Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Rask i Vivo evaluering av adjuvants cytotoksiske T-lymfocytter generasjon evner for vaksineutvikling

doi: 10.3791/57401 Published: June 19, 2018

Summary

Vi presenterer her en søknad om en standard immunologiske teknikk (CFSE farget OT-jeg spredning) skal overvåke raskt adjuvant-mediert cytotoksisk T lymfocytt (CTL) generasjon i vivo. Denne rask estimering av CTL kapasitet er nyttig for utvikling av forebyggende vaksiner mot intracellulær patogener som terapeutiske kreft vaksiner.

Abstract

Vurdering av moderne sub-enhet vaksiner avslører at generering av nøytralisere antistoffer er viktig, men ikke tilstrekkelig for adjuvant valg. Derfor trengs adjuvans med både humoral og cellulær immuno-stimulerende evner som kan fremme cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) svar haster. Dermed representerer trofaste overvåking av adjuvant kandidater som induserer kryss-grunning og deretter forbedre CTL generasjon et viktig skritt i vaksineutvikling. Her presenterer vi et program for en metode som bruker SIINFEKL-spesifikke (OT-jeg) T-celler å overvåke kryss-presentasjonen av modellen antigen ovalbumin (OVA) i vivo i nærvær av forskjellige adjuvant kandidater. Denne metoden representerer en rask test for å velge adjuvans med beste kryss-grunning evner. Spredning av CD8+ T celler er den mest verdifulle indikasjonen på tvers-grunning og det anses som en relateres til adjuvant-indusert kryss-presentasjon. Denne funksjonen kan evalueres i ulike immun organer som lymfeknuter og milt. Omfanget av CTL generasjon kanne likeledes være kontrollert, og dermed gi innsikt på natur en lokal (drenering lymfeknute hovedsakelig) eller en systemisk respons (Fjern lymfeknuter og/eller milt). Denne teknikken videre kan flere modifikasjoner for testing stoffer som kan hemme bestemte kryss-presentasjon stier og tilbyr også muligheten til å bli brukt i ulike stammer konvensjonelle og genmodifiserte mus. Oppsummert vil programmet som vi presenterer her være nyttig for vaksine laboratorier i industrien eller akademia som utvikle eller modifisere kjemiske adjuvans for vaksine forskning og utvikling.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) inducing vaksiner er viktige terapeutiske tiltak som er utviklet for å bekjempe visse typer kreft1. CTL er også viktig for forebyggende vaksiner mot intracellulær patogener2. Videre CTLEN er en av de få immun forsvarsmekanismer funksjonelt aktive risiko bestander som nyfødte3,4 som også avhenger CTL å bekjempe tidlig liv infeksjoner5. I denne forbindelse resulterte vaksiner mot luftveiene Syncytial Virus (RSV) som ble utviklet med en adjuvans som ikke framprovosere CTL svar (Alun) i fullstendig fiasko vaksine fører til alvorlige komplikasjoner ved infeksjoner i spedbarn6. Disse negative effekter av vaksinasjon kan reverseres ved en CD8+ T celle respons7. Vi har tidligere vist at de viktigste cytokiner (type jeg interferoner) brakt frem av noen stimulator av interferon gener (BRODD) agonister er avgjørende for Sertifikatklareringslisten svarene generert av disse adjuvans8, delvis ved å måle spredning OT-jeg T celler etter vaksinasjon og bruke disse treffene som et mål på CTLEN inducing evner observert i utvidet vaksinasjon tidsplaner9. Måling av spredning av OT-jeg CD8+ T celler i en vill-type (WT) C57BL/6 mottaker mus carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) fargestoff fortynning er en robust estimering av evnen til adjuvant en vaksine generere Cross-fylling av SIINFEKL, (immuno-dominante peptid av ovalbumin, OVA). Varianter av denne teknikken er mye brukt til vurdering av spredning av OT-jeg CD8+ og OT-II CD4+ T celler. For eksempel er det brukt i fravær av valgte cytokiner (KO mus) eller måle vaksinen etter antigen tilbakekalling i WT dyr. Vi utviklet en kort protokoll (4 dager eksperimentet) der etter passiv overføring av CFSE-farget OT-jeg CD8+ T celler, en subcutaneous (SC) immunisering bestående av en dose av 50 µg av endotoxin-fri OVA supplert med test adjuvans administreres (Figur 1). Oppfølging av resultatene 48 timer etter vaksinasjon gir en pålitelig bevis av kapasiteten til adjuvant til CTLEN svar. Ved denne strategien er det mulig å vurdere styrken på lokale immunrespons i drenering lymfeknute etter immunisering samt omfanget av svaret ved å måle CTL aktiviteten i milten (eller fjern lymfeknutene).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle mus brukt i denne studien var fra C57BL/6 bakgrunnen. Alle dyrene ble holdt under patogen-gratis forhold. Alle eksperimentene ble utført etter den normative tyske Dyrevern loven (TierSchG BGBl. JEG S 1105; 25.05.1998) og ble godkjent av lavere Sachsen komité for etikk av dyr eksperimenter og staten kontoret (lavere Niedersachsen State Office of Consumer Protection og Food Safety), arbeidstillatelse nummer 33,4-42502-04-13/1281 og 162280.

1. CFSE farging av OT-jeg T celler og adopsjon overføring

Merk: OT-jeg mus er transgenically generert dyr som uttrykker en T-celle reseptor (TCR) med fast α og β kjeder som sammen gjenkjenner immuno-dominante peptid av OVA, SIINFEKL10,11. Som et resultat, disse musene har et stor antall SIINFEKL-spesifikke CD8+ T celler (97%)12 sammenlignet med normal eller OVA-vaksinert mus (≤ 1%)13.

  1. Isolering av sporbar CD8+ T celler fra OT-jeg mus uttrykke allelet T lymfocytt-spesifikke Thy1en (Thy1.1):
    1. Euthanize 6-9 uker gamle OT-jeg mus ved CO2 innånding etterfulgt av cervical forvridning14. Dissekere milten og store lymfeknuter (inguinal, aksillær og cervical par bare) ved å kutte huden med kirurgisk saks, frakobling huden fra kroppen ved hjelp av kirurgiske tang og tang og plassere dem i Petri retter (60 x 15 mm) hver inneholder en 100 µm pore mesh cup vev sliping og celle utgivelsen.
    2. Opprettholde petri retter (hver med ett nett cup) i 3-5 mL av komplett RPMI medium (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 U/mL penicillin, 50 µg/mL streptomycin) holdt på is.
    3. Bland organer ved hjelp av en sprøytestempelet eller et lignende sterilt instrument (tidligere kutte er ikke nødvendig) og samle resulterende enkeltcelle suspensjon i 15 mL sentrifuge rør.
    4. Sentrifuge celle suspensjon på 300 x g i 10 min på 4 ° C. Kast nedbryting. Vask cellene i 10 mL kaldt PBS med sentrifugering og lyse erytrocytter fra milten av nytt suspendere pellet i 1 mL/milt salmiakk bufferen (ACK buffer, kommersielt tilgjengelig). Inkuber celler for 1,5 min på is og deretter vaske cellene med 10 mL kaldt PBS med sentrifugering (som gjort før).
    5. Å avbryte pellet samme rør i 1 mL av PBS (pH 7.2) inneholder 5% fosterets bovin serum magnetiske isolering.
  2. For å utføre magnetiske isolasjon, videre til negative valg av CD8+ T celler ved hjelp av et magnetisk isolering kit instruerte produsenten eller publisert protokoller15.
  3. For å utføre CFSE flekker, først telle antall CD8+ T celler Hentet fra OT-jeg mus ved hjelp av en automatisert celle teller (partikkel counter). Flekk 1-5 x 107 celler/mL i et volum på 1-5 mL med 5 µM CFSE i PBS i 7 min ved 37 ° C, beskyttet fra lys i et 15-ml falcon rør.
  4. Slukke den CFSE flekker ved å legge til den samme mengden (1:1) fetal bovin serum cellene og ruge dem i flere 7 min på 37 ° C beskyttet mot lyset. Vask cellene med 10 mL PBS to ganger.
  5. Telle celler ved hjelp av en automatisert celle teller. Angir cellen til 3-5 x 107 celler/mL av PBS for å injisere 3-5 x 106 celler/mus i 100 µL intravenøst (IV) via hale venen.
  6. For å utføre hale blodåre injeksjoner, nakkens musene i riktig restrainers. Varm tilbake området og hale av mus skal injiseres ved hjelp av en røde lys lampe, plassert mellom 20 til 25 cm fra mus i 1-3 min tillate hale blodåre vasodilatasjon.
    Merk: Dette bidrar til å lette blodåre gjenkjenning og administrasjon av cellen suspensjon.
  7. Sikre (med hånden plassert mellom mus og lampen) at det ikke er for varmt for mus og når hale årer er synlig, gå til injeksjon. Injisere cellene til lateral eller dorsal hale venen en 1mL sprøyte med en 25-gauge p16.

