Summary
Aquí presentamos una aplicación de una técnica inmunológica estándar (CFSE manchado OT-I proliferación) pretende monitorear rápidamente mediada por el adyuvante de linfocitos T citotóxicos (CTL) generación en vivo. Esta estimación rápida de la capacidad CTL es útil para el desarrollo de vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares así como vacunas contra el cáncer terapéutico.
Abstract
La evaluación de las vacunas de subunidad moderna revela que la generación de anticuerpos neutralizantes es importante pero no suficiente para la selección del adyuvante. Por lo tanto, están urgente adyuvantes con capacidades inmuno-estimuladora humorales y celulares que son capaces de promover respuestas citotóxicas de los linfocitos (CTL) T. Así, el fiel seguimiento de candidatos de adyuvante que inducen reactividad cruzada y posteriormente aumentar la generación de CTL representa un paso crucial en el desarrollo de una vacuna. Aquí presentamos una aplicación de un método que utiliza SIINFEKL específicos (OT-I) las células T para controlar la presentación cruzada del modelo antígeno ovoalbúmina (OVA) en vivo en la presencia de candidatos de diferentes adyuvantes. Este método representa una prueba rápida para seleccionar adyuvantes con las mejores capacidades de reactividad cruzada. La proliferación de CD8+ T las células es la más valiosa indicación de reactividad cruzada y también es considerado como un correlato de presentación cruzada inducida por adyuvante. Esta característica puede ser evaluada en diversos órganos inmunes como los ganglios linfáticos y el bazo. También puede supervisar el grado de la generación de CTL, que dando ideas sobre la naturaleza de un local (nodo de linfa de drenaje principalmente) o una respuesta sistémica (distante de los ganglios linfáticos o bazo). Esta técnica además permite múltiples modificaciones para probar fármacos que pueden inhibir vías específicas de presentación cruzada y también ofrece la posibilidad de ser utilizado en diferentes cepas de ratones modificados genéticamente y convencionales. En Resumen, la aplicación que presentamos aquí será útil para los laboratorios de la vacuna en la industria o la academia que desarrollaran o modificar químicos adyuvantes de la vacuna investigación y desarrollo.
Introduction
Los linfocitos T citotóxicos (CTL) que las vacunas son fundamentales intervenciones terapéuticas que se han desarrollado para luchar contra a ciertos tipos de cáncer1. También son importantes las vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares2CTL. Por otra parte, CTL son uno de los pocos mecanismos de defensa inmunes funcionalmente activos en poblaciones de riesgo como neonatos3,4 quien también dependen de CTL para luchar contra la temprana vida infecciones5. En este sentido, las vacunas contra el Virus sincitial respiratorio (VSR) que fueron desarrolladas con un adyuvante que no provocan respuestas CTL (alumbre) resultaron en un fracaso de la vacuna lleva a serias complicaciones con infecciones en recién nacidos6. Estos efectos negativos de la vacunación pueden invertirse por una CD8+ de respuesta de la célula de T7. Previamente hemos demostrado que las citoquinas principales (tipo interferones de I) sacadas por algún estimulador de agonistas (aguijón) los genes de interferón son esenciales para las respuestas CTL generadas por estos adyuvantes8, en parte por la medición de la proliferación de OT-I T las células después de la vacunación y usar estos resultados como una medida de CTL inducen las capacidades observadas en extendieron vacunación horarios9. La medición de la proliferación de OT-I CD8+ T las células en un ratón receptor de tipo salvaje (WT) C57BL/6 por carboxyfluorescein succinimidyl tinte de éster (CFSE) dilución es una estimación robusta de la capacidad de los adyuvantes de una vacuna para generar reactividad cruzada de SIINFEKL, (el péptido inmuno-dominante de ovoalbúmina, óvulos). Variaciones de esta técnica están ampliamente utilizadas para la evaluación de la proliferación de OT-I CD8+ y OT II CD4+ T las células. Por ejemplo, se ha utilizado en la ausencia de las citoquinas (ratones KO) o para medir la eficacia de la vacuna después de memoria del antígeno en animales de peso. Ideamos un protocolo corto (4 días experimento) en el que después de la transferencia pasiva de OT CFSE-manchado-I CD8 células+ T, una vacunación subcutánea de (s.c.) que consiste en una dosis de 50 μg de huevos libres de endotoxinas complementado con adyuvantes de la prueba se administra (Figura 1). El seguimiento de los resultados 48 horas después de la vacunación proporciona una prueba confiable de la capacidad de los adyuvantes para generar respuestas CTL. Por esta estrategia, es posible evaluar la potencia de la respuesta inmune local en el nodo de linfa de drenaje después de la inmunización, así como la magnitud de la respuesta mediante la medición de la actividad CTL en el bazo (o los ganglios linfáticos distantes).
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Protocol
Todos los ratones utilizados en este estudio fueron el fondo C57BL/6. Todos los animales se mantuvieron en condiciones libres de patógenos. Todos los experimentos fueron realizados según la normativa de la ley de protección animal alemán (TierSchG BGBl. S 1105; 25.05.1998) y fueron aprobados por el Comité de Sajonia inferior sobre la ética de los experimentos animales y la Oficina Estatal de baja Sajonia Estatal Oficina de protección al consumidor y seguridad alimentaria, bajo el permiso número 33.4-42502-04-13/1281 y 162280.
1. CFSE tinción de OT-I T las células y transferencia adoptiva
Nota: OT-los ratones son animales transgenically generados que expresan un receptor de célula T (TCR) con fijo α y β cadenas que reconocen a los péptidos inmuno-dominante de OVA, SIINFEKL10,11. Como resultado, estos ratones tienen un número considerablemente alto de CD8 específicas SIINFEKL+ T las células (97%)12 en comparación con ratones normales o vacunados de OVA (≤ 1%)13.
- Aislamiento de trazabilidad CD8+ T células de OT-los ratones que expresaban el linfocito T específico Thy1un (Thy1.1) alelo:
- Eutanasia de OT 6-9 semanas de edad-ratones por la inhalación de CO2 seguido por dislocación cervical14. Disecar el bazo y ganglios linfáticos principales (sólo pares inguinales, axilares y cervicales) cortando la piel con tijeras quirúrgicas, separar la piel del cuerpo con la ayuda de pinzas quirúrgicas y fórceps y colocar en cajas Petri (60 x 15 mm) cada uno con un 100 μm poro malla taza para lanzamiento de pulido y de la célula del tejido.
- Mantener platos de petri (cada uno con malla de una taza) en 3-5 mL de Medio RPMI completo (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 50 μg/mL) en hielo.
- Los órganos con la ayuda de un émbolo o un instrumento estéril similar el puré (corte previo no es necesario) y recoger la suspensión unicelular resultante en tubos de centrífuga de 15 mL.
- Centrifugue la suspensión de células a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante. Lavar las células en 10 mL de PBS frío mediante centrifugación y lisar los eritrocitos del bazo por volver a suspender el sedimento en 1 bazo mL de tampón de cloruro de amonio (tampón de ACK, comercialmente disponible). Incubar las células durante 1,5 min en hielo y posteriormente lavar las células con 10 mL de PBS frío por centrifugación (como antes).
- Vuelva a suspender el sedimento en el mismo tubo en 1 mL de PBS (pH 7.2) que contiene 5% suero bovino fetal de un aislamiento electromagnético.
- Para realizar el aislamiento magnético, proceder a la selección negativa de CD8+ T las células utilizando un kit de aislamiento magnético según las instrucciones del fabricante o publicado protocolos15.
- Para realizar la tinción de la CFSE, contar primero el número de CD8+ T las células obtienen de OT-I ratones utilizando un contador de células automatizado (contador de partículas). Mancha 1-5 x 107 células/mL en un volumen de 1 a 5 mL con 5 μm CFSE en PBS durante 7 minutos a 37 ° C, protegido de la luz en un tubo falcon de 15 ml.
- Sacian la CFSE tinción añadiendo el mismo volumen (1:1) de suero fetal bovino a las células e Incube por adicional 7 min a 37 ° C, protegido de la luz. Lavar las células con 10 mL de PBS dos veces.
- Contar las células usando un contador de células automatizado. Establecer el número de células al 3-5 x 107 células/mL de PBS para inyectar por vía intravenosa 3-5 x 106 células/ratón de 100 μl (i.v.) a través de la vena de la cola.
- Para realizar inyecciones de vena de la cola, inmovilizar los ratones en restrainers apropiados. Caliente la zona de la espalda y la cola de los ratones que se inyecta usando una lámpara de luz roja, entre 20 a 25 cm de los ratones por 1-3 min permitir la vasodilatación de la vena de la cola.
Nota: Esto ayuda a facilidad vena detección y administración de la suspensión de células. - Asegurar (con la mano colocada entre la lámpara y los ratones) que no es demasiado caliente para los ratones y cuando las venas de la cola son claramente visibles, proceder a la inyección. Inyectar las células en la vena lateral o dorsal de la cola utilizando una jeringa de 1mL con aguja de calibre 2516.
2. inmunización (Endo-libre OVA +/-adyuvante)
- Colocar los ratones transplantados con OT-I (paso 1.7, figura 1) de las células en una cámara de anestesia y administrar isoflurano en oxígeno por una máquina de anestesia14.
- Cuando el ratón está totalmente dormido bajo anestesia, sacar de la cámara y afeitarse la piel del ratón en el área sobre los superficialis de los glúteos (zona lumbar lateral) mediante el uso de una máquina de corte de pelo eléctrico, con el fin de realizar una inyección limpia con una buena vista de la zona de aplicación.
- Inyectar 50 μl de la vacuna, s.c. en el área depilado con una aguja de calibre 25.
3. aislamiento de linfocitos y de tinción para análisis de citometría de flujo
- Aislamiento de linfocitos y esplenocitos
- Eutanasia a los ratones vacunados por CO2 inhalación seguida por dislocación cervical.
- Extraer los ganglios linfáticos de drenaje y distantes y bazo y colocar en cajas Petri separadas que contienen 100 μm poro malla tazas para lanzamiento de pulido y de la célula del tejido. Siga los pasos de 1.1.2 a 1.1.3.
- Decantar el sobrenadante después de centrifugación y vuelva a suspender los pellets de células en el mismo volumen de PBS del remanente (aproximadamente 100 μL).
- Tinción para análisis de citometría de flujo
- En un tubo de centrífuga de 15 mL, prepare una mezcla principal que contiene los anticuerpos tinción en las concentraciones que se muestra en la tabla 1, así que rinde 2 x concentrado mezcla de tinción. Prepare suficiente volumen de mezcla principal a 100 μl por muestra. Mezcle las células y el maestro mezcla 1:1 e incubar a 4° C por 30 minutos.
Nota: El volumen final de la tinción por muestra debe 200 μl (100 μl de células pellet + 100 μl de la mezcla principal anticuerpo). - Lavan las células dos veces por centrifugación como se describe en 1.1.3, agregar 10 mL de PBS, dos veces.
- Resuspenda las células en 0.5-1 mL de PBS para la adquisición y transferencia de la suspensión a los tubos de citómetro de flujo. Siempre mantenga las muestras en hielo y protegidos de la luz.
- En un tubo de centrífuga de 15 mL, prepare una mezcla principal que contiene los anticuerpos tinción en las concentraciones que se muestra en la tabla 1, así que rinde 2 x concentrado mezcla de tinción. Prepare suficiente volumen de mezcla principal a 100 μl por muestra. Mezcle las células y el maestro mezcla 1:1 e incubar a 4° C por 30 minutos.
4. citometría de flujo
- Siempre prefiltro las muestras de células mediante filtros de 70-100 μm.
- Preparar solo tinción controles de compensación para los fluoróforos detallados en la tabla 1 (granos o células).
Nota: Compensación debe ser realizada en citómetro o análisis software17,18,19 y aplicada a todas las muestras. - Seguir la estrategia bloquea representada en la figura 2. Brevemente, poblaciones de la puerta en altura de dispersión hacia adelante frente a la zona de dispersión hacia adelante (figura 2A) y otra vez dispersión lateral amplia vs área de dispersión lateral (SSA, figura 2B) para excluir dobletes.
- Puerta de la población de figura 2B trazando BV 650 (auto-fluorescencia) vs FITC (CFSE) para discriminar la CFSE verdadero manchados células de células auto-fluorescente alta. Incluir granos o células teñidas con anticuerpos conjugados a 650 de BV en controles de compensación. Este diagrama (figura 2) de 650 BV vs FITC se utiliza para el OT de la puerta-me CFSE manchadas las células.
- Puerta de la población de figura 2 C Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs APC (CD8) para distinguir las células derivadas de donantes vs ratones receptores.
Nota: Células derivadas de OT-I ratones donantes son Thy1.1+ (CD90.1), mientras que WT (C57BL/6, destinatarias) ratones las células derivadas son Thy1.2+ (CD90.2) (Figura 2D). Algunos laboratorios tienen OT-I ratones en un fondo de Thy1.2 y WT (C57BL/6) en un Thy1.1. En este caso tienes que usar un anticuerpo contra Thy1.2 para OT-célula de control. - Volver a puerta CD8 de las células de población Thy1.1+ + trazando en una puerta que comprende 450 BV (CD4) y APC (CD8) (Figura 2E).
- Mostrar la población cerrada en Figura 2E mediante el uso de una pantalla de histograma de los CD8+ células mostrando CFSE (FITC, canal 530/15 - láser azul-), la puerta la población proliferada incluyendo intensidades de 102 hasta el nivel donde las poblaciones de control son (intensidades ~ 105, dependiendo de la eficacia de la tinción de CFSE y el ajuste de la tensión en el citómetro de flujo) (figura 2F).
- Hacer un puerta adicional (no se muestra en la figura 2) trazado marcador FITC vs L/D (450/20 canal, láser UV) con el fin de evaluar las células muertas en paralelo a la evaluación de la proliferación.
- Adquirir por lo menos 5000 eventos para los controles de compensación y 10,000 eventos (puerta E, figura 2) de las muestras en un citómetro de flujo. Ejecutar el citómetro de flujo de baja o media (no exceder las tasas de flujo de 20.000 eventos/s).
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Representative Results
Para probar los tratamientos utilizando una combinación diferente de los adyuvantes (ADJ1 y ADJ2), hemos evaluado la capacidad de generación de CTL midiendo la proliferación de OT eventualmente transferido-I CD8+ T las células mediante citometría de flujo (figura 2). Para esto, hemos manchado previamente células aisladas de los ganglios linfáticos y bazo (tabla 1) drenaje. Mediante la medición de la proliferación de CD8+ T las células en los ganglios linfáticos y bazo, hemos podido corroborar una mayor capacidad de generación de CTL de ADJ2 en los nodos de linfa de drenaje (figura 3) en comparación con ADJ1, OVA solo o control de PBS. Por el contrario, hemos observado que ADJ2 no fue capaz de generar una respuesta CTL en un compartimento sistémico (bazo), mientras que ADJ1 mostrando altos niveles de proliferación por CD8 esplénico+ T de las células, no sólo en comparación con los controles (PBS y OVA) pero también superior a ADJ1. Por la acción de ADJ2 mediante este ensayo de proliferación rápida en vivo de disección, podemos confirmar su acción fuerte como local pero no un generador CTL sistémico. Por otra parte, ADJ1 actúa tanto en el sitio local de la inyección (nodos de linfa de drenaje), así como sistémicamente con un OT mayor-la proliferación en el bazo. Los resultados obtenidos nos permiten caracterizar la actividad de adyuvante y su magnitud, ejemplificado por los efectos observados de ADJ2 (local) y ADJ1 (sistémica).
Figura 1: la línea de tiempo de ensayo. La línea de tiempo de ensayo representa el OT inicial-transfiero en el día 0, la vacunación de s.c. en día 1 y el bazo de muestreo y drenando a los ganglios linfáticos 2 días más adelante T cell. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama de flujo de la estrategia bloquea seguido para medir la proliferación de CD8+ T las células (OT-I, Thy1.1+) mediante citometría de flujo. Dos muestras se representan en diferentes colores (roja y luz azul) para una mejor visualización. A-B. Las células están discriminadas de Dobletes sucesivamente en las dos primeras puertas trazando hacia adelante-dispersión-altura vs zona de forward scatter y anchura de dispersión lateral vs área de dispersión lateral. C. células cerradas en B se muestran por sus intensidades de fluorescencia del canal 650 BV (fluorescencia de auto) conspiraron contra su intensidad CFSE (donde diming indica divisiones/proliferación de células) en el canal YG 530/30. Esta puerta permite la selección de verdaderas células positivas de la CFSE por discriminar aquellos que tienen fluorescencia alta auto. D. las células positivas de la CFSE fueron bloqueadas con su intensidad de fluorescencia alta de Cy7 Pe (Thy1.1, marcador para OT-células) vs su intensidad APC (CD8). E. BV 450 (CD4) conspiraron contra APC (CD8) para previamente cerrada Thy1.1 las células positivas para seleccionar con precisión CD8+ T las células. F. terreno previamente CD8+ células se representan gráficamente en un histograma contra la intensidad de la CFSE para finalmente la puerta la población proliferada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: adyuvante impulsado por la generación de CTL. La capacidad de provocar respuestas CTL locales o sistémicas es representada por 2 tratamientos de diferentes adyuvantes (ADJ1 y ADJ2) a lo largo de antígeno y los controles de PBS. La proliferación de la OT eventualmente transferido-I T las células es examinado en el drenaje del nodo de linfa (inguinal, para el ejemplo vía subcutánea (s.c.)) y en el bazo, como se indica en las filas de la figura. La proliferación de célula se mide en todos los tratamientos (columnas) con el fin de comparar con precisión la magnitud de la respuesta inmune en su local (drenaje ganglionar) o sistémica (bazo) rango de acción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tintes - anticuerpos | Clon | Fluoróforo/canal-filtro | Concentración de 2 X |
| Thy1.1 (CD90.1) | HIS51 | PE-Cy7 - YG 780/60 | 1:750 |
| CD8 | 53-6.7 | APC - 670/14 R | 1:280 |
| CD4 | RM4-5 | BV 421-450/50 V | 1: 100 |
| CFSE | - | FITC - 530/30 YG | (según protocolo de tinción de CFSE) |
| DCM (muerto marcador de célula) | - | -/ U.V. - 450/50 UV | 1: 500 |
Tabla 1: los stainings anticuerpos para citometría de flujo. Anticuerpo conjugado con fluoróforo clones utilizan y recomiendan concentraciones (2 x) la coloración.
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Discussion
Las vacunas modernas son idealmente composedof antígeno purificado y adyuvantes, con la posible adición de un sistema de entrega como liposomas, virus-como partículas, nanopartículas o vectores vivos. Un aspecto clave en el diseño de una vacuna es elegir el adyuvante adecuado según las necesidades clínicas. Parte del ámbito podría implicar favoreciendo una humoral y respuesta inmune celular (o ambos), la elección de un local frente a una respuesta inmune sistémica (o ambos) y el tipo de memoria que la vacuna debe generar en la población objetivo. Un aspecto crucial de la evaluación adyuvante debe determinar rápidamente su capacidad para generar CTL. Aquí presentamos un método basado en técnicas ya conocidas, para determinar rápidamente las características de la CTL respuesta en vivo en un modelo de ratón mediante la medición de OT-I CD8 T proliferación de la célula. Este método permite la predicción de la potencia de la respuesta inmune provocada por adyuvantes (proliferación de OT-I T las células) en sólo 4 días laborables. Este método además facilita la comparación de las acciones de los adyuvantes en la respuesta inmune (local y sistémica) y su acción efectiva. Aquí, hemos mostramos un ejemplo sobre cómo la inmunización con tratamientos de diferentes adyuvantes (ADJ1 vs ADJ2) va a afectar la respuesta inmune. La acción de ADJ2 fue restringida a la zona de administración donde activa la respuesta inmune en los ganglios de drenaje, mientras que la acción de ADJ1 con la misma dosis fue más amplia, generando una respuesta CTL en el pero de nivel local y sistémico con menos potencia que ADJ2 en los nódulos linfáticos drenantes.
Pasos críticos para la evaluación acertada de CTL capacidad de un adyuvante son la elección del joven OT-animales (como una fuente de linfocitos t CD8) y el uso de huevos libres de endotoxinas para la inmunización. Desde OT-los ratones son animales transgénicos generados para producir células T CD8 que reconocen péptidos de OVA SIINFEKL en un MHC-I contexto, su selección artificial del ratón TCR aumenta las apariciones de hyper CD8 proliferativa+ T las células20 con la edad. Una inflamación de los ganglios linfáticos axilares es así una característica más común de OT-I ratones. Teniendo esto en cuenta, es aconsejable utilizar OT joven-los animales siempre que sea posible (animales de 6-9 semanas de edad) y evitar el aislamiento de las células de cualquier agrandamiento de órganos (o bazo de los ganglios linfáticos). El uso de órganos agrandados con proliferación de las células T CD8 afectará el ensayo entero puesto que no se obtendrán probablemente diferencias en proliferación entre controles y tratamientos. Una trampa similar para la discriminación de capacidad de generación de CTL adyuvante podría generarse mediante el uso de proteína de los huevos con los rastros de la endotoxina, que puede provocar una respuesta inmunológica más potente en comparación con el de21,OVA22 con libre de endotoxinas (véase Materiales y reactivos), ya que las endotoxinas son inmuno-moduladores fuerte por sí 23. Por lo tanto, la proteína de huevos utilizada para la inmunización debe estar libre de endotoxinas. El uso de 20 o 50 μg de huevos libres de endotoxinas depende de la ruta de inmunización que 50 μg una dosis conveniente para la prueba subcutánea de adyuvantes. Además, el uso de altas concentraciones de CFSE se ha divulgado en la literatura para matar las células24 y también podría resultar en el fracaso del ensayo.
Se implementaron algunas modificaciones o mejoras en las diferentes técnicas utilizadas en el protocolo con el fin de reducir el estrés de los animales, para aumentar la reproducibilidad de los experimentos. Por ejemplo, para minimizar el calentamiento de animales calentando sólo la espalda y la cola de los ratones y no el animal entero, o para evitar la inyección subcutánea relacionada con estrés por anestesiar a los animales antes de la vacunación. La anestesia no es requerido por las normas de bienestar animal para una inyección subcutánea, pero en nuestra experiencia, mejora la reproducibilidad por disminuir las variaciones introducidas por la respuesta de estrés.
Una gran limitación de este método es que puesto que la membrana de las células de las manchas de la CFSE, su alto brillo generalmente impide la detección de señales desde el citosol. Por lo tanto, si es necesario la confirmación de la capacidad CTL, la secreción de IFN-γ debe ser evaluada por un análisis de secreción específica 25y no por tinción intracelular citoquinas.
El uso de la medición de la proliferación para estimar la capacidad de generación de CTL por adyuvantes en sólo 4 días tiene la ventaja de un tiempo más corto necesario que CTL tradicional ensayos26 y es una buena prospectiva experimentar en el caso donde más es necesario confirmación por otros métodos.
Aunque restringido a la OVA como un antígeno y por lo tanto el uso de OT-I T de las células, el método presentado aquí permite el estudio de las propiedades de la activación inducida por diferentes adyuvantes después de la clasificación de las células proliferadas. Una de las posibles aplicaciones es el estudio de las firmas metabólicas inducida por diferentes adyuvantes en el OT proliferado-I T las células y sus relaciones con el desarrollo de la memoria27. Exámenes secundarios adicionales podrían evaluar las propiedades biológicas de las células estimuladas, como la expresión de citoquinas o marcadores de degranulación por citometría de flujo o su capacidad citotóxica mediante la realización de CTL en vivo pruebas8, 26 , 28. Puesto que esta aplicación tiene la limitación de su uso en ratones, se pueden realizar extrapolaciones a los seres humanos por explotación proyecciones basado en ratones humanizados29,30,31.
Este método que hemos presentado aquí es lo suficientemente robusto para ser utilizado como una primera proyección para la selección de activadores de la respuesta celular y también lo suficientemente flexible como para ser modificado o acoplada a análisis adicional de las células proliferadas de T. En Resumen, esta rápida evaluación in vivo de capacidad de generación de CTL adyuvante es una herramienta ideal para los laboratorios de la vacuna en academia e industria que están interesados en una rápida caracterización del modo de acción de sus moléculas de candidato coadyuvante.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Estamos agradecidos a nuestros asistentes técnicos: Bröder U. y H. Shkarlet, que nos ayudaron durante procedimientos experimentales. Este trabajo fue financiado en parte por convocatoria (UniVax, contrato no. 601738 y TRANSVAC2, contratación Nº 730964) y una donación de la Asociación Helmholtz (HAI-IDR). Las fuentes de financiación no influyó en la investigación de diseño, generación del manuscrito o la decisión de presentar para su publicación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
| CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
| APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
| BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
| Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
| EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
| Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
| Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
| C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
| OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
| FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
| Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
| PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
| Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
| Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
| RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
| Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
| Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
| Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |
References
- Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
- Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
- Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
- Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
- Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
- Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
- Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
- Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
- Ebensen, T., et al. Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
- Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
- Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
- Otto, K. The Laboratory Mouse. Bullock, G. , Academic Press. 555-569 (2004).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).
- Shimizu, S. The Laboratory Mouse. Bullock, G. , Academic Press. 527-542 (2004).
- Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
- Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, Clifton, N.J. 109-134 (2012).
- Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
- Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
- Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
- Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
- Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. , 79-85 (2009).
- Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
- Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
- O'Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
- Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
- Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
- Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
- Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).
