Summary
Qui presentiamo un'applicazione per una tecnica immunologica standard (CFSE macchiato OT-ho proliferazione) destinato a monitorare rapidamente adiuvante-mediata di linfociti T citotossici (CTL) generazione in vivo. Questa veloce stima delle capacità CTL è utile per lo sviluppo di vaccini profilattici contro patogeni intracellulari, come pure i vaccini terapeutici del cancro.
Abstract
La valutazione dei vaccini moderni sottounità rivela che la generazione di anticorpi neutralizzanti è importante ma non sufficiente per la selezione di adiuvante. Di conseguenza, adiuvanti con capacità immuno-stimolante sia umorali e cellulari che sono in grado di promuovere le risposte citotossiche (CTL) di linfociti di T sono urgentemente necessari. Quindi, monitoraggio fedele dei candidati adiuvante che inducono cross-priming e successivamente migliorano CTL generazione rappresenta un passo cruciale nello sviluppo del vaccino. Qui vi presentiamo un'applicazione per un metodo che utilizza SIINFEKL specifici (OT-ho) cellule di T per monitorare la cross-presentazione del modello antigene ovoalbumina (uova) in vivo in presenza di candidati diversi adiuvante. Questo metodo rappresenta un test rapido per selezionare adiuvanti con le migliori funzionalità di cross-priming. La proliferazione di CD8+ T cellule è l'indicazione più preziosa di cross-priming ed è anche considerato come un correlato di indotta da adiuvante cross-presentazione. Questa funzionalità può essere valutata in differenti organi immuni come i linfonodi e la milza. Nella misura della generazione CTL possa anche essere monitorata, dando intuizioni sulla natura di un locale (svuotamento linfonodale principalmente) o una risposta sistemica (linfonodi a distanza e/o milza). Ulteriormente questa tecnica permette modifiche multiple per testare i farmaci che possono inibire specifiche vie di cross-presentazione e offre anche la possibilità di essere utilizzato in diversi ceppi di topi convenzionali e geneticamente modificati. In sintesi, l'applicazione che vi presentiamo qui sarà utile per i laboratori di vaccino nell'industria o academia che sviluppano o modificare coadiuvanti chimici per vaccino ricerca e sviluppo.
Introduction
Linfociti T citotossici (CTL) che inducono i vaccini sono fondamentali interventi terapeutici che sono stati sviluppati per combattere alcuni tipi di cancro1. CTL sono anche importanti per vaccini profilattici contro patogeni intracellulari2. Inoltre, CTL sono uno dei meccanismi di difesa immunitario pochi funzionalmente attivi in popolazioni a rischio come neonati3,4 quali dipendono anche CTL per combattere infezioni di vita iniziali5. A questo proposito, i vaccini contro il Virus respiratorio sinciziale (RSV) che sono stati sviluppati con un adiuvante che non suscitare le risposte CTL (allume) ha provocato un completo fallimento del vaccino che porta a gravi complicazioni su infezioni in infanti6. Questi effetti negativi della vaccinazione possono essere invertiti da un CD8+ di risposta delle cellule T7. Precedentemente abbiamo dimostrato che le principali citochine (interferoni di tipo I) suscitate da alcuni stimolatore di agonisti di geni (STING) di interferone sono essenziali per le risposte CTL generate da questi adiuvanti8, in parte misurando la proliferazione delle OT-I T cellule dopo vaccinazione e utilizzando questi risultati come una misura di CTL inducendo capacità osservata in esteso vaccinazione orari9. La misurazione della proliferazione di OT-ho CD8+ T cells in un mouse di destinatario C57BL/6 wild type (WT) di tintura di carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) diluizione è una stima robusta della capacità dell'adiuvante di un vaccino per generare cross-priming di SIINFEKL, (il peptide di immuno-dominante di ovoalbumina, uova). Variazioni di questa tecnica sono ampiamente utilizzati per la valutazione della proliferazione di OT-ho CD8+ e OT-II CD4+ T cellule. Ad esempio, esso è stato utilizzato in assenza delle citochine selezionate (topi KO) o per misurare l'efficacia del vaccino dopo il richiamo dell'antigene negli animali WT. Abbiamo messo a punto un protocollo breve (4 giorni esperimento) in cui dopo il trasferimento passivo di CFSE-macchiato OT-ho CD8+ T cells, una sottocutanea immunizzazione (s.c.) che consiste di una dose di 50 µ g di ovuli privo di endotossina completati con adiuvanti di prova viene somministrata (Figura 1). Il follow-up dei risultati 48 h dopo la vaccinazione fornisce una prova affidabile della capacità dell'adiuvante per generare risposte CTL. Da questa strategia, è possibile valutare la potenza della risposta immunitaria locale nel linfonodo drenante dopo immunizzazione, nonché l'entità della risposta misurando l'attività CTL nella milza (o linfonodi a distanza).
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Protocol
Tutti i topi utilizzati in questo studio erano dallo sfondo C57BL/6. Tutti gli animali erano tenuti in condizioni esenti da patogeni. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo la normativa della legge tedesca di protezione animale (TierSchG BGBl. I S 1105; 25.05.1998) e sono stati approvati dal Comitato Bassa Sassonia l'etica di esperimenti di animale e l'ufficio statale (Bassa Sassonia stato ufficio della protezione dei consumatori e la sicurezza alimentare), sotto il numero di permesso 33,4-42502-04-13/1281 e 162280.
1. CFSE macchiatura di OT-I T cellule e trasferimento adottivo
Nota: OT-I topi sono animali transgenically generati che esprimono un recettore delle cellule T (TCR) con fisso α e β catene che insieme riconoscono il peptide di immuno-dominante di ovuli, SIINFEKL10,11. Di conseguenza, questi topi hanno un numero considerevolmente elevato di CD8 specifici SIINFEKL+ T cellule (97%)12 rispetto ai topi normali o OVA-vaccinati (≤ 1%)13.
- Isolamento di CD8 tracciabili+ T cellule da OT-I topi che esprimono specifici del linfocita T Thy1un (Thy1.1) allele:
- Eutanasia 6-9 settimane vecchio OT-I topi da inalazione di CO2 seguirono da dislocazione cervicale14. Sezionare la milza e linfonodi principali (solo per coppie di inguinale, ascellare e cervicale) tagliando la pelle con forbici chirurgiche, staccando la pelle dal corpo con l'aiuto di pinze chirurgiche e forcipe e metterli in capsule di Petri (60 x 15 mm) ognuno dei quali contiene un 100 µm poro maglia Coppa per rilascio di macinazione e delle cellule del tessuto.
- Mantenere di Petri (ciascuno con una mesh Coppa) in 3-5 mL di terreno RPMI completo (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 U/mL penicillina, 50 µ g/mL di streptomicina) tenuta su ghiaccio.
- Schiacciare gli organi con l'aiuto di un stantuffo della siringa o un analogo strumento sterile (previo taglio non è necessario) e raccogliere la sospensione singola cella risultante in provette per centrifuga da 15 mL.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante. Lavare le cellule in 10 mL di PBS freddo mediante centrifugazione e lisare gli eritrociti dalla milza sospendendo nuovamente il pellet in 1 mL/milza del cloruro di ammonio buffer (buffer di ACK, disponibili in commercio). Incubare le cellule per 1,5 min sul ghiaccio e successivamente lavare le cellule con 10 mL di PBS freddo mediante centrifugazione (come fatto in precedenza).
- Risospendere il pellet nello stesso tubo in 1 mL di PBS (pH 7,2) contenente 5% di siero bovino fetale per isolamento magnetico.
- Per eseguire l'isolamento magnetico, procedere alla selezione negativa di CD8+ T cellule utilizzando un kit di isolamento magnetico secondo le istruzioni del produttore o pubblicato protocolli15.
- Per eseguire la colorazione di CFSE, prima di contare il numero di CD8+ T cellule ottenute da OT-I topi utilizzando un contatore di cellule automatizzato (contatore di particelle). 1-5 di macchia x 107 cellule/mL in un volume di 1-5 mL con 5 µM CFSE in PBS per 7 min a 37 ° C, al riparo dalla luce in un tubo falcon di 15 ml.
- Placare la macchiatura CFSE aggiungendo lo stesso volume (1:1) di siero bovino fetale alle cellule e li Incubare per ulteriori 7 min a 37 ° C al riparo dalla luce. Lavare le cellule con 10 mL di PBS due volte.
- Contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Impostare il numero di cellulare da 3-5 x 107 cellule/mL di PBS al fine di iniettare 3-5 x 106 cellule/mouse in 100 µ l per via endovenosa (i.v.) tramite vena caudale.