2. immunisering (Endo-fri OVA +/-Adjuvant)

  1. Plasser musene transplantert med OT-jeg celler (trinn 1.7, figur 1) i en bedøvelse kammer og administrere isoflurane i oksygen ved en bedøvelse maskin14.
  2. Når musen er helt sover under narkose, ta den ut av kammeret og barbere pelsen av musen på området over gluteus superficialis (lateral korsryggen) ved hjelp av en elektrisk hår trimmer maskin, for å utføre en ren injeksjon med en god visning av modulen.
  3. Sette inn 50 µL av vaksine, SC i barberte området bruker en 25-gauge nål.

3. isolering av lymfocytter og flekker for flyt cytometri analyse

  1. Isolering av lymfocytter og splenocytes
    1. Euthanize vaksinert mus ved CO2 innånding etterfulgt av cervical forvridning.
    2. Ekstra drenering og fjerne lymfeknuter og milt og plassere i separate Petri retter som inneholder 100 µm pore mesh kopper for vev sliping og celle utgivelse. Fremgangsmåten 1.1.2 gjennom 1.1.3.
    3. Dekanter nedbryting etter sentrifugering og å suspendere celle pellets i samme volum av rest PBS (ca. 100 µL).
  2. Flekker for flyt cytometri analyse
    1. Dermed gir en 2 x konsentrert flekker blanding i en 15-mL sentrifuge tube forbereder en mester blanding som inneholder flekker antistoffer i konsentrasjoner i tabell 1. Forberede nok volum master Mix å ha 100 µL per prøve. Bland cellene og master mix 1:1 og ruge det på 4° C i 30 min.
      Merk: Det siste flekker volumet per prøve skal 200 µL (100 µL av cellen pellet 100 µL av antistoff master mix).
    2. Vask cellene to ganger av sentrifugering som beskrevet i 1.1.3, legge 10 mL PBS, to ganger.
    3. Nytt suspendere farget cellene i 0,5-1 mL PBS for oppkjøp og overføring suspensjon til flyt cytometer rør. Alltid holde prøvene på is og beskyttet mot lyset.

4. flowcytometri

  1. Alltid pre-filter celle prøvene med 70-100 µm filtre.
  2. Forberede enkelt flekker kompensasjon kontroller fluorophores i tabell 1 (perler eller celler).
    Merk: Kompensasjon bør utføres i cytometer eller analyse programvare17,18,19 og brukes på alle prøvene.
  3. Følg gating strategien avbildet i figur 2. Kort, gate populasjoner i fremover scatter høyde vs frem scatter området (figur 2A), og siden scatter bredt vs siden scatter området (SSA, figur 2B) for å utelukke doublets.
  4. Gate befolkningen fra figur 2B ved å plotte BV 650 (auto-fluorescens) vs FITC (CFSE) for å skille ekte CFSE farget celler fra høy auto-fluorescerende celler. Inkluder perler eller celler med antistoff konjugert til BV 650 i kompensasjon kontroller. Denne handlingen (figur 2C) i BV 650 vs FITC brukes til gate OT-jeg CFSE farget celler.
  5. Gate befolkningen fra figur 2 C for Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs APC (CD8) for å skille cellene stammer fra giver og mottaker mus.
    Merk: Celler avledet fra OT-jeg donoren mus er Thy1.1+ (CD90.1), mens WT (C57BL/6, mottaker) mus-avledet celler Thy1.2+ (CD90.2) (figur 2D). Noen laboratorier har OT-jeg mus Thy1.2 bakgrunn og WT (C57BL/6) i en Thy1.1. I dette tilfellet må du bruke et antistoff mot Thy1.2 for OT-jeg celle gating.
  6. Nytt gate CD8+ celler fra Thy1.1+ befolkningen ved å plotte det på en gate med BV 450 (CD4) vs APC (CD8) (figur 2E).
  7. Vise befolkningen gated i figur 2E ved hjelp av en histogramvisningen av CD8+ celler viser CFSE (FITC, 530/15 kanal - blå laser-), gate proliferated befolkningen ved å inkludere intensiteter 102 opp der udelt kontroll befolkningen er (intensiteter ~ 105, avhengig av effekten av den CFSE flekker og Spenningsinnstillingen flyt-cytometer) (figur 2F).
  8. Gjør en ekstra gate (ikke vist i figur 2) inntegningsrekkefølgen FITC vs L/D markør (450/20 kanal, UV laser) for å vurdere døde celler parallelt til spredning evalueringen.
  9. Få minst 5000 hendelser for kompensasjon kontrollene og 10.000 hendelser (gate E, figur 2) fra prøvene på en flyt cytometer. Kjøre cytometer ved lav eller middels flyt (ikke overskrider strømningshastigheter 20.000 hendelser/s).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å teste behandlinger bruker en annen kombinasjon av adjuvans (ADJ1 og ADJ2), har vi vurdert CTL generasjon kapasitet ved å måle spredning av adoptively overførte OT-jeg CD8+ T celler av flowcytometri (figur 2). For dette farget vi tidligere isolert celler fra drenering lymfeknuter og milt (tabell 1). Ved å måle spredning CD8+ T celler i lymfeknuter og milt, kunne vi bekrefte en høyere CTL generasjon kapasitet på ADJ2 i drenering lymfeknuter (Figur 3) i forhold til ADJ1, OVA alene eller PBS kontroll. I kontrast, vi har observert at ADJ2 kunne ikke generere CTL svar i en systemisk kupé (milt), mens ADJ1 var viser høye nivåer av spredning av splenic CD8+ T celler, ikke bare sammenlignet med kontrollene (PBS og OVA) men også overlegen til ADJ1. Av dissecting handlingen av ADJ2 denne rask i vivo spredning analysen, kan vi bekrefte sin sterk handling som et lokalt, men ikke en systemisk CTL generator. Videre ADJ1 fungerer både på det lokale området av injeksjon (drenering lymfeknuter) så vel som systematisk med en økt OT-jeg spredning i milten. Innhentet resultatene tillate oss å karakterisere den adjuvant aktivitet og utstrekning, eksemplifisert ved observert effekten av ADJ2 (lokal) og ADJ1 (systemisk).

Figure 1
Figur 1: analysen tidslinjen. Analysen tidslinjen representerer den første OT-jeg T celle overføre på dag 0, SC vaksinasjon på dag 1, og prøvetaking milten og drenering lymfeknuter 2 dager senere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: flyt diagram av gating strategien fulgte for å måle spredning CD8+ T celler (OT-jeg Thy1.1+) av flowcytometri. To eksempler er representert i forskjellige farger (rød og lys blå) for en bedre visualisering. AB. Enkeltceller er diskriminert fra doublets suksessivt i to første portene ved å plotte fremover-XY-høyde vs fremover-XY-området og side-XY-bredde vs side-XY-området. C. celler gated i B vises som deres fluorescens intensiteter av BV 650 kanal (auto fluorescens) plottet mot CFSE intensitet (hvor diming angir celler divisjoner/spredning) i 530/30 YG kanalen. Denne porten tillater valg av sanne CFSE positive celler av diskriminerende som har høy auto fluorescens. D. CFSE positive celler var gated med høy fluorescens intensitet av Pe-Cy7 (Thy1.1, markør for OT-jeg celler) vs APC intensitet (CD8). E. BV 450 (CD4) plottet mot APC (CD8) for tidligere gated Thy1.1 positive celler for å velge nøyaktig CD8+ T celler. F. tidligere gated CD8+ celler tegnes i et histogram mot CFSE intensiteten endelig gate proliferated befolkningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Adjuvant drevet CTL generasjon. Muligheten til å lokke fram lokale eller systemisk CTL svar er avbildet for 2 forskjellige adjuvant behandlinger (ADJ1 og ADJ2) langs antigen og PBS kontroller. Spredning av adoptively overførte OT-jeg T celler er undersøkt i drenering lymfeknute (lysken, for eksemplifisert subcutaneous (SC) administrasjonen) og milten, som vist i figur radene. Celle spredning måles i alle relevante behandlinger (kolonner) for å nøyaktig sammenligne omfanget av immunrespons i lokale (drenering lymph node) eller systemisk (milt) rekke handling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fargestoffer - antistoffer Klone Fluorophore/kanal-filter Konsentrasjon 2 X
Thy1.1 (CD90.1) HIS51 PE-Cy7-780/60 YG 1:750
CD8 53-6,7 APC - 670/14 R 1:280
CD4 RM4-5 BV 421-450/50 V 1: 100
CFSE - FITC - 530/30 YG (ifølge CFSE flekker protokollen)
DCM (død celle markør) - -/ UV - 450/50 UV 1:500

