiyon RT de 300 x g, 7 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  9. Önceden ısıtılmış endotel Bazal orta (EBM) -2 5 mL hücrelerde resuspend-kalem/strep/ampho aynı 50 mL santrifüj tüp ile takıma mikrovasküler (MV) orta (Lonza).
  10. Gecede %5 CO2ile 37 ° C'de % 1.5 jelatin-fosfat tamponlu tuz (PBS) önceden kaplanmış bir T-25 hücre kültür şişesi plaka hücre süspansiyon.
  11. Hücreler 24 h 37 ° C ve % 5 CO2için kuluçkaya, hücreleri iki kez dikkatlice yaklaşık 5 mL ile de PBS yıkama ve taze orta 5 mL ekleyin.
  12. % 80-90 confluency (genellikle 5-7 gün) 48 h aralıklarla orta yenileme kadar 37 ° C ve % 5 CO2 hücre yetiştirmek.

3. FACS-sıralama endotel hücrelerinin

Not: herhangi bir noktada, kuluçka hücre bir tek reaktif tüp boyama yordamına sınırlayarak örneğin hücre kaybını önlemek deneyin.

  1. 1 mL accutase (yaklaşık 10 dakika) ile hücre bağlantısını kesin ve Önceden ısıtılmış (37 ° C) EBM-2-MV orta 4 mL ekleyin.
  2. Aygıt (aralığı 10-25 µm) sayma otomatik bir hücre kullanan hücre sayısı belirler.
  3. Hücre süspansiyon için RT de 250 x g ile 4 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  4. Önceden ısıtılmış FACS-tampon hücrelerde resuspend (1 x PBS, % 2.5 sığır serum albümin [BSA], 5 mM EDTA pH 8.0, 10 µM Y-27632) hücre sayısı (5 x 106/mL) göre.
  5. FACS boyama antikorlar hücre sayısı/FACS-tampon birim göre ekleyin: CD31-FITC (100 µL/mL = 1/10), CD144/vasküler endotel (VE) - cadherin - PE (100 µL/mL = 1/10), CD105 APC (25 µL/mL = 1/40), mix ve ışıktan; korunan RT, 7 dk için kuluçkaya Yavaşça fiske ve (bir toplam kuluçka 15 dk zaman için) başka bir 8 min için kuluçkaya.
  6. FACS-tampon 2 mL serolojik pipet kullanarak etiketli hücre süspansiyon ekleyin.
  7. RT de 250 x g ile 4 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  8. FACS-arabelleği, 2 mL ekleyerek iki kez yıkayın ve bir sonraki Santrifüjü RT de 250 x g, 4 dk için kuralları ve süpernatant atın.
  9. Önceden ısıtılmış EBM-2-MV-kalem/strep/ampho 500 µL hücrelerde ve FACS sıralama araç transferi hücrelere resuspend.
    1. FACS enstrüman soğutmalı endotel hücreleri hızlı bir şekilde sıralama işlemi sırasında ölecek. Bu nedenle, RT, endotel hücrelerinin dışarı sıralama taşımak ve hemen kendine hakim hücre 37 ° C kuluçka sonra nakletmek.
      Not: FACS enstrüman genellikle Hayır!
  10. Sıralama/toplamak üçlü-pozitif hücreleri doğrudan bir hücre kültür çanak (gecede % 1.5 jelatin-PBS ile ön kaplamalıörneğin 24-şey plaka) içine Önceden ısıtılmış taze orta (EBM-2-MV-kalem/strep/ampho) 0.5 mL ile dolu.
    Not: bir mikroskop kullanarak sıralama sonra hücre süspansiyon kontrol edin. Hücreleri birlikte kümelerseniz, onları yavaş yavaş karıştırma veya orta ekleme hücre kültür tabak içinde bile hücre dağıtım edinmeye çalışın.
  11. % 90-100 confluency 48 h aralıklarla orta yenileme kadar hücreleri yetiştirmek ve hücreleri istenilen kültür çanak boyutunu genişletin (24-şey plaka → 12 iyi-plaka → 3.5 cm çanak → T-25 → T-75).