- Per eseguire iniezioni della vena della coda, immobilizzare i topi in dispositivi appropriati. Scaldare la zona posteriore e la coda dei topi da iniettare utilizzando una lampada di luce rossa, posizionata tra 20 a 25 centimetri lontano i topi per 1-3 minuti consentire la vasodilatazione della vena della coda.
Nota: Questo consente alla facilità della vena rilevamento e all'amministrazione della sospensione delle cellule. - Garantire (con la mano appoggiata tra i topi e la lampada) che non è troppo caldo per i topi e quando le vene di coda sono chiaramente visibili, procedere all'iniezione. Iniettare le cellule nella vena caudale laterale o dorsale utilizzando una siringa da 1mL con un ago calibro 2516.
2. immunizzazione (Endo-libero OVA + /-adiuvante)
- Posizionare i topi trapiantati con OT-ho cellule (passaggio 1.7, Figura 1) in una camera di anestesia e isoflurano in ossigeno per amministrare un anestesia macchina14.
- Quando il mouse è completamente addormentato sotto anestesia, tirarla fuori dalla camera e radere il pelo del mouse sulla zona sopra gluteus superficialis (laterale bassa della schiena) utilizzando una macchina di taglio di capelli elettrico, al fine di eseguire un'iniezione pulito con una buona vista della zona di applicazione.
- Iniettare 50 µ l del vaccino, s.c. in zona rasata utilizzando un ago di calibro 25.
3. isolamento dei linfociti e la macchiatura per analisi di citometria a flusso
- Isolamento dei linfociti e splenocytes
- Eutanasia i topi vaccinati per inalazione di CO2 seguita da dislocazione cervicale.
- Estrarre i linfonodi drenanti e distanti e milza e metterli in piatti separati di Petri contenente 100 µm poro maglia tazze per rilascio di macinazione e delle cellule del tessuto. Seguire i passaggi 1.1.2 attraverso 1.1.3.
- Decantare il supernatante dopo centrifugazione e risospendere il pellet cellulare nello stesso volume del residuo PBS (circa 100 µ l).
- Macchiando per analisi di citometria a flusso
- In una provetta da 15 mL Centrifuga preparare un mix master contenenti gli anticorpi colorazione nelle concentrazioni illustrate nella tabella 1, producendo così un mix concentrato di colorazione di 2x. Preparare abbastanza volume di mix master di avere 100 µ l per campione. Mescolare le cellule e il mix master 1:1 e viene quindi incubato a 4° C per 30 min.
Nota: Il volume finale di colorazione per campione dovrebbe essere 200 µ l (100 µ l di cella pellet + 100 µ l di mix master anticorpo). - Lavare le cellule due volte mediante centrifugazione, come descritto in 1.1.3, aggiungere 10 mL di PBS, due volte.
- Risospendere le cellule marcate in 0,5-1 mL di PBS per acquisizione e trasferimento della sospensione per tubi cytometer di flusso. Sempre mantenere i campioni sul ghiaccio e al riparo dalla luce.
- In una provetta da 15 mL Centrifuga preparare un mix master contenenti gli anticorpi colorazione nelle concentrazioni illustrate nella tabella 1, producendo così un mix concentrato di colorazione di 2x. Preparare abbastanza volume di mix master di avere 100 µ l per campione. Mescolare le cellule e il mix master 1:1 e viene quindi incubato a 4° C per 30 min.
4. flusso Cytometry
- Sempre pre-filtrare i campioni di cellule utilizzando filtri di 70-100 µm.
- Preparare singola colorazione compensazione controlli per i fluorophores indicati nella tabella 1 (perline o celle).
Nota: Compensazione dovrebbe essere eseguita nel citometro o analisi software17,18,19 e applicato a tutti i campioni. - Seguire la strategia di gating rappresentata nella Figura 2. Brevemente, popolazioni di cancello in altezza di forward scatter vs zona di forward scatter (Figura 2A) e di nuovo a dispersione laterale ampia rispetto all'area di dispersione laterale (SSA, Figura 2B) al fine di escludere doppietti.
- Porta la popolazione da Figura 2B tracciando BV 650 (auto-fluorescenza) vs FITC (CFSE) al fine di discriminare il vero CFSE macchiato le cellule dalle cellule auto-fluorescente alte. Sono perline o cellule colorate con anticorpo coniugato a BV 650 nei controlli di compensazione. Questa trama (Figura 2) del BV 650 vs FITC è usata per cancello l'OT-ho CFSE macchiato le cellule.
- Al fine di distinguere le cellule derivate dal donatore vs topi destinatari del cancello la popolazione da Figura 2 C per Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs APC (CD8).
Nota: Le cellule derivate da OT-I topi del donatore sono Thy1.1+ (CD90.1), mentre le cellule derivate da topi (C57BL/6, destinatario) WT sono Thy 1.2+ (CD90.2) (Figura 2D). Alcuni laboratori hanno OT-I topi in uno sfondo di Thy 1.2 e WT (C57BL/6) in un Thy1.1. In questo caso è necessario usare un anticorpo contro Thy 1.2 per OT-I cellulare gating. - Ri-cancello CD8 cellule di+ da Thy1.1+ popolazione tracciando su un cancello composto da 450 BV (CD4) vs APC (CD8) (Figura 2E).
- Visualizzare la popolazione gated in Figura 2E utilizzando una visualizzazione dell'istogramma del CD8+ cellule che mostrano CFSE (FITC, 530/15 canale - laser blu-), cancello la popolazione proliferata includendo intensità da 102 fino al livello dove le popolazioni di controllo indivisa sono (intensità ~ 105, a seconda l'efficacia di CFSE colorazione e l'impostazione della tensione sul citofluorimetro) (Figura 2F).
- Fare un ulteriore cancello (non visibile in figura 2) tracciato marcatore FITC vs L/D (450/20 canale, UV laser) al fine di valutare le cellule morte in parallelo alla valutazione di proliferazione.
- Acquisire almeno 5000 eventi per i controlli di compensazione e 10,000 eventi (cancello E, Figura 2) dai campioni presso un citometro a flusso. Eseguire il citometro a flusso di basso o medio (non superare le portate di 20.000 eventi/s).
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Representative Results
Al fine di testare i trattamenti utilizzando una diversa combinazione di adiuvanti (ADJ1 e ADJ2), abbiamo valutato la capacità di generazione di CTL misurando la proliferazione di passivamente trasferiti OT-ho CD8+ T cellule mediante citometria a flusso (Figura 2). Per questo, abbiamo precedentemente macchiato le cellule isolate dal drenante nei linfonodi e milza (tabella 1). Misurando la proliferazione di CD8+ T cellule nei linfonodi e milza, siamo stati in grado di corroborare una maggiore capacità di generazione di CTL di ADJ2 nei linfonodi drenanti (Figura 3) rispetto a ADJ1, gli ovuli da soli o controllo PBS. Al contrario, abbiamo osservato che ADJ2 non era in grado di generare una risposta CTL in un compartimento sistemico (milza), mentre ADJ1 era mostrando alti livelli di proliferazione di CD8 splenica+ T cellule, non solo rispetto ai controlli (PBS e ovuli) ma anche superior a ADJ1. Dissezionando l'azione di ADJ2 usando questa analisi di proliferazione rapida in vivo , possiamo confermare la sua forte azione come un locale, ma non un generatore CTL sistemico. Inoltre, ADJ1 agisce sia il locale al sito di iniezione (linfonodi drenanti) come pure sistemica con un'aumentata OT-ho proliferazione nella milza. I risultati ottenuti ci permettono di caratterizzare l'attività di adiuvante e la sua estensione, esemplificato dagli effetti osservati di ADJ2 (locale) e ADJ1 (sistemica).
Figura 1: analisi timeline. Il temporale di analisi rappresenta l'OT iniziale-cellula T a trasferire al giorno 0, la vaccinazione di s.c. al giorno 1 e la milza di campionamento e i linfonodi di drenaggio 2 giorni più tardi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: diagramma di flusso della strategia di gating seguita per misurare la proliferazione di CD8+ T cellule (OT-I, Thy1.1+) tramite flusso cytometry. Due esempi sono rappresentati in diversi colori (rosso e azzurro) per una migliore visualizzazione. A-B. Cellule singole sono discriminate da doppietti successivamente nelle prime due porte tracciando forward-scatter-altezza vs forward-scatter-zona e larghezza-laterale-scatter vs zona scatter, side. C. vengono visualizzate le celle gated in B da loro intensità di fluorescenza del canale 650 BV (fluorescenza auto) tramato contro la loro intensità CFSE (dove veramente intenzionato indica divisioni/proliferazione delle cellule) nel canale YG 530/30. Questa porta consente la selezione delle cellule positive di vero CFSE discriminando coloro che hanno auto alta fluorescenza. D. cellule positive CFSE erano gated con loro intensità alta fluorescenza di Pe-Cy7 (Thy1.1, marcatore per OT-I le celle) vs loro intensità APC (CD8). E. 450 BV (CD4) tramato contro APC (CD8) per precedentemente gated Thy1.1 cellule positive per selezionare con precisione CD8+ T cellule. F. precedentemente gated CD8+ le celle vengono tracciate in un istogramma contro l'intensità CFSE al cancello infine la popolazione proliferata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: adiuvante guidato generazione CTL. La capacità di suscitare le risposte CTL locale o sistemiche è raffigurata per 2 trattamenti diversi adiuvante (ADJ1 e ADJ2) lungo l'antigene e controlli di PBS. La proliferazione del OT passivamente trasferiti-I T cellule viene esaminato nel linfonodo drenante (inguinale, per l'amministrazione esemplificato sottocutanea (s.c.)) e nella milza, come indicato nelle righe delle figura. La proliferazione delle cellule è misurata in tutti i trattamenti (colonne) al fine di comparare con precisione nella misura della risposta immunitaria nel suo locale (linfonodo drenante) o sistemica (milza) gamma di azione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Coloranti - anticorpi | Clone | Fluoroforo/canale-filtro | Concentrazione di 2 X |
| Thy1.1 (CD90.1) | HIS51 | PE-Cy7-780/60 YG | s 1: 750 |
| CD8 | 53-6,7 | APC - 670/14 R | 1: 280 |
| CD4 | RM4-5 | BV: 421-450/50 V | 1: 100 |
| CFSE | - | FITC - 530/30 YG | (secondo protocollo di macchiatura CFSE) |
| DCM (morto indicatore di cella) | - | -/ U.V. - 450/50 UV | 1: 500 |
Tabella 1: anticorpo stainings per citometria a flusso. Cloni di anticorpo coniugato fluoroforo utilizzato e raccomandato macchiatura concentrazioni (2x).
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Discussion
Moderni vaccini sono idealmente ospita l'antigene purificato e adiuvanti, con l'eventuale aggiunta di un sistema di consegna come liposomi, particelle virus-like, nanoparticelle o vettori dal vivo. Un aspetto fondamentale durante la progettazione di un vaccino è quello di scegliere il giusto adiuvante secondo le necessità cliniche. Parte dell'ambito potrebbe coinvolgere favorendo un umorale vs risposta immunitaria cellulare (o entrambi), l'elezione di un locale vs una risposta immunitaria sistemica (o entrambi) e il tipo di memoria che il vaccino deve generare nella popolazione bersaglio. Un aspetto cruciale della valutazione adiuvante è quello di determinare rapidamente le sue capacità di generare CTL. Abbiamo presentato qui un metodo basato su tecniche già conosciute, per determinare rapidamente le caratteristiche del CTL risposta in vivo in un modello murino misurando OT-I CD8 T proliferazione delle cellule. Questo metodo consente la previsione della potenza della risposta immunitaria suscitata da adiuvanti (proliferazione di OT-I T cellule) in soli 4 giorni lavorativi. Questo metodo inoltre facilita il confronto tra le azioni dei coadiuvanti in termini di risposta immunitaria (local vs sistemica) e la sua azione efficace. Qui, abbiamo mostrato un esempio su come l'immunizzazione con trattamenti coadiuvanti diversi (ADJ1 vs ADJ2) influenzerà la risposta immunitaria. L'azione di ADJ2 era limitato alla zona locale, dell'amministrazione, dove attiva la risposta immunitaria nei linfonodi drenanti, considerando che l'azione di ADJ1 con la stessa dose era più diffusa, generando una risposta CTL al ma di livello locale e sistemica con meno potenza rispetto ADJ2 nei linfonodi drenanti.
Fasi critiche per la valutazione del successo della capacità di un adiuvante CTL sono la scelta del giovane OT-ho animali (come fonte di cellule T CD8) e l'uso di ovuli di endotossina-free per l'immunizzazione. Dal OT-ho i topi sono animali transgenici generati per produrre le cellule di T di CD8 che riconoscono peptide OVA SIINFEKL in un MHC-io contesto, sua selezione artificiale del mouse TCR aumenta le apparenze di CD8 proliferativa iper+ T cellule20 con l'età. Un'infiammazione dei linfonodi ascellari è quindi una caratteristica più comune di invecchiato OT-I topi. Tenendo conto di questo, si raccomanda di utilizzare giovane OT-ho animali quando possibile (6-9-settimana-vecchi animali) e per evitare di isolare le cellule da qualsiasi allargata organi (o milza dei linfonodi). L'uso di organi ingrossati con proliferazione le cellule T CD8 influenzerà il dosaggio intero in quanto non si otterrà molto probabilmente differenze nella proliferazione tra controlli e trattamenti. Un simile trabocchetto per la discriminazione di capacità di generazione di CTL adiuvante può essere generato tramite proteina OVA con tracce di endotossina, che può suscitare una risposta immunitaria più potente rispetto al privo di endotossina OVA21,22 (Vedi Materiali e reagenti), poiché le endotossine sono forte immuno-modulatori per sé 23. Di conseguenza, la proteina di OVA utilizzata per l'immunizzazione deve essere privo di endotossina. L'utilizzo di 20 o 50 µ g di ovuli privo di endotossina dipende l'itinerario di immunizzazione essendo 50 µ g una dose adatta per test sottocutaneo dei coadiuvanti. Inoltre, l'uso di alte concentrazioni di CFSE è stata segnalata nella letteratura per uccidere le cellule marcate24 e potrebbe anche provocare il fallimento del dosaggio.
Alcune modifiche o miglioramenti a diverse tecniche utilizzate nel protocollo sono stati implementati per ridurre lo stress degli animali, per incrementare la riproducibilità degli esperimenti. Ad esempio, per ridurre al minimo il riscaldamento degli animali riscaldando solo il dorso e la coda di topi e non l'intero animale, o per iniezione sottocutanea di evitare lo stress legato da anestetizzare gli animali prima della vaccinazione. L'anestesia non è richiesto dalla normativa sul benessere degli animali per iniezione sottocutanea, ma nella nostra esperienza, migliora la riproducibilità diminuendo variazioni introdotte dalla risposta allo stress.
Una grande limitazione di questo metodo è che, poiché CFSE macchie la membrana delle cellule, sua alta luminosità solitamente altera la rilevazione di segnali dal cytosol. Pertanto, se è necessaria la conferma della capacità CTL, la secrezione di IFN-γ dovrebbe essere valutata da un saggio di secrezione specifico 25e non dalla macchiatura intracellulari di cytokine.
L'utilizzo della misurazione della proliferazione di stimare la capacità di generazione di CTL di adiuvanti in soli 4 giorni ha il vantaggio di tempi necessari di CTL tradizionali saggi26 ed è un buon futuro esperimento nel caso dove ulteriore è necessaria la conferma da altri metodi.
Anche se limitato ad ovuli come antigene e di conseguenza all'uso di OT-I T cellule, il metodo presentato qui permette lo studio delle proprietà dell'attivazione indotta da adiuvanti diversi dopo l'ordinamento delle cellule proliferate. Una delle applicazioni possibili è lo studio delle firme metaboliche indotta da diversi adiuvanti in OT proliferate-I T cellule e le sue relazioni con lo sviluppo di memoria27. Ulteriori proiezioni secondario potrebbero valutare le proprietà biologiche delle cellule stimolate, quali l'espressione di citochine o marcatori di degranulazione da citometria a flusso o la loro capacità citotossica eseguendo in vivo CTL test8, 26 , 28. Dal momento che questa applicazione ha la limitazione del suo uso nei topi, estrapolazioni per gli esseri umani possono essere eseguite da sfruttare proiezioni basate su topi umanizzati29,30,31.
Questo metodo come abbiamo presentato qui è abbastanza robusto per essere utilizzato come un primo screening per la selezione di attivatori della risposta cellulare e anche sufficientemente flessibile per essere modificati o accoppiato ad un'ulteriore analisi delle cellule T proliferate. In sintesi, questa rapida valutazione in vivo della capacità di generazione di CTL adiuvante è uno strumento ideale per laboratori di vaccino nel mondo accademico e industriale che sono interessati a una caratterizzazione rapida della modalità di azione delle loro molecole candidate adiuvante.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati ai nostri assistenti tecnici: U. Bröder e H. Shkarlet, che ci hanno aiutato durante le procedure sperimentali. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla UE sussidi (UniVax, contratto n. 601738 e TRANSVAC2, contratto n. 730964) e una sovvenzione di Associazione Helmholtz (know-IDR). Le fonti di finanziamento non hanno influenzato la ricerca di design, generazione del manoscritto o decisione di inviarla per la pubblicazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
| CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
| APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
| BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
| Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
| EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
| Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
| Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
| C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
| OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
| FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
| Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
| PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
| Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
| Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
| RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
| Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
| Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
| Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |
References
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