Summary
我们在这里提出一个标准免疫技术 (CFSE 染色的应用), 旨在快速监测佐剂介导的细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 生成在体内.这种对 CTL 容量的快速估计有助于开发预防性疫苗, 防止细胞内病原体和治疗性癌症疫苗的发展。
Abstract
对现代分单元疫苗的评估表明, 中中和抗体的产生是重要的, 但不足以辅助选择。因此, 迫切需要具有体液和细胞免疫刺激能力的佐剂, 能够促进细胞毒 T 淋巴细胞 (CTL) 反应。因此, 对诱导交叉启动并随后增强 CTL 生成的佐剂候选者的忠实监测是疫苗开发的关键步骤。在这里, 我们提出一个方法的应用, 使用 SIINFEKL 特定 (OT) T 细胞监测模型抗原卵清蛋白 (卵)在体内的交叉呈现, 在不同的佐剂候选者在场。该方法是一种快速试验, 用于选择具有最佳交叉启动能力的佐剂。CD8+ T 细胞的增殖是交叉引发的最有价值的标志, 同时也被认为是佐剂诱导的交叉表达的相关性。这一特点可以评估在不同的免疫器官, 如淋巴结和脾脏。CTL 生成的程度也可以监测, 从而对局部 (引流淋巴结主要) 的性质或系统性反应 (远端淋巴结和/或脾脏) 有深入的了解。这项技术进一步允许对检测药物进行多次修改, 以抑制特定的交叉表达通路, 并提供了可能用于不同品系的常规和转基因小鼠。总之, 我们在这里提出的应用将是有用的在工业或学术界的疫苗实验室开发或修改疫苗研究和发展的化学佐剂。
Introduction
细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 诱导疫苗是为抗击某些类型的癌症而开发的关键治疗措施1。CTL 对预防性疫苗对细胞内病原体2也很重要。此外, ctl 是少数的免疫防御机制之一的功能活跃的风险人群, 如新生儿3,4谁也依赖 CTL, 以抗击早期生命感染5。在这方面, 与不引起 CTL 反应的佐剂一起研制的呼吸道合胞病毒疫苗 (明矾) 导致6婴儿感染严重并发症导致的疫苗完全失败。免疫接种的这些负面影响可以通过 CD8 细胞反应 7逆转。我们以前已经证明, 一些干扰素基因 (蜇) 激动剂诱发的主要细胞因子 (I. 干扰素) 对这些佐剂8产生的 CTL 反应至关重要, 部分是通过测量在疫苗接种后的 T 细胞, 并将这些结果作为在延长接种计划9中观察到的 CTL 诱导能力的量度。用羧基琥珀酰亚胺酯 (CFSE)染料稀释法测定野生型 (CD8) C57BL/6 受体小鼠中的 OT I. T 细胞的增殖是一种对疫苗佐剂能力的稳健估计, 可产生SIINFEKL 的交叉启动 (卵清蛋白的免疫主导肽, 卵)。这种技术的变异被广泛用于评估 CD8 和 CD4 T 细胞的增殖. 例如, 它已被用于没有选定的细胞因子 (高鼠) 或测量疫苗的功效后, 抗原召回的动物。我们设计了一个简短的协议 (4 天的实验), 在 CFSE 染色的 CD8+ T 细胞被动转移后, 皮下 (南卡罗来纳州) 免疫由一剂量50µg 的无内毒素卵子辅以测试佐剂被管理(图 1)。疫苗接种后48小时随访结果提供了可靠的证据证明佐剂产生 CTL 反应的能力。通过这一策略, 可以评估免疫后引流淋巴结局部免疫反应的效力, 以及测量脾脏 (或远端淋巴结) CTL 活动的反应程度。
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Protocol
所有在这项研究中使用的老鼠都是从 C57BL/6 的背景。所有的动物都被保存在无病原体条件下。所有实验都是根据德国动物保护法 (TierSchG BGBl) 的规范进行的。我是 1105;25.05.1998), 并获下萨克森动物实验伦理学委员会和国家办事处 (下萨克森国家消费者保护和食品安全办公室) 批准, 许可证号为 33.4-42502-04-13/1281 和162280。
1. CFSE 细胞染色及移植
注意: OT I 小鼠是 transgenically 生成的动物, 表达 T 细胞受体 (TCR) 与固定α和β链, 共同承认的免疫优势肽的卵子, SIINFEKL10,11。结果, 这些小鼠有相当大数量的 SIINFEKL 特异性 CD8+ T 细胞 (97%)12 , 当比较正常或卵免疫小鼠 (≤ 1%)13。
- Thy1a (Thy1.1 ) 等位基因表达 T 淋巴细胞特异性的 CD8 t 细胞的分离
- 弄死6-9 周大鼠, 由 CO2吸入, 其次为颈椎脱位14。解剖脾脏和主要淋巴结 (腹股沟, 腋窝和颈部对只) 通过切割皮肤与外科剪刀, 从身体分离的皮肤与外科钳和镊子的帮助下, 并将其放置在培养皿 (60 x 15 毫米) 每个包含一个100µm 孔网杯, 用于组织研磨和细胞释放。
- 在3-5 毫升完整的 RPMI 培养基 (RPMI 1640, 10% 伏/v FCS, 100 U/毫升青霉素, 50 µg/毫升链霉素) 保持在冰上的培养皿 (每一个网杯)。
- 在注射器柱塞或相似的不育仪器的帮助下捣碎器官 (不需要事先切开) 并且收集导致的单细胞悬浮在15毫升离心机管子。
- 离心机细胞悬浮在 300 x g 10 分钟在4°c。放弃上清。将10毫升的冷 PBS 中的细胞通过离心和溶解, 在氯化铵缓冲液1毫升/脾中重新悬浮颗粒 (ACK 缓冲器, 商用), 将红细胞从脾脏中冲洗出来。在冰上孵化细胞1.5 分钟, 然后用离心法 (如前所做) 用10毫升的冷 PBS 冲洗细胞。
- 在1毫升的 PBS (pH 7.2) 中, 用5% 胎牛血清进行磁隔离, 将颗粒重新悬浮在同一管中。
- 要进行磁隔离, 请根据制造商指令或已发布的协议15, 使用磁性隔离套件进行 CD8+ T 细胞的阴性选择。
- 要执行 CFSE 染色, 首先计算使用自动单元计数器 (粒子计数器) 从 OT I 小鼠获得的 CD8+ T 细胞数。着色 1-5 x 107细胞/毫升在1-5 毫升的容量与5µM CFSE 在 PBS 为7分钟在37°c, 保护免受光在15毫升猎鹰管。
- 将相同体积 (1:1) 的胎牛血清添加到细胞中, CFSE 染色, 并在37摄氏度的保护下, 将其孵化7分钟。用10毫升 PBS 清洗细胞两次。
- 使用自动单元格计数器计数单元格。将细胞数设置为 3-5 x 107细胞/毫升的 PBS, 以注射 3-5 x 106细胞/小鼠在100µL 静脉 (静脉注射) 通过尾静脉。
- 进行尾静脉注射, 将小鼠固定在适当的抑制剂。加热后区和尾部的小鼠被注射使用红光灯, 放置在20至25厘米以外的小鼠1-3 分钟, 以允许尾部静脉舒张。
注意: 这有助于缓解静脉检测和细胞悬浮的管理。 - 确保 (与鼠标和灯之间的手), 它是不太热的老鼠, 当尾巴静脉清楚可见, 进行注射。用25口径针16的1mL 注射器将细胞注入侧或背尾静脉。
2. 免疫接种 (游离卵子 +/-佐剂)
- 将小鼠与 OT I 细胞 (步骤 1.7,图 1) 移植到麻醉室中, 用麻醉机14在氧气中管理异氟醚。
- 当老鼠在麻醉下完全睡着的时候, 把它从房间里拿出来, 在臀部 superficialis (侧下背部) 的地方剃掉小鼠的皮毛, 用电动理发机, 以执行干净的注射。对应用领域有很好的看法。
- 注射50µL 的疫苗, 在被剃光区域使用25口径针。
3. 流式细胞术分析中淋巴细胞和染色的分离
- 淋巴细胞与脾的分离
- 弄死联合2吸入免疫接种小鼠, 其次为颈椎脱位。
- 提取引流和远端淋巴结和脾脏, 并将其放置在单独的培养皿中, 含有100µm 孔网杯用于组织研磨和细胞释放。按照步骤1.1.2 通过1.1.3。
- 离心后醒酒上清液, 并在相同体积的残余 PBS 中重新悬浮细胞颗粒 (约100µL)。
- 流式细胞术分析染色
- 在一个15毫升离心管准备一个主混合含有染色抗体的浓度在表 1中, 从而产生2x 浓缩染色混合。准备足够数量的主混合, 每样有100µL。混合细胞和主混合1:1 和孵化它在 4°c 30 分钟。
注: 每个样品的最终染色量应为200µL (100 µL 细胞颗粒 +100 µL 抗体主混合)。 - 1.1.3 中描述的离心两次清洗细胞, 增加10毫升的 PBS, 两次。
- 在 0.5-1 毫升的 PBS 中重新悬浮染色细胞, 用于采集和转移悬浮液, 用于流式细胞仪管。总是把样品放在冰上, 以免被光线所保护。
- 在一个15毫升离心管准备一个主混合含有染色抗体的浓度在表 1中, 从而产生2x 浓缩染色混合。准备足够数量的主混合, 每样有100µL。混合细胞和主混合1:1 和孵化它在 4°c 30 分钟。
4. 流式细胞仪
- 始终使用70-100 µm 过滤器预先筛选单元格样本。
- 为表 1 (珠子或细胞) 中详细的显影准备单一染色补偿控制。
注: 应在细胞仪或分析软件17、18、19中进行补偿, 并应用于所有样品。 - 按照图 2中描述的浇口策略进行。简要地, 门人口在正向散射高度与正向散射区域 (图 2A), 并且再侧散布宽对侧散布区域 (SSA,图 2B) 为了排除双峰。
- 通过绘制 BV 650 (自动荧光) 与 FITC (CFSE) 来区分来自高自动荧光细胞的真实 CFSE 染色细胞, 从图 2B中进行填充。包括用与 BV 650 共轭的抗体染色的珠子或细胞纳入补偿控制。这一剧情 (图 2C) 的 BV 650 vs FITC 是用来门 CFSE 染色细胞。
- 从图 2C中的 Pe-Cy7 (Thy1.1-CD90.1) 与 APC (CD8) 进行比较, 以区分来自捐赠者和受体小鼠的细胞。
注: 从 OT I. 捐献小鼠获得的细胞为 Thy1.1+ (CD90.1), 而 C57BL/6、受体) 小鼠派生细胞为 Thy1.2+ (CD90.2) (图 2D)。一些实验室有 Thy1.2 背景下的小鼠和 C57BL/6 (Thy1.1)。在这种情况下, 你必须使用抗体对抗 Thy1.2 细胞门。 - 通过在 450 (CD4) vs APC (CD8) (图 2E) 的栅极上绘制 Thy1.1+填充的 CD8+细胞。
- 通过使用显示 CFSE (FITC, 530/15 通道-蓝色激光) 的 CD8+单元格的直方图显示, 在图 2E中显示填充门, 通过将强度从 102增至水平处, 将激增的人口包括在内不分割控制人口是 (强度 ~ 105, 取决于 CFSE 染色的功效和流量式细胞仪的电压设置) (图 2F)。
- 制作一个额外的门 (不显示在图2中) 绘制 FITC 与 L/D 标记 (450/20 通道, 紫外线激光), 以评估死细胞平行的扩散评估。
- 从流式细胞仪的样本中获取至少5000项补偿控制和10.000 事件 (门 E,图 2) 的事件。在低或中流运行细胞仪 (不超过20.000 事件/秒的流速)。
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Representative Results
为了测试使用不同佐剂 (ADJ1 和 ADJ2) 的治疗方法, 我们通过流式细胞仪测量过继转输转移的 CD8+ T 细胞的增殖来评估 CTL 的生成能力 (图 2)。为此, 我们以前从引流淋巴结和脾脏中分离出细胞 (表 1)。通过测量淋巴结和脾脏中 CD8+ T 细胞的增殖, 我们能够证实在引流淋巴结中 ADJ2 的 CTL 生成能力 (图 3) 与 ADJ1、单卵或 PBS 控制相比更高。与此相反, 我们观察到, ADJ2 无法在系统隔间 (脾脏) 中产生 CTL 反应, 而 ADJ1 的脾脏 CD8+ T 细胞的增殖水平很高, 不仅与对照 (PBS 和卵) 相比, 而且还优于ADJ1。通过对 ADJ2在体内增殖实验中的作用进行解剖, 我们可以确认其作为局部而非系统性 CTL 发生器的强大作用。此外, ADJ1 在局部注射 (引流淋巴结) 以及系统地增加了脾脏的 I. 型增生。结果表明, ADJ2 (局部) 和 ADJ1 (系统性) 的观察效果可以证明佐剂的活性及其程度。
图 1: 检测时间线.检测时间线代表了0天第一次 T 细胞转移, 1 天的南卡罗来纳州疫苗接种, 以及2天后的取样脾脏和引流淋巴结。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 采用流式细胞仪测量 CD8+ T 细胞 (OT I、Thy1.1+) 增殖的浇口策略流程图.两个样本以不同的颜色 (红色和浅蓝色) 表示, 以便更好地进行可视化。A B.在前两个门中, 通过绘制正散射高度与正散射面积和侧散射宽度和侧向散射面积, 双峰对单个细胞进行区分。C.在B中封闭的细胞, 其荧光强度的 BV 650 通道 (自动荧光) 绘制的 CFSE 强度 (其中 diming 表明细胞分裂/增殖) 在530/30 的光路。这个门允许选择真正的 CFSE 阳性细胞通过辨别那些有高的自动荧光。 CFSE 阳性细胞被封闭, 其高荧光强度的 Pe-Cy7 (Thy1.1, 标记为 OT I 细胞) 与他们的 APC 强度 (CD8)。E. BV 450 (CD4) 针对 APC (CD8) 对先前门控 Thy1.1 阳性细胞进行了绘制, 以准确地选择 CD8+ T 细胞。F.以前门控 CD8+细胞绘制在一个直方图反对 CFSE 强度最终门的激增人口。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 辅助驱动的 CTL 生成.在抗原和 PBS 控制下, 为2种不同的辅助治疗 (ADJ1 和 ADJ2) 描绘出局部或系统性 CTL 反应的能力。如图行所示, 在引流淋巴结 (腹股沟、例皮下 (南卡罗来纳州) 管理) 和脾脏中, 过继转输转移的非 I T 细胞的增殖被检查。细胞增殖在所有相关的治疗 (专栏) 被测量为了准确地比较免疫反应的程度在它的地方 (排泄的淋巴结) 或全身 (脾脏) 行动范围。请单击此处查看此图的较大版本.
| 染料抗体 | 克隆 | 荧光/通道过滤器 | 浓度2X |
| Thy1.1 (CD90.1) | HIS51 | PE-Cy7-780/60 | 1:750 |
| CD8 | 53-6. 7 | APC-670/14 R | 1:280 |
| CD4 | RM4-5 | BV 421-450/50 V | 1:100 |
| CFSE | - | FITC-530/30 | (根据 CFSE 染色协议) |
| DCM (死细胞标记) | - | -/紫外线-450/50 UV | 1:500 |
表 1: 流式细胞仪的抗体染色.荧光-共轭抗体克隆使用和推荐的染色浓度 (2x)。
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Discussion
现代疫苗是理想的 composedof 纯化抗原和佐剂, 有可能添加一个交付系统, 如脂质体, 病毒样粒子, 纳米粒子或活载体。设计疫苗的一个关键方面是根据临床需要选择合适的佐剂。部分的范围可能涉及倾向于体液与细胞免疫应答 (或两者), 选举局部与系统性免疫应答 (或两者), 以及这种疫苗必须在目标人群中产生的记忆。辅助评价的一个关键方面是迅速确定其产生 CTL 的能力。本文提出了一种基于已知技术的方法, 通过测量 CD8 T 细胞增殖, 快速确定小鼠体内CTL 反应的特征。这种方法可以预测在4个工作日内佐剂 (OT I T 细胞增殖) 引起的免疫应答的效力。该方法进一步促进了佐剂在免疫应答 (局部与系统性) 方面的作用的比较及其有效作用。在这里, 我们已经显示了一个例子, 如何免疫接种不同的辅助治疗 (ADJ1 与 ADJ2) 将影响免疫应答。ADJ2 的作用局限于局部的管理领域, 在那里它激活了排泄淋巴结的免疫应答, 而 ADJ1 的作用也更广泛, 在地方和系统层面产生了 CTL 反应, 但在引流淋巴结中的 ADJ2
成功评估佐剂的 CTL 能力的关键步骤是选择年轻的非 I 型动物 (作为 CD8 T 细胞的来源) 和使用无内毒素的卵子进行免疫。由于 OT i 鼠是转基因动物产生的 CD8 T 细胞, 识别卵肽 SIINFEKL 在 MHC I 的上下文, 其人工选择的小鼠 TCR 增加超增生 CD8+ T 细胞20岁的出现。因此, 腋淋巴结的炎症是老年非 I 型小鼠的一个更常见的特征。考虑到这一点, 建议在可能的情况下使用年轻的非 I 型动物 (6-9 周大的动物), 避免将细胞从任何扩大的器官 (即淋巴结脾) 中分离出来。扩大的器官与增殖 CD8 T 细胞的使用将影响整个检测, 因为最可能的差异, 控制和治疗之间的扩散将不会得到。通过使用含有微量内毒素的卵蛋白, 可以产生对佐剂 CTL 产生能力的歧视的类似陷阱, 这能引起比无内毒素的卵21,22更有力的免疫应答 (见材料和试剂), 因为内毒素是强的免疫调节剂本身 23。因此, 用于免疫的卵蛋白必须是无内毒素的。使用20或50µg 无内毒素卵子取决于免疫途径是50µg 适当剂量的皮下试验佐剂。此外, 在文献中报道了高浓度 CFSE 的使用, 以杀死染色细胞24 , 也可能导致化验失败。
为了减少动物的压力, 为了增加实验的重现性, 对该协议中使用的不同技术进行了一些修改或改进。例如, 通过加热小鼠的背部和尾部而不是整个动物来最小化动物的加热, 或者通过在接种前麻醉动物来避免皮下注射相关的压力。麻醉是不需要的动物福利条例的皮下注射, 但在我们的经验, 它提高重现性通过减少变化引入的压力反应。
这种方法的一个很大的局限性是, 由于 CFSE 染色细胞膜的细胞, 其高亮度通常会损害检测信号从细胞质。因此, 如果需要对 CTL 容量的确认, 应通过特定的分泌物测定25, 而不是细胞内细胞因子染色来评价干扰素的分泌。
在短短的4天内, 利用增殖量测量佐剂对 ctl 产生能力的估计比传统的 ctl 测定26的时间更短, 这是一个很好的前瞻性实验, 在这种情况下, 进一步需要其他方法的确认。
虽然仅限于卵子作为抗原, 因此对 OT t 细胞的使用, 这里提出的方法允许研究不同佐剂诱导后增殖细胞的活化特性。其中一个可能的应用是研究不同佐剂诱导的增殖性 I T 细胞的代谢特征及其与记忆27的发展的关系。额外的二次筛查可以评估受刺激细胞的生物学特性, 如细胞因子或脱粒标记的表达, 流式细胞术或其细胞毒性能力通过执行体内 CTL 试验8,26,28。由于该应用限制了其在小鼠中的使用, 对人类的推断可以通过基于人性化的小鼠29、30、31的筛查来进行。
我们在这里提出的这种方法是足够健壮的, 可以作为筛选细胞反应激活剂的第一次筛查, 而且还有足够的灵活性, 可以进行修改或耦合, 进一步分析增殖 T 细胞。总之, 这种对佐剂 CTL 生成能力的快速活体评估是学术界和工业界的疫苗实验室的理想工具, 它们对其佐剂候选分子的作用方式进行快速表征。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢我们的技术助理: U. Bröder 和 h. Shkarlet, 他在实验过程中帮助我们。这项工作部分是由欧盟赠款 (UniVax, 601738 号合同和 TRANSVAC2, 730964号合同) 和亥姆霍兹协会赠款 (海-IDR) 资助的。资金来源不影响研究设计, 生成手稿或决定提交出版。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
| CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
| APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
| BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
| Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
| EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
| Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
| Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
| C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
| OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
| FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
| Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
| PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
| Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
| Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
| RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
| Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
| Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
| Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |
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