Tabell 1: antistoff stainings for flowcytometri. Fluorophore-konjugerte antistoffer kloner og anbefalt flekker konsentrasjoner (2 x).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Moderne vaksiner er ideelt composedof renset antigen og adjuvans, med mulig tillegg av en levering system som liposomer, virus-lignende partikler, nanopartikler eller live vektorer. Et viktig aspekt når du utformer en vaksine er å velge riktig adjuvant etter kliniske behov. Del av omfanget kan omfatte favoriserer en humoral mot mobilnettet immunforsvaret (eller begge), valget av en lokal vs en systemisk immunrespons (eller begge) og typen minne som vaksinen må generere i målgruppen. Et viktig aspekt av adjuvant evaluering er å raskt bestemme sin evne til å generere CTL. Vi presentert her en metode basert på allerede kjente teknikker, raskt fastslå funksjonene for Sertifikatklareringslisten svar vivo i en musemodell ved å måle OT-jeg CD8 T celle spredning. Denne metoden gir prediksjon av styrken av immunrespons brakt frem av adjuvans (spredning av OT-jeg T celler) i bare 4 virkedager. Denne metoden ytterligere forenkler sammenligningen av handlingene til adjuvans i immunforsvaret (lokal vs systemisk) og den effektive tiltak. Her har vi viste et eksempel på hvordan immunisering med forskjellige adjuvant behandlinger (ADJ1 vs. ADJ2) vil påvirke immunrespons. Handlingen av ADJ2 var begrenset til området administrasjon der aktiverer immunrespons i drenering lymfeknuter, mens handlingen av ADJ1 med den samme dosen var mer utbredt, generere en CTL reaksjon både på det lokale og systemisk nivå men med mindre styrke enn ADJ2 i drenering lymfeknuter.

Kritiske for vellykket vurdering av en adjuvant CTL kapasitet er valg av unge OT-jeg dyr (som en kilde til CD8 T celler) og bruk av endotoxin-fri OVA for immunisering. Siden OT-jeg mus er transgene dyr generert for å produsere CD8 T-celler gjenkjenner OVA peptid SIINFEKL i en MHC-jeg sammenheng, sin kunstig valget av musen TCR øker opptredener av hyper proliferativ CD8+ T celler20 med alderen. En betennelse i axillaris lymfeknuter er dermed mer vanlig i alderen gamle Testamente-jeg mus. Tar dette i betraktning, er det anbefalt å bruke unge OT-jeg dyr når det er mulig (6-9-uke-gamle dyr) og å unngå å isolere celler fra en forstørret organer (enten milten av lymph noder). Bruk av forstørret organer med voksende CD8 T-celler vil påvirke hele analysen siden mest sannsynlig forskjeller i spredning mellom kontroller og behandlinger ikke oppnås. En lignende fallgruve for diskriminering av adjuvant CTL generasjon kapasitet kan genereres ved hjelp av OVA protein med spor av endotoxin, som kan lokke fram en mer potent immun respons i forhold til endotoxin-fri OVA21,22 (se Materialer og reagenser), siden endotoxins er sterk immuno-modulatorer sådan 23. Derfor må OVA protein brukes for immunisering endotoxin-fri. Bruk av 20 eller 50 µg av endotoxin-fri OVA avhenger av immunisering ruten blir 50 µg en passende dose for subcutaneous testing av adjuvans. I tillegg, bruk av CFSE er rapportert i litteraturen å drepe de fargede celler24 og kan også føre til svikt i analysen.

Noen endringer eller forbedringer til forskjellige teknikkene som brukes i protokollen ble gjennomført for å redusere stress av dyrene, øke reproduserbarhet av eksperimenter. For eksempel relatert å minimere oppvarming av dyr ved å bare varme ryggen og halen av mus og ikke hele dyret, eller å unngå injeksjon stress av anesthetizing dyrene før vaksinasjonen. Anestesi er ikke nødvendig av dyrevelferd regler for en subcutaneous injeksjon men i vår erfaring, det forbedrer reproduserbarhet ved å redusere variasjoner introdusert av stressrespons.

En stor begrensning av denne metoden er at siden CFSE flekker membran av celler, svekker det vanligvis påvisning av signaler fra stoffer i dens høy lysstyrke. Derfor hvis bekreftelse av CTL kapasitet er nødvendig, bør utskillelsen av IFN-γ vurderes ved en bestemt sekresjon analysen 25, og ikke intracellulær cytokin flekker.

Bruk av måling av spredning å anslå produksjonsøkning CTL av adjuvans i bare 4 dager har fordelen av kortere tid nødvendig enn tradisjonelle CTL søk26 og det er en god potensielle eksperiment i tilfelle hvor ytterligere bekreftelse av andre metoder er nødvendig.

Selv om begrenset til OVA som et antigen, og derfor bruk av OT-jeg T celler, metoden presentert her gjør studier av egenskapene for aktivering indusert av ulike adjuvans etter sortering proliferated cellene. En av de mulige anvendelser er studiet av metabolske signaturene av ulike adjuvans i proliferated OT-jeg T celler og sine relasjoner med utviklingen av minne27. Flere andre visninger kan vurdere biologiske egenskapene til stimulert cellene, for eksempel følgende uttrykk av cytokiner, omfatter degranulering markører av flowcytometri eller cytotoksiske kapasiteten ved å utføre i vivo CTL tester8, 26 , 28. Siden dette programmet har begrensning av bruken i mus, kan fremskrivninger for mennesker utføres av utnytte screenings basert på humanized mus29,30,31.

Denne metoden er vi har presentert her robuste nok til å brukes som en første screening for valg av cellulær respons Aktivator og også fleksibelt nok til å endres eller koblet til videre analyse av de proliferated T-cellene. I sammendraget er denne rask i vivo vurderingen av adjuvant CTL generasjon kapasitet et ideelt verktøy for vaksine laboratorier i akademia og industri som er interessert i en rask karakterisering av modusen for handling av sine adjuvant kandidat molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi står i gjeld til våre tekniske assistenter: U. Bröder og H. Shkarlet, som hjalp oss under eksperimentelle prosedyrer. Dette arbeidet var delvis finansiert av EU tilskudd (UniVax, kontrakt nr. 601738 og TRANSVAC2, kontrakt nr. 730964) og en Helmholtz Association grant (HAI-IDR). Finansieringskilder ikke påvirke forskning design, generasjon av manuskriptet eller beslutning om å sende det til publikasjonen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD LSR Fortessa Cell Analyzer BD Special Order Flow Cytometer
CFSE Molecular Probes C34554 Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit Biolegend 480007 Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Molecular Probes L23105 Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 eBioscience 25-0900-82 antibody
APC anti-mouse CD8a Antibody BioLegend 100712 antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4 BD 740007 antibody
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer Beckman Coulter 9914591DA Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg) Hyglos(Germany) 321000 Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylon Corning 352360 Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample Vials Beckman Coulter 899366014 Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2) Harlan (Rossdorf, Germany) Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) Harlan (Rossdorf, Germany) Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubes Fischer (Corning) 14-959-5 Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubes Fischer (Corning) 05-527-90 Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL) Fischer (Gibco) 20-012-027 Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp) Dirk Rossmann GmbH (Germany) 405096 Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane) Abbott Laboratories (USA) 5260.04-05. Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber Parkland Scientific V3000PK Isoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 medium Gibco (distributed by ThermoFischer) 11-875-093 Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 15-140-148 Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 10082147 Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml) Gibco (distributed by ThermoFischer) A1049201 Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri Dishes Nunc (distributed by ThermoFischer) 150340 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump Filter CellTrics (Sysmex) 04-004-2317 CellTrics® 50 μm, sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
  2. Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
  3. Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
  4. Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
  5. Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
  6. Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
  7. Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
  8. Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
  9. Ebensen, T., et al. Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
  10. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  11. Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
  12. Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
  13. Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
  14. Otto, K. The Laboratory Mouse. Bullock, G. Academic Press. 555-569 (2004).
  15. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (2016).
  16. Shimizu, S. The Laboratory Mouse. Bullock, G. Academic Press. 527-542 (2004).
  17. Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
  18. Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, Clifton, N.J. 109-134 (2012).
  19. Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
  20. Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
  21. Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
  22. Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. L54-L63 (2012).
  23. Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
  24. Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. 79-85 (2009).
  25. Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
  26. Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
  27. O'Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
  28. Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
  29. Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
  30. Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
  31. Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).
Rask <em>i Vivo</em> evaluering av adjuvants cytotoksiske T-lymfocytter generasjon evner for vaksineutvikling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lirussi, D., Ebensen, T., Schulze, K., Reinhard, E., Trittel, S., Riese, P., Prochnow, B., Guzmán, C. A. Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development. J. Vis. Exp. (136), e57401, doi:10.3791/57401 (2018).More

Lirussi, D., Ebensen, T., Schulze, K., Reinhard, E., Trittel, S., Riese, P., Prochnow, B., Guzmán, C. A. Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development. J. Vis. Exp. (136), e57401, doi:10.3791/57401 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter