Summary
אנו מציגים כאן יישום טכניקה סטנדרטית אימונולוגי (CFSE צבעונית OT-אני התפשטות) נועד לפקח במהירות בתיווך אדג'וונט ציטוטוקסיות לימפוציטים-T (CTL) דור ויוו. זו הערכה מהירה של CTL קיבולות שימושית עבור פיתוח חיסונים מניעתי נגד פתוגנים תאיים, כמו גם חיסונים נוגדי סרטן טיפולית.
Abstract
ההערכה של יחידת המשנה מודרני חיסונים מגלה כי הדור של נטרול נוגדנים היא חשובה אך אינה מספקת עבור אדג'וונט הבחירה. לכן, adjuvants עם יכולות חיסונית-מופחתים ההורמונאלית והן הסלולר מסוגלים לקדם ציטוטוקסיים התגובות לימפוציטים (CTL) T נחוצים בדחיפות. לפיכך, ניטור נאמן של מועמדים אדג'וונט זירוז קרוס-לקרקע ולשפר לאחר מכן CTL דור מייצג שלב חיוני בפיתוח החיסון. כאן אנו מציגים יישום שיטה המשתמשת SIINFEKL ספציפיים (OT-אני) ותאי T כדי לפקח על הצלב-המצגת של ה הדגם אנטיגן אובלבומין (פשוט) ויוו בנוכחות המועמדים אדג'וונט שונים. שיטה זו מייצגת בדיקה מהירה כדי לבחור adjuvants עם היכולות קרוס-לקרקע הטוב ביותר. ההתפשטות של CD8+ T תאים הסימן החשוב ביותר של צלב-לקרקע, זה גם נחשב לתאם אדג'וונט-induced קרוס-מצגת. תכונה זו ניתן להעריך באיברים חיסוניים שונים כמו הלימפה והטחול. היקף הדור CTL יכול גם להיות במעקב, ובכך לתת תובנות על טבע מקומי (ניקוז הלימפה בעיקר) או תגובה מערכתית (בלוטות הלימפה רחוק ו/או הטחול). טכניקה זו נוסף מאפשר שינויים מרובים עבור בדיקות סמים יכול לעכב מסלולים קרוס-מצגת מסוימת, מציעה גם את האפשרות שישמש זנים שונים של עכברים מהונדסים קונבנציונאלי. לסיכום, היישום אנחנו מציגים כאן יהיה שימושי עבור מעבדות חיסון תעשייה או אקדמיה לפתח או שינוי כימי adjuvants חיסון למחקר ופיתוח.
Introduction
לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות (CTL) גרימת חיסונים הם המפתח התערבויות טיפוליות אשר פותחו כדי להילחם סוגים מסוימים של סרטן1. CTL חשובים גם עבור חיסונים מניעתי נגד פתוגנים תאיים2. יתר על כן, CTL הם אחד כמה המערכת החיסונית מנגנוני ההגנה באופן פונקציונלי פעיל בקרב אוכלוסיות סיכון כגון neonates3,4 למי גם תלוי CTL להילחם זיהומים בתחילת החיים5. בהקשר זה, חיסונים נגד הנשימה Syncytial וירוס (RSV) שפותחו עם אדג'וונט זה לא זכה CTL תגובות (אלום) הביא כישלון מוחלט של החיסון המוביל לסיבוכים רציניים על זיהומים אצל תינוקות6. אלה תופעות שליליות של החיסון יכול להיות הפוך על ידי CD8+ תא T בתגובה7. בעבר הראו כי ציטוקינים הראשי (מסוג האינטרפרונים) שהפיק קצת ממריץ של אינטרפרון גנים (סטינג) אגוניסטים חיוניים התגובות CTL שנוצרו על-ידי אלה adjuvants8, בין השאר על ידי מדידת התפשטות OT-אני T תאים לאחר חיסון ושימוש תוצאות אלו כפי מידת CTL גרימת יכולות שנצפתה מורחב לוחות זמנים חיסון9. מידת ההתפשטות של OT-אני CD8+ T תאי עכבר הנמען של C57BL/6 פראי סוג (WT) על ידי carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) לצבוע הדילול הוא שערוך חזקים של יכולות אדג'וונט של חיסון כדי ליצור קרוס-לקרקע של SIINFEKL, (פפטיד חיסונית-הדומיננטי של אובלבומין, ביצית). וריאציות של טכניקה זו נמצאים בשימוש נרחב עבור ההערכה של התפשטות OT-אני CD8+ ו CD4 OT-II+ T תאים. לדוגמה, שהשתמשו בה בהיעדרו של ציטוקינים שנבחר (KO עכברים) או כדי למדוד את יעילות החיסון לאחר אנטיגן האחזור ב WT בעלי חיים. אנחנו בדימיון פרוטוקול קצר (4 ימים הניסוי) שבו לאחר העברה פסיבית של שהוכתמו CFSE OT-אני CD8+ T תאים, של חיסונים (ש) תת עורית בהיקף של מנה אחת של 50 µg של ביצית ללא אנדוטוקסין בתוספת מבחן adjuvants מנוהל (איור 1). בצע את התוצאות 48 שעות לאחר החיסון מספק הוכחה אמינה של הקיבולת של אדג'וונט ליצירת רשימת אישורים אמינים תגובות. על ידי אסטרטגיה זו, זה אפשרי להעריך את עוצמת התגובה החיסונית המקומית הצומת לימפה המנקזים לאחר חיסון, כמו גם היקף התגובה על ידי מדידת הפעילות CTL הטחול (או מרוחק בלוטות הלימפה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העכברים השתמשו במחקר זה היו רקע C57BL/6. כל החיות הוחזקו בתנאים ללא הפתוגן. כל הניסויים בוצעו על פי נורמטיבית של החוק הגרמני להגנת בעלי חיים (TierSchG BGBl. אני S 1105; 25.05.1998), אושרו על ידי ועדת סקסוניה התחתונה על אתיקה לניסויים בבעלי חיים, משרדי המדינה (התחתון סקסוניה המדינה במשרד של הגנת הצרכן ובטיחות מזון), תחת מספר היתר 33.4-42502-04-13/1281 ו- 162280.
1. CFSE מכתים של OT-אני T תאים והעברת המאמצת
הערה: OT-אני עכברים הם חיות transgenically שנוצר המבטאים קולטן תא T (TCR) α קבוע, שרשראות β יחד לזהות את פפטיד חיסונית-הדומיננטי של ביצית, SIINFEKL10,11. כתוצאה מכך, עכברים אלה יש מספר גבוה במידה ניכרת של CD8 ספציפי SIINFEKL+ T תאים (97%)12 בהשוואה עכברים רגילים או חוסנו ביצית (≤ 1%)13.
- בידוד של CD8 למעקב+ T תאים מחלון OT-אני עכברים מביע אלל לימפוציטים-T ספציפי Thy1 (Thy1.1):
- המתת חסד בת 6-9 שבועות OT-אני עכברים באמצעות אינהלציה2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם14. לנתח את הטחול ובלוטות הלימפה העיקרי (המפשעתית, בבית השחי, צוואר הרחם זוגות בלבד) על ידי חיתוך העור עם מספריים כירורגיים, ניתוק את העור מהגוף בעזרת צבת כירורגי, מלקחיים ומניחים פטרי (60 x 15 מ מ) המכילים כל אחד 100 מיקרומטר נקבובית גביע רשת לשחרור תא וליטוש רקמות.
- לשמור על צלחות פטרי (כל אחד עם רשת שינוי אחת גביע) ב- 3-5 מ ל בינונית RPMI מלאה (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין µg 50/mL) שמרה על קרח.
- מועכים את האיברים בעזרת פומפה מזרק או מכשיר דומה סטרילי (חיתוך מוקדמת לא נדרש) לאסוף את התליה תא בודד שנוצר צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל.
- Centrifuge התליה תא ב 300 גרם x 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע. לשטוף את התאים ב- 10 מ"ל של PBS קר על ידי צנטריפוגה ואת lyse של אריתרוציטים מן הטחול על ידי השעיית מחדש בגדר ב 1 mL/טחול מאגר אמוניום כלוריד (מאגר ACK, זמינים מסחרית). דגירה התאים 1.5 דקות בקרח, לאחר מכן לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS קר על ידי צנטריפוגה (כפי).
- מחדש להשעות את צניפה בצינור אותו ב 1 מ"ל של PBS (pH 7.2) המכילה 5% עוברית שור נסיוב לבידוד מגנטי.
- כדי לבצע בידוד מגנטי, להמשיך הבחירה שלילי של CD8+ T תאים באמצעות ערכת בידוד מגנטי בהתאם להוראות היצרן או לפרסם פרוטוקולים15.
- כדי לבצע CFSE מכתים, קודם לספור את מספר CD8+ T תאים המתקבל OT-אני עכברים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטיות (מונה חלקיקים). כתם 1-5 x 107 תאים/מ ל נפח של 1-5 מ עם 5 מיקרומטר CFSE ב- PBS במשך 7 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור בצינור 15-ml בז.
- להרוות את ההכתמה CFSE על-ידי הוספת נפח זהה (1:1) סרום שור עוברית לתאי ולאחר תקופת דגירה אותם של נוספים 7 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS פעמיים.
- לספור את התאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית. להגדיר את מספר תא ל 3-5 x 107 תאים למ"ל של PBS כדי להזריק 3-5 x 106 תאים/עכבר ב 100 µL דרך הווריד (עירוי) דרך הווריד של הזנב.
- כדי לבצע זריקות וריד הזנב, לשתק העכברים ב restrainers המתאים. לחמם את אזור הגב ואת הזנב של עכברים להיות מוזרק באמצעות מנורת אור אדום, בין 20-25 ס"מ מן העכברים למשך 1-3 דקות לאפשר התרחבות וריד הזנב.
הערה: פעולה זו מסייעת להקל על הווריד זיהוי וניהול של התליה תא. - להבטיח (עם היד ממוקם בין העכברים. ואת המנורה) שזה לא יותר מדי חם עבור העכברים והמשך כאשר העורקים הזנב נראה בבירור, הזרקת. להזריק את התאים לתוך הווריד של הזנב לרוחב או הגבי באמצעות על מזרק 1 מ"ל עם מחט בקוטר 2516.
2. חיסונים (ללא אנדו פשוט + /-אדג'וונט)
- הצב והעכברים מושתלים עם OT-תאי (שלב 1.7, איור 1) תא הרדמה ולפקח איזופלוריין חמצן על ידי מכונת הרדמה14.
- כאשר העכבר ישן לגמרי תחת הרדמה, להוציא את זה מהתא ולגלח את הפרווה של העכבר על האזור מעל העכוז השטחי (לרוחב הגב התחתון) באמצעות מכונת קיצוץ שיער חשמלי, על מנת לבצע זריקה נקי עם נוף יפה של האזור יישום.
- מזריקים µL 50 של החיסון, ספורטינג באזור מגולח באמצעות מחט 25-מד.
3. בידוד של לימפוציטים, צביעת לניתוח Cytometry זרימה
- בידוד של לימפוציטים, splenocytes
- המתת חסד העכברים לחסן באמצעות אינהלציה2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם.
- לחלץ את ניקוז ומרוחק הלימפה והטחול ומניחים נפרד פטרי המכילות 100 מיקרומטר נקבובית רשת כוסות לשחרור תא וליטוש רקמות. בצע את שלבים 1.1.2 דרך 1.1.3.
- Decant את תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה, מחדש להשעות את כדורי תאים באותו אמצעי אחסון של שריד PBS (כ- 100 µL).
- צביעת לניתוח cytometry זרימה
- בשפופרת צנטרפוגה 15-mL להכין את תערובת הבסיס המכיל את הנוגדנים מכתימים בריכוזים מתואר טבלה 1, ובכך מניב 2 x מיקס מכתימים מרוכז. להכין כמות גדולה מספיק של מיקס מאסטר לי µL 100 לכל דגימה. לערבב את התאים ואת המיקס מאסטר 1:1, דגירה זה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
הערה: אמצעי האחסון מכתימים הסופי עבור דגימה צריך להיות µL 200 (100 µL של התא µL צנפה +100 של מיקס מאסטר נוגדנים). - לשטוף את התאים פעמיים על ידי צנטריפוגה כפי שמתואר 1.1.3, הוספת 10 מ"ל ל- PBS, פעמיים.
- מחדש להשעות את התאים ויטראז'ים ב 0.5-1 מ של PBS עבור הרכישה והעברת ההשעיה כדי זרימת cytometer צינורות. תמיד שומרים את הדגימות על קרח, מוגן מפני אור.
- בשפופרת צנטרפוגה 15-mL להכין את תערובת הבסיס המכיל את הנוגדנים מכתימים בריכוזים מתואר טבלה 1, ובכך מניב 2 x מיקס מכתימים מרוכז. להכין כמות גדולה מספיק של מיקס מאסטר לי µL 100 לכל דגימה. לערבב את התאים ואת המיקס מאסטר 1:1, דגירה זה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
4. דנ
- תמיד לסנן מראש את דגימות תאים באמצעות 70-100 מיקרומטר מסננים.
- היכונו יחיד פקדים פיצוי מכתימים fluorophores מפורט בטבלה 1 (חרוזים או תאים).
הערה: הפיצוי צריך להיות הופיעה cytometer או ניתוח תוכנה17,18,19 וחלים עליהם כל הדגימות. - בצע את האסטרטגיה המגביל מתואר באיור2. בקצרה, שער אוכלוסיות פיזור קדימה גובה לעומת אזור פיזור קדמי (איור 2 א), ושוב לצד פיזור רחב לעומת פיזור מצידו (הסוכן המיוחד, איור 2B) כדי לא לכלול doublets.
- שער האוכלוסייה מ 2B איור על ידי התוויית BV 650 (auto-זריחה) לעומת FITC (CFSE) כדי להפלות CFSE נכון מוכתם תאים מתאי אוטומטי-פלורסנט גבוהה. כולל חרוזים או תאים צבעונית עם נוגדן מצומדת אל BV 650 לפקדי פיצוי. זו עלילה (איור 2C) של 650 BV לעומת FITC משמש לשער בשטחים הכבושים-אני CFSE צבעונית תאים.
- שער האוכלוסייה מאיור 2 C עבור Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) לעומת APC (CD8) כדי להבחין בין תאים שמקורם התורם לעומת עכברים הנמען.
הערה: תאים שמקורם בתנ ך-אני תורם עכברים הם Thy1.1+ (CD90.1), ואילו (C57BL/6, הנמען) תאים WT נגזר עכברים הם Thy1.2+ (CD90.2) (איור דו-ממדי). יש כמה מעבדות OT-אני עכברים Thy1.2 רקע, WT (C57BL/6) ב- Thy1.1. במקרה זה אתה חייב להשתמש נוגדן נגד Thy1.2 OT-אני תא gating. - מחדש שער CD8+ תאים Thy1.1+ אוכלוסייה על-ידי התוויית אותה על שער הכוללת BV 450 (CD4) לעומת APC (CD8) (2E איור).
- להציג את האוכלוסייה מגודרת ב איור 2E באמצעות תצוגה היסטוגרמה של CD8+ תאים מציג CFSE (FITC, ערוץ 530/15 - לייזר כחול-), שער האוכלוסייה proliferated על-ידי הכללת בעוצמות מ-102 עד רמת איפה השליטה המלאה שאוכלוסיות (עוצמות ~ 105, בהתאם היעילות של ההכתמה CFSE וההגדרה מתח על cytometer הזרימה) (איור 2F).
- לעשות שער נוסף (לא מוצג באיור 2) ההתוויה FITC לעומת L/D סמן (450/20 ערוצים, UV לייזר) על מנת להעריך תאים מתים במקביל הערכת התפשטות.
- רוכשים אירועים לפחות 5000 עבור הפקדים פיצוי ואירועים 10.000 (שער E, איור 2) מדגימות ב cytometer זרימה. הפעל את cytometer בעת זרימה נמוכה או בינונית (לא יעלה על המחירים זרימה של 20.000 אירועים/s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על מנת לבדוק את הטיפולים באמצעות שילוב שונה של adjuvants (ADJ1 ו- ADJ2), אנחנו שהערכת את קיבולת דור CTL על ידי מדידת התפשטות הועבר adoptively OT-אני CD8+ T תאים על-ידי cytometry זרימה (איור 2). בשביל זה, אנחנו קודם לכן מוכתם תאים מבודדים ניקוז הלימפה והטחול (טבלה 1). על ידי מדידת ההתפשטות של CD8+ T תאי הלימפה והטחול, הצלחנו לאמת גבוהה יותר CTL דור קיבולת של ADJ2 ניקוז הלימפה (איור 3) בהשוואה ADJ1, ביצית לבד או שליטה PBS. לעומת זאת, הבחנו כי ADJ2 לא היה מסוגל לייצר היענות CTL תא מערכתית (הטחול), בעוד ADJ1 היה מראה רמות גבוהות של התפשטות על ידי הטחול CD8+ T תאים, לא רק בהשוואה הפקדים (PBS וביצית) אבל גם מעולה כדי ADJ1. מאת לנתח את הפעולה של ADJ2 באמצעות הזה assay התפשטות מהירה ויוו , אנחנו יכולים לאשר ופעולתה חזקה כמו מקומי אבל לא מחולל CTL מערכתית. יתר על כן, ADJ1 הפועל שניהם באתר המקומי של הזרקה (ניקוז הלימפה) כמו גם מערכתית OT מוגבר-אני התפשטות של הטחול. התוצאות שהושג מאפשרים לנו לאפיין את הפעילות של אדג'וונט וההיקף שלה, ומעוררות את השפעות שנצפה ADJ2 (מקומי), ADJ1 (מערכתית).
איור 1: ציר הזמן assay. ציר הזמן assay מייצג בשטחים הכבושים הראשונית-תא T להעביר ליום יום 1, 0, החיסון ספורטינג, הטחול דגימה, ניקוז לימפה יומיים מאוחר יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תזרים של האסטרטגיה חסימה עקב כדי למדוד את ההתפשטות של CD8+ T תאים (OT-אני, Thy1.1+) על ידי cytometry זרימה. שני מדגמים מיוצגים בצבעים שונים (אדום ואור כחול) עבור פריט חזותי טוב יותר. א- תאים בודדים הם הפלתה של doublets במרוכז בתוך השערים הראשון שני ידי קדימה-פיזור-גובה לעומת העבר-פיזור-אזור ורוחב צד-פיזור-לעומת צד-פיזור-אזור. ג תאים מגודרת ב' מוצגים על ידי שלהם עוצמות קרינה פלואורסצנטית BV 650 ערוץ (auto זריחה) לעומת עצמתם CFSE (איפה diming מציין תאים חטיבות/התפשטות) בערוץ YG 530/30. שער זה מאפשר הבחירה של אמת CFSE תאים חיוביים על ידי להפלות אותם יש קרינה פלואורסצנטית אוטומטי גבוה. ד CFSE תאים חיוביים היו מגודרת בעוצמה גבוהה פלורסצנטיות שלהם של Pe-Cy7 (Thy1.1, סמן OT-אני תאים) לעומת עצמתם APC (CD8). א 450 BV (CD4) להתוות נגד APC (CD8) עבור בעבר מגודרת Thy1.1 תאים חיוביים לבחירת במדויק CD8+ T תאים. פ בעבר מגודרת CD8+ תאים מותוות בהיסטוגרמה כנגד עוצמת CFSE לשער סוף סוף את האוכלוסייה proliferated. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: אדג'וונט מונע יצירת CTL. היכולת להפיק תגובות CTL מקומי או סיסטמי מתואר 2 אדג'וונט שונים טיפולי (ADJ1 ו- ADJ2) לאורך אנטיגן ופקדים PBS. התפשטות בשטחים הכבושים שהועברו adoptively-אני T תאים נבדק הצומת לימפה המנקזים (המפשעתית, המנהל (ש) החזרתם תת עורית), הטחול, כמצוין השורות איור. התפשטות תא נמדד כל הטיפולים (עמודות) על מנת להשוות במדויק את היקף התגובה החיסונית המקומית (הצומת לימפה המנקזים) או מערכתית (הטחול) טווח הפעולה שלו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| צבעי - נוגדנים | שיבוט | Fluorophore/ערוץ-סינון | ריכוז 2 X |
| Thy1.1 (CD90.1) | HIS51 | PE-Cy7 - YG 780/60 | 1:750 |
| CD8 | 53-6.7 | APC - 670/14 R | 1:280 |
| CD4 | RM4-5 | BV 421-450/50 V | בטחונות |
| CFSE | - | FITC - YG 530/30 | (על פי פרוטוקול CFSE מכתים) |
| DCM (מת תא מרקר) | - | -/ לעיניים - 450/50 UV | שבערך |
טבלה 1: נוגדן stainings עבור cytometry זרימה. נוגדנים Fluorophore מצומדת שיבוטים שימוש ומומלץ מכתים ריכוזי (2x).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חיסונים מודרניים הם אידיאלי composedof אנטיגן מטוהרים adjuvants, עם תוספת אפשרית של מערכת המסירה כמו ליפוזומים, חלקיקים דמויי וירוס, חלקיקים או וקטורים בשידור חי. היבט מרכזי בעת עיצוב חיסון היא לבחור את אדג'וונט הנכון בהתאם לצרכים קליניים. חלק הטווח עשוי להיות כרוך העדפה ההורמונאלית לעומת התגובה החיסונית סלולריים (או שניהם), בחירתו של מקומי לעומת לתגובה החיסונית מערכתית (או שניהם), ואת הסוג של זיכרון החיסון צריך להקרין באוכלוסיית היעד. היבט מכריע אחד אדג'וונט ההערכה היא לקבוע במהירות את יכולתה ליצור רשימת האישורים האמינים. הצגנו כאן שיטה המבוססת על טכניקות ידוע כבר, כדי לקבוע במהירות את התכונות של ה CTL התגובה ויוו במודל של עכברים על ידי מדידת OT-אני CD8 T תא התפשטות. שיטה זו מאפשרת לחיזוי של עוצמת התגובה החיסונית שהפיק adjuvants (התפשטות OT-אני T תאים) ב- 4 ימי עבודה. שיטה זו עוד יותר מקלה על ההשוואה של הפעולות של adjuvants מבחינת התגובה החיסונית (מקומי לעומת מערכתי) ואת פעילותו האפקטיבית. כאן, יש הראינו דוגמא על מה חיסונים עם טיפולים שונים אדג'וונט (ADJ1 לעומת ADJ2) ישפיעו על התגובה החיסונית. הפעולה של ADJ2 היה מוגבל לאזור המקומי של המינהל איפה שהוא מפעיל את התגובה החיסונית בלוטות לימפה המנקזים, ואילו הפעולה של ADJ1 עם המינון אותו נפוצה יותר, יצירת CTL תגובה שניהם-אבל ברמה מקומית ומערכתית עם העוצמה פחות מאשר ADJ2 ניקוז הלימפה.
שלבים קריטיים עבור הערכת מוצלחת CTL קיבולת של אדג'וונט הם הבחירה של צעירים OT-אני חיות (כמקור של תאי CD8 T), השימוש של ביצית ללא אנדוטוקסין עבור חיסונים. מאז OT-אני עכברים הם חיות הטרנסגניים שנוצר כדי לייצר תאי CD8 T מזהה פפטיד ביצית SIINFEKL ב- MHC-אני הקשר, מבחר מלאכותית של העכבר TCR מגדיל מראית עין של CD8 proliferative היפר+ T תאים20 עם הגיל. דלקת של בלוטות הלימפה בבית השחי ולכן הוא תכונה שכיחה יותר בגילאי וויבר-אני עכברים. . לוקח את זה בחשבון, מומלץ להשתמש OT צעיר-אני חיות במידת האפשר (6-9-בת שבוע חיות) והורחב כדי למנוע בידוד תאים מכל האיברים (או טחול בלוטות הלימפה). השימוש של איברים מוגדלים עם מתרבים בתאי CD8 T ישפיעו וזמינותו כל שכן קרוב לוודאי הבדלים התפשטות בין פקדים, טיפולים לא יתקבל. כנחותים דומה על האפליה של אדג'וונט CTL דור קיבולת יכולים להיווצר באמצעות חלבון ביצית עם עקבות אנדוטוקסין, אשר יכול מביאות לתגובה החיסונית חזק יותר לעומת ללא אנדוטוקסין ביצית21,22 (ראה חומרים, ריאגנטים), מאחר endotoxins חיסונית חזקה-מאפננים כשלעצמה 23. לכן, החלבון ביצית המשמש עבור חיסונים חייב להיות נטול אנדוטוקסין. השימוש µg 20 או 50 של ביצית ללא אנדוטוקסין תלוי על דרך חיסון להיות 50 µg מנה מתאימה לבדיקת תת עורית adjuvants. בנוסף, השימוש של ריכוזים גבוהים של CFSE דווחה בספרות להרוג את התאים מוכתם24 , יכול גם לגרום לכישלון וזמינותו.
כמה שינויים או שיפורים טכניקות שונות בשימוש בפרוטוקול יושמו על מנת להפחית את הלחץ של בעלי החיים, כדי להגדיל את הפארמצבטית הניסויים. לדוגמה, כדי למזער את החימום של בעלי חיים על ידי רק חימום הגב והזנב של העכברים, לא כל החיות, או להימנע בזריקה תת עורית הקשורים מתח על ידי מאלחש את בעלי החיים לפני החיסון. ההרדמה לא נדרש על ידי תקנות רווחת זריקה תת עורית אך מניסיוננו, משפר הפארמצבטית על ידי הפחתת וריאציות שהציג את תגובת המתח.
מגבלה הגדול של שיטה זו הוא כי מאז CFSE כתמים הקרום של תאים, בהירותו גבוהה פוגע בדרך כלל הגילוי של אותות ציטוזול. לכן, אם נדרש האישור של CTL קיבולת, הפרשת IFN-γ צריך להעריך וזמינותו של הפרשה ספציפית 25, ולא באמצעות צביעת ציטוקין תאיים.
השימוש של מידת התפשטות כדי לאמוד את הקיבולת דור CTL מאת adjuvants 4 ימים יש את היתרון של זמן קצר צריך מאשר CTL מסורתי מבחני26 , וזה טוב פוטנציאליים הניסוי במקרה שבו נוסף יש צורך באבחנה בשיטות אחרות.
למרות מוגבלת ביצית כמו אנטיגן, ולכן על השימוש OT-אני T תאים, השיטה המובאת כאן מאפשר חקר מאפייני ההפעלה שנגזרות adjuvants שונה לאחר מיון של תאי proliferated. אחד היישומים האפשריים הוא המחקר של החתימות מטבולית הנגרמת על ידי adjuvants שונים בתנ ך proliferated-אני T תאים, קשרי הגומלין שלה עם התפתחות הזיכרון27. הקרנות משניים נוספים יכול להעריך את תכונות ביולוגיות של תאי מגורה, כגון הביטוי של ציטוקינים או סמנים degranulation על ידי cytometry זרימה או יכולת ציטוטוקסיות שלהם על-ידי ביצוע ויוו CTL בדיקות8, 26 , 28. מאז יישום זה יש המגבלה של השימוש שלה בעכברים, extrapolations לבני אדם יכול להתבצע על ידי הקרנות מנצל המבוסס על עכברים humanized29,30,31.
שיטה זו כפי הוצגו כאן היא יציבה מספיק כדי לשמש ההקרנה הראשונה עבור הבחירה של תגובת תאי מפעילים גם גמיש מספיק. כדי להיות שונה או מצמידים ניתוח נוסף של תאי T proliferated. לסיכום, זו מהירה בהערכת vivo של אדג'וונט CTL דור קיבולת הוא כלי אידיאלי עבור מעבדות חיסון בתעשייה ובאקדמיה המעוניינים אפיון מהיר של מצב הפעולה של המולקולות המועמד אדג'וונט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנחנו חבים שלנו סגל: U. Bröder, ה Shkarlet, שעזר לנו במהלך הליכי ניסיוני. עבודה זו מומן בחלקו על ידי האיחוד האירופי (UniVax, חוזה מס 601738 ו- TRANSVAC2, חוזה מס 730964), ומענקים מענק האגודה הלמהולץ (חי-ד ר רודי). מקורות המימון לא להשפיע על המחקר, עיצוב, דור של כתב היד או להגיש את זה לפרסום.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
| CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
| APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
| BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
| Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
| EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
| Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
| Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
| C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
| OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
| FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
| Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
| PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
| Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
| Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
| RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
| Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
| Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
| Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |
References
- Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
- Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
- Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
- Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
- Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
- Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
- Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
- Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
- Ebensen, T., et al. Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
- Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
- Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
- Otto, K. The Laboratory Mouse. Bullock, G. , Academic Press. 555-569 (2004).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).
- Shimizu, S. The Laboratory Mouse. Bullock, G. , Academic Press. 527-542 (2004).
- Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
- Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, Clifton, N.J. 109-134 (2012).
- Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
- Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
- Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
- Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
- Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. , 79-85 (2009).
- Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
- Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
- O'Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
- Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
- Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
- Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
- Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).