4. hasat ve saf endotel hücreleri karakterizasyonu

  1. Hücreleri 90-%100 confluency, hasat ve onlara uygun bir yöntemle (Örneğin, FACS, cytochemistry, nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) veya endotel hücre işlevi deneyleri7,8) karakterize.
  2. Hangi karakterizasyon yöntemi seçilir izole hücreler analiz.

Representative Results

NEC ve TEC sonraki CD31/CD105/VE-cadherin-driven FACS-sıralama tarafından takip bir kombine mekanik/enzymatical doku ayrılma tarafından insan CRC üzerinden yalıtım anlatılan burada (şekil 1A). Bu iletişim kuralı bir azaltılmış zaman penceresini içeren geliştirilmiş bir protokolü kadar saf, uygun endotel hücreleri ile karşılaştırıldığında önceki Mac tabanlı bir protokol7ilk hasat temsil eder.

NEC ve TEC insan CRC izole istimal ertesi gün merdiven: EC etiketleme üçlü (2) (1) bir tek hücre süspansiyon tarafından kombine mekanik ve enzimatik doku ayrılma nesil ve büyüme % 80-90 confluency (şekil 1), bu hücrelerin CD31/CD105/VE-cadherin antikorlar fluorochrome birleştiğinde ve (3) FACS sıralayarak ilgili üç kez pozitif hücrelerinin (Şekil 2A). Not, önemli bir adım yalıtım yordamı başarısı ve hücrelerin canlılık için hızlı bir şekilde için konu cerrahi numune yalıtım yordamına (tek hücre süspansiyon nesil < rezeksiyonundan sonra 1 saat). FACS-sıralama, 12.500 TEC ortalaması kullanarak (n = 12) ve 17,800 NEC (n = 12, Şekil 2B, sol) ortalama 3,6 ve (Şekil 2B, sağ) toplam hücresini nüfusunun % 5,6 temsil eden izole olabilir. Daha sonra hücreleri (geçiş 1 olarak adlandırılan) T-75 ve hasat ya da daha fazla işlenen için analiz kadar genişletildi. Önceki Mac tabanlı iletişim kuralını kullanarak belirtmek gerekirse %49,6 ortalama yalıtım başarısı elde edildi (n = n 58 saf TECs = 117 hastalar8) saf EC ile kültürler için ortalama 6 hafta sonra ameliyat. Burada açıklanan yeni FACS tabanlı iletişim kuralını kullanarak, ilk saf EC kültürler ortalama 3 hafta sonra ameliyat %62.1 bir yalıtım başarı oranı ile elde edilmiştir (n = n elde edilen 41 saf EC kültürler = 66 tek hücreleri süspansiyonlar FACS sıralamaya tabi). Bu nedenle, yalıtım oranı % 12.5 ile artış paralelinde ekimi zaman bir azalma ile 6 3 hafta elde edildi. Bu azalma ekimi zaman gelişmiş hücre canlılık için yol ve yaşam süresi daha az maruz potansiyel kültür bağımlı eserler kurulan kültürlerin indüksiyon eşliğinde uzun.

EC saflık karakterizasyonu ilk CD31-cytochemistry (şekil 3A) tarafından yapılmıştır. Kültürler CD31 negatif hücreleri (şekil 3A, TEC ve NEC) yoksun olsaydı, onlar ters transkripsiyon nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) (şekil 3B) tarafından yazarak daha ayrıntılı bir hücreye tabi tutuldu. Hücre tipi belirli astar EC (CD31, CD105, VE-cadherin ve von Willebrand faktörü [vWF]), lökosit (CD45), epitel hücreleri (cytokeratin [CK] -20) ve düz kas hücreleri/fibroblast (desmin) için kullanılmıştır (şekil 3B). Bu qPCR tabanlı hücre, hücre türüne bağlı olarak, %2, potansiyel bir kirlenme 0.1 - aralıktaki diğer hücreler tarafından EC kültürlerin yazarak kullanarak tespit edilen8olabilir.

Özellikle, biz daha önce vWF protein ifade onların karşılık gelen NEC kültürler7' ye göre TEC kültürlerde tercihli kaybı rapor. Bu bulgular yeni kurulan yalıtım protokolü ile teyit edilmesi (şekil 3C, yani Ct kaybı NEC-TEC 0.687, p = 0,173, = eşleştirilmiş t-Testi). Bu kalite denetimleri başarıyla geçerek kültürler Mikoplazma enfeksiyonu için test ve daha sonra daha fazla deneyler için kullanılan.

Figure 1
Resim 1 : Saf endotel hücreleri insan normal kolon ve CRC FACS sıralayarak izole olabilir. EC yalıtım işleminin temel adımları(a)akış şeması. (B) yağ dokusu (sarı) diğer tümör olmayan parçalar veya potansiyel olarak nekrotik doku parçaları (kahverengi) cerrahi numune (soldaki ve ortadaki paneli) çıkarıldı ve tümör doku ayrılma (önce 2-3 mm kenar uzunluğu küpler halinde parçalandı, doğru kapı aynası). Doku ayrılma (sol panelde) 24 h hücre kültür yemekleri için inkübe sonra (C) tek hücre askıya alındı. Daha sonra yapışık olmayan hücreleri PBS (orta Masası) kullanarak nazik yıkama tarafından çıkarıldı ve hücrelerin % 80-90 confluency FACS sıralama öncesinde için yetişkin (doğru kapı aynası). Görüntüleri alt panelin (C) faz kontrast mikroskobu tarafından elde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Ortalama % 3,6-5.6 oranında tek hücre süspansiyon insan CRC hastalardan izole ve FACS tarafından sıralı üçlü-pozitif EC vardı (A)NEC ve TEC FACS sıralı-anti-CD31, - CD105 ve - VE-cadherin antikorları içeren hücrelerin bir üçlü etiketleme kullanarak. 12.500 TECs ortalaması (B) A (n = 12) ve 17,800 NECs (n = 12) insan normal kolon veya CRC FACS-ortalama 3.6 ve %5,6 toplam hücresini (doğru kapı aynası) temsil eden sıralama (paneli CD31, CD105 ve VE-cadherin pozitif hücreleri sola,), kullanarak ayrılmış olabilir nüfus istihdam. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : NEC ve TEC insan CRC üzerinden ifade tipik endotel hücre işaretleri. Normal kolon endotel hücreleri (NEC, n = 10) ve tümör endotel hücreleri (TEC, n = 10) insan CRC CD31 vardır (EC marker)-, CD105 (EC marker)-, VE-cadherin (EC marker)-, vWF (EC marker) - pozitif ve CK20 (CRC hücre işaretçisi)-, desmin (fibroblast/SMC marker)-, CD45 () lökosit marker)-(a)CD31-immunocytochemistry tarafından belirlenen negatif (pozitif hücrelerinin kırmızı =) ve (B) RT-qPCR (veri noktaları Kesikli çizgi aşağıda örnekler negatif olmak algılandı). (C) vWF ifade için karşılık gelen TEC/NEC örnekleri aynı hastaların RT-qPCR tarafından belirlendiği gibi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Esas olarak, üç farklı yöntem şimdiye kadar saf ve uygun NECs ve TECs insan solid dokulardan, yani (1) immunomagnetic zenginleştirme, (2) lazer mikrodiseksiyon ve (3) FACS-sıralama EC fraksiyonunun izole etmek için istihdam edilmiştir. Çoğu yayınlarda kullanılan11,12,13immunomagnetic zenginleştirme hücreleri tek hücre süspansiyon mekanik parçalanması tarafından nesil sonra yapıldı. Tümör nekroz faktör (TNF) sonra örneğin, arıtma, insan dermal mikrovasküler EC (HDMEC) E-selektin antikorlar tarafından immunomagnetic-α tedavi yenidoğan foreskins13 bildirilmiştir gliyom gelen insan EC yalıtım için doku tarafından sindirmek, percoll degrade ve anti-CD31/CD105 ile VE-cadherin-antikor12kullanarak seçimi veya anti-CD105 antikorlar gelen insan tarafından meme Karsinomu11. Lazer mikrodiseksiyon veya FACS sıralama istihdam protokolleri daha az sıklıkla bildirilmiştir. Örneğin, potansiyel pan-tümör tanımlamak için endotel hücre işaretleyicilerini EC (TEMs) insan kolorektal Karsinom hücre analizi ile sonra hemen9diseksiyon türetilen, lazer mikrodiseksiyon kullanılan. FACS sıralama anti-CD31-antikor kullanılarak başarıyla gösterdi EC kesir yalıtım için farklılaşmamış insan embriyonik kök hücreleri14.

Bu yaklaşımlardan farklı avantajları ve dezavantajları dikkate alınması gereken vardır. İmmunomagnetic dayalı yaklaşım için ayrıntılı hiçbir ekipman gereklidir, seçimi her zaman yapılabilir ve hücre zenginleştirme olduğu avantajları hızlı (yaklaşık 15 dk) ile karşılaştırıldığında FACS sıralama (yaklaşık 1 saat). Uzun bir zaman aralığı için matris eksikliği EC hücre ölümü ile anoikis neden olabilir. Bu nedenle, FACS arabelleğine rho kinaz inhibitörü Y-27632 ilavesi hücre anoikis15önlemek için istihdam edildi.

Seçimin birden fazla mermi saflık % 99 yukarıda ulaşmak için gerekli olan immunomagnetic zenginleştirme dezavantajları vardır. Ayrıca, hücre ekimi enrichments arasında kültür kaynaklı eserlerin destekleyen Kültür Yaş artar hücre kurtarma için gereklidir. Mikrodiseksiyon lazer hücreler olabilir avantajı hemen hangi kültür kaynaklı eserlerin azaltır ama hücreler bitişik doku alanları10tarafından bulaşma riskini içerir kullandı. Ayrıca, mikrodiseksiyon her laboratuarda kurulmuş değil. FACS sıralama-tabanlı yaklaşımın zararlarından biri, benzer mikrodiseksiyon donatımı özenle hazırlanmış ve maliyet-yoğun, lazer içerir. Buna göre bu cihaz herhangi bir zamanda erişilebilir olmayabilir. Bir klinik ortamda nerede faiz dokusunun durumu tam olarak planı yapılamıyor, bu başka bir dezavantaj ekleyebilirsiniz.

Ancak, paralel olarak birden çok antikorlar tarafından EC kesir olarak etiketlenmiş FACS sıralama büyük avantajları vardır. Bu nedenle, sıkı bir perdeleme strateji yüksek saflıkta sağlayacak istihdam edilebilir. Deneyime dayalı, AK kısmını yeniden sıralama nerede istihdam edilecek seçimin birden fazla mermi vardı önceki Mac tabanlı bir protokol aksine gerekli oldu. Bu bir önemli ölçüde azaltılmış ekimi zamana kadar saflık analizi uzun zaman penceresini etkinleştirme bir gelişmiş hücre canlılığı kaynaklanan FACS yaklaşımda üç hafta için altı hafta (MAC'ler yaklaşım) yol açtı. Son olarak, FACS-sıralama-based strateji kullanarak, genel izolasyon başarı oranı bir iyileşme olabilir (% 12.5 artış) elde. Sonra doku Özeti tarafından kombine mekanik ve enzimatik doku sindirim TECs yalıtım için seçim yöntemi olarak bu protokolü kurulmuş sayısız avantajı vardı sonuç olarak, FACS sıralama stratejisi istihdam 3 antikorlar paralel bağlı ve NECs insan kolorektal karsinom ve iki nokta üst üste.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

Acknowledgments

Biz teşekkür ederiz Christian Flierl, Katja Petter, Christina Schnürer (tüm bölümü moleküler ve deneysel cerrahi), Uwe Appelt, Michael Mroz (çekirdek birim FACS-ayırma) ve Simon Völkl (çekirdek birim FACS-Immunomonitoring) mükemmel teknik destek için. Bu eser klinik araştırma (IZKF için) Üniversitesi Tıp Merkezi Erlangen, Alman Araştırma Vakfı Hibe tr/MS disiplinlerarası Center tarafından desteklenmiştir (DFG: 2438, SP2 için) ve Lutz-Stiftung, Robert-Pfleger-Stiftung bir hibe VSS yanı sıra Alman Araştırma Vakfı MS için verilen hibeler tarafından [DFG: KFO257 (alt projenin 4), SFB 796 (alt projenin B9)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS 1x Gibco by Life Technologies 14175-053
Penicillin-streptomycin Gibco by Life Technologies 15140-122
amphotericin B Gibco by Life Technologies 15290-026
Scalpels, disposable Feather No. 23
gentleMACS octo dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
gentleMACS C-tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
human tumor dissociation kit Miltenyi Biotec 130-095-929
DMEM Gibco by Life Technologies 21969-035
EGM-2-MV BulletKit Lonza CC-3202
Cell strainer, 100 µm Falcon 352360
StemPro Accutase  Gibco by Life Technologies A11105-01
Cell counter, automated Coulter Counter Z1
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503
CD31-FITC BD Pharmingen 555445
CD144/VE-cadherin-PE BD Pharmingen 560410
CD105-APC BD Pharmingen 562408
gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich G9391
FACS-Sorting device Beckman Coulter MoFlo XDP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  3. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
  4. McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat Med. 9 (6), 713-725 (2003).
  5. Hurwitz, H., et al. Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med. 350 (23), 2335-2342 (2004).
  6. Naschberger, E., Schellerer, V. S., Rau, T. T., Croner, R. S., Stürzl, M. Isolation of endothelial cells from human tumors. Methods Mol Biol. 731, 209-218 (2011).
  7. Schellerer, V. S., et al. Endothelial cells of human colorectal cancer and healthy colon reveal phenotypic differences in culture. Lab Invest. 87 (11), 1159-1170 (2007).
  8. Naschberger, E., et al. Matricellular protein SPARCL1 regulates tumor microenvironment-dependent endothelial cell heterogeneity in colorectal carcinoma. J Clin Invest. 126 (11), 4187-4204 (2016).
  9. St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
  10. Christian, S., et al. Endosialin (Tem1) is a marker of tumor-associated myofibroblasts and tumor vessel-associated mural cells. Am J Pathol. 172 (2), 486-494 (2008).
  11. Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncol Rep. 15 (2), 381-386 (2006).
  12. Miebach, S., et al. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J Neurooncol. 76 (1), 39-48 (2006).
  13. Richard, L., Velasco, P., Detmar, M. A simple immunomagnetic protocol for the selective isolation and long-term culture of human dermal microvascular endothelial cells. Exp Cell Res. 240 (1), 1-6 (1998).
  14. Nourse, M. B., et al. VEGF induces differentiation of functional endothelium from human embryonic stem cells: implications for tissue engineering. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (1), 80-89 (2010).
  15. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).

Tags

Kanser araştırmaları sayı: 134 endotel hücreleri gemi kolorektal Karsinom tümör Normal kolon CD31 VE-cadherin CD105 FACS sıralama doku ayrılma tümör Microenvironment fibroblastlar
Yalıtım Normal kolon ve kolorektal Karsinom - gelişmiş bir iletişim kuralı üzerinden insan endotel hücrelerinin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Naschberger, E., Regensburger, D.,… More

Naschberger, E., Regensburger, D., Tenkerian, C., Langheinrich, M., Engel, F. B., Geppert, C., Hartmann, A., Grützmann, R., Schellerer, V. S., Stürzl, M. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. J. Vis. Exp. (134), e57400, doi:10.3791/57400 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter