Summary
हम यहां एक मानक प्रतिरक्षा तकनीक (CFSE सना हुआ OT-I प्रसार) के लिए एक आवेदन पेश करने के लिए तेजी से सहायक मध्यस्थता साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट (CTL) vivo में पीढ़ी की निगरानी करने का इरादा । CTL क्षमताओं का यह तेजी से आकलन intracellular रोगजनकों के साथ ही चिकित्सीय कैंसर के टीके के खिलाफ नियत्रंण टीकों के विकास के लिए उपयोगी है ।
Abstract
आधुनिक उप इकाई टीके के आकलन से पता चलता है कि एंटीबॉडी को बेअसर करने की पीढ़ी महत्वपूर्ण है लेकिन सहायक चयन के लिए पर्याप्त नहीं है । इसलिए, adjuvants दोनों विनोदी और सेलुलर इंयूनो-stimulatory क्षमताओं है कि साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (CTL) प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने में सक्षम है के साथ तत्काल जरूरत है । इस प्रकार, सहायक उंमीदवारों की वफादार निगरानी कि पार भड़काने प्रेरित और बाद में CTL पीढ़ी बढ़ाने के टीके के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है । यहां हम में एक विधि है कि SIINFEKL-विशिष्ट (OT-I) टी कोशिकाओं का उपयोग करता है के लिए एक आवेदन प्रस्तुत मॉडल प्रतिजन ovalbumin (ओवा) के पार प्रस्तुति की निगरानी के लिए vivo में अलग सहायक उंमीदवारों की उपस्थिति में । इस विधि का सबसे अच्छा क्रॉस-भड़काना क्षमताओं के साथ adjuvants का चयन करने के लिए एक तेजी से परीक्षण का प्रतिनिधित्व करता है । सीडी 8+ टी कोशिकाओं के प्रसार क्रॉस भड़काना का सबसे मूल्यवान संकेत है और यह भी सहायक के सहसंबंधी के रूप में माना जाता है पार-प्रस्तुति । यह सुविधा लिम्फ नोड्स और तिल्ली की तरह अलग प्रतिरक्षा अंगों में मूल्यांकन किया जा सकता है । CTL पीढ़ी की सीमा पर भी नजर रखी जा सकती है, जिससे एक स्थानीय (लिम्फ नोड को मुख्य रूप से draining) या प्रणालीगत प्रतिक्रिया (दूर लिम्फ नोड्स और/या तिल्ली) की प्रकृति पर अंतर्दृष्टि दे । इस तकनीक आगे दवाओं है कि विशिष्ट पार प्रस्तुति रास्ते को बाधित कर सकते है और भी संभावना प्रदान करता है पारंपरिक और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के विभिंन उपभेदों में इस्तेमाल किया जा परीक्षण के लिए कई संशोधनों की अनुमति देता है । संक्षेप में, आवेदन है कि हम यहां वर्तमान उद्योग या शिक्षा में वैक्सीन प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी है कि विकसित या वैक्सीन अनुसंधान और विकास के लिए रासायनिक adjuvants को संशोधित किया जाएगा ।
Introduction
साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (CTL) टीके उत्प्रेरण प्रमुख चिकित्सीय हस्तक्षेप है कि1कैंसर के कुछ प्रकार से लड़ने के लिए विकसित किया गया है । CTL भी intracellular रोगजनकों के खिलाफ नियत्रंण टीके के लिए महत्वपूर्ण है2। इसके अलावा, CTL कुछ प्रतिरक्षा रक्षा तंत्र में से एक है कार्यात्मक जोखिम आबादी में सक्रिय ऐसे नवजात शिशुओं के रूप में3,4 जिसे भी CTL पर निर्भर करने के लिए जल्दी जीवन संक्रमण5का मुकाबला । इस संबंध में, श्वसन Syncytial वायरस (RSV) है कि एक सहायक है कि CTL प्रतिक्रियाओं (फिटकिरी) में लाना नहीं है के साथ विकसित किया गया टीकों के खिलाफ टीके6शिशुओं में संक्रमण पर गंभीर जटिलताओं के लिए अग्रणी टीका की एक पूरी विफलता के परिणामस्वरूप । टीकाकरण के इन नकारात्मक प्रभाव एक सीडी 8+ टी सेल प्रतिक्रिया7द्वारा उलट जा सकता है । हम पहले दिखा दिया है कि मुख्य साइटोकिंस (प्रकार मैं interferons) इंटरफेरॉन जीन (स्टिंग) एगोनिस्ट के कुछ उत्तेजक द्वारा बटोरा CTL इन8adjuvants द्वारा उत्पंन प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक हैं, हिस्से में के प्रसार को मापने के द्वारा OT-मैं टीकाकरण के बाद टी कोशिकाओं और CTL उत्प्रेरण क्षमताओं का एक उपाय के रूप में इन परिणामों का उपयोग कर विस्तारित टीकाकरण कार्यक्रम9में मनाया । OT के प्रसार की माप-I सीडी 8+ टी कोशिकाओं में एक जंगली प्रकार (WT) C57BL/6 प्राप्तकर्ता माउस द्वारा carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) डाई कमजोर पड़ने एक वैक्सीन के सहायक की क्षमता का एक मजबूत अनुमान है पैदा करने के लिए SIINFEKL की क्रॉस-भड़काना, (इंयूनो-प्रमुख पेप्टाइड के ovalbumin, ओवा). इस तकनीक के रूपांतरों को व्यापक रूप से ot-I सीडी 8+ और ot-II CD4+ टी कोशिकाओं के प्रसार के आकलन के लिए उपयोग किया जाता है । उदाहरण के लिए, यह चयनित साइटोकिंस (KO चूहों) के अभाव में इस्तेमाल किया गया है या WT पशुओं में प्रतिजन याद करने के बाद वैक्सीन प्रभावकारिता को मापने के लिए । हम एक छोटे प्रोटोकॉल (4 दिन प्रयोग) में CFSE के निष्क्रिय हस्तांतरण के बाद-सना हुआ OT-मैं सीडी 8+ टी कोशिकाओं, एक चमड़े के नीचे (एस॰सी॰) प्रतिरक्षण के ५० µ जी की एक खुराक से मिलकर तैयार endotoxin-मुक्त ओवा परीक्षण के साथ पूरक adjuvants प्रशासित है (चित्रा १). परिणामों के अनुवर्ती ४८ ज टीकाकरण के बाद सहायक की क्षमता का एक विश्वसनीय सबूत प्रदान करता है CTL प्रतिक्रियाओं उत्पंन करते हैं । इस रणनीति के द्वारा, यह प्रतिरक्षण के बाद draining लिम्फ नोड में स्थानीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की शक्ति का आकलन करने के लिए संभव है के रूप में अच्छी तरह से तिल्ली (या दूर लिम्फ नोड्स) में CTL गतिविधि को मापने के द्वारा प्रतिक्रिया की हद तक.
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Protocol
इस अध्ययन में प्रयुक्त सभी चूहों C57BL/6 पृष्ठभूमि से थे । सभी जानवरों को रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत रखा गया था । सभी प्रयोगों का प्रदर्शन जर्मन पशु संरक्षण कानून (TierSchG BGBl के प्रामाणिक के अनुसार किया गया । I S ११०५; 25.05.1998) और निचली Saxony समिति द्वारा पशु प्रयोगों की नैतिकता और राज्य कार्यालय (उपभोक्ता संरक्षण और खाद्य सुरक्षा के निचले Saxony राज्य कार्यालय), के अंतर्गत परमिट संख्या 33.4-42502-04-13/1281 और १६२२८० को अनुमोदित किया गया.
1. OT के CFSE धुंधला-I T कोशिकाओं और दत्तक अंतरण
नोट: OT-I चूहों transgenically जनित पशु है कि एक टी कोशिका रिसेप्टर (फिक्स्ड α और β जंजीरों के साथ TCR) व्यक्त कर रहे हैं कि एक साथ इंयूनो-प्रमुख पेप्टाइड के ओवा, SIINFEKL10,11पहचान. नतीजतन, इन चूहों SIINFEKL-विशिष्ट सीडी 8+ टी कोशिकाओं की एक काफी उच्च संख्या है (९७%)12 जब सामान्य या ओवा टीका वाले चूहों की तुलना में (≤ 1%)13.
- स्ट्रेस सीडी 8+ टी कोशिकाओं के ओटी से अलगाव-मैं चूहों टी लिम्फोसाइट-विशिष्ट Thy1एक (तेरा 1.1) एलील व्यक्त:
- Euthanize 6-9 सप्ताह पुराना OT-मैं चूहों सह द्वारा2 साँस लेना ग्रीवा14के बाद । काटना तिल्ली और प्रमुख लिम्फ नोड्स (वंक्षण, कांख और ग्रीवा जोड़े केवल) सर्जिकल कैंची के साथ त्वचा को काटने के द्वारा, शल्य चिमटा और संदंश की मदद से शरीर से त्वचा को अलग करने और उन्हें पेट्री व्यंजन में जगह (६० x 15 मिमी) प्रत्येक युक्त एक ऊतक पीस और सेल रिलीज के लिए १०० µm ताकना मेष कप ।
- पेट्री व्यंजन को बनाए रखें (एक मेष कप के साथ प्रत्येक) 3-5 मिलीलीटर में पूरा RPMI मध्यम (RPMI १६४०, 10% वी/वी FCS, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, ५० µ g/ml streptomycin) बर्फ पर रखा ।
- एक सिरिंज गोताख़ोर या एक समान बाँझ साधन की मदद से अंगों मैश (पहले काटने की जरूरत नहीं है) और 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में परिणामी एकल सेल निलंबन इकट्ठा ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें । ठंड पंजाबियों की 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को धो केंद्रापसारक द्वारा और तिल्ली से एरिथ्रोसाइट्स लाइसे फिर से 1 मिलीलीटर में गोली सस्पैंड/अमोनियम क्लोराइड बफर की तिल्ली (ले बफर, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध) । बर्फ पर १.५ मिनट के लिए कोशिकाओं मशीन और बाद में केंद्रापसारक द्वारा ठंड पंजाबियों की 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो (जैसा कि पहले किया) ।
- फिर से एक ही ट्यूब में 1 पंजाबियों की एमएल (पीएच ७.२) चुंबकीय अलगाव के लिए 5% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त गोली निलंबित ।
- चुंबकीय अलगाव प्रदर्शन करने के लिए, सीडी 8+ टी कोशिकाओं के नकारात्मक चयन करने के लिए निर्माता निर्देश या प्रकाशित प्रोटोकॉल15के अनुसार एक चुंबकीय आइसोलेशन किट का उपयोग करके आगे बढ़ें ।
- CFSE धुंधला प्रदर्शन करने के लिए, पहले एक स्वचालित सेल काउंटर (कण काउंटर) का उपयोग करके OT-I चूहों से प्राप्त सीडी 8+ टी कोशिकाओं की संख्या की गणना । दाग 1-5 x 107 सेल में/5 µ m CFSE के साथ पंजाबियों में 7 मिनट के लिए ३७ ° c, एक 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में प्रकाश से संरक्षित के साथ 1-5 मिलीलीटर की मात्रा में ।
- कोशिकाओं को भ्रूण गोजातीय सीरम की एक ही मात्रा (1:1) जोड़ने के द्वारा CFSE धुंधला बुझाना, और उन्हें ३७ प्रकाश से सुरक्षित डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 7 मिनट के लिए मशीन । दो बार पंजाबियों के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
- किसी स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की गणना करना. 3-5 x 107 कोशिकाओं के लिए कक्ष संख्या सेट करें/ए. ए. में 3-5 x 106 कोशिकाओं/माउस में १०० µ एल सुई (i.v.) पूंछ नस के माध्यम से ।
- पूंछ नस इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए, उचित निरोधकों में चूहों मैटीरियल । वापस क्षेत्र और चूहों की पूंछ एक लाल बत्ती लैंप का उपयोग करके इंजेक्ट किया जा करने के लिए गर्म, 1-3 मिनट के लिए चूहों से दूर के बीच 20 से 25 सेमी रखा पूंछ नस vasodilation की अनुमति के लिए ।
नोट: यह नस का पता लगाने और सेल निलंबन के प्रशासन को कम करने में मदद करता है । - सुनिश्चित करें (हाथ चूहों और दीपक के बीच में रखा के साथ) कि यह भी चूहों के लिए गर्म नहीं है और जब पूंछ नसों स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, इंजेक्शन के लिए आगे बढ़ें । एक 25 गेज सुई16के साथ एक 1mL सिरिंज का उपयोग पार्श्व या पृष्ठीय पूंछ नस में कोशिकाओं इंजेक्षन.
2. प्रतिरक्षण (इंडो-free ओवा +/-सहायक)
- ओटी के साथ प्रत्यारोपित चूहों प्लेस-मैं कोशिकाओं (चरण १.७, चित्रा 1) एक संज्ञाहरण चैंबर में और एक संज्ञाहरण मशीन द्वारा ऑक्सीजन में isoflurane प्रशासन14.
- जब माउस संज्ञाहरण के तहत पूरी तरह से सो रहा है, इसे बाहर ले चैंबर से और gluteus superficialis पर क्षेत्र पर माउस के फर दाढ़ी (पार्श्व पीठ के निचले हिस्से) एक बिजली के बाल trimming मशीन का उपयोग करके, के लिए एक साफ इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए अनुप्रयोग क्षेत्र का एक अच्छा दृश्य के साथ ।
- टीके के ५० µ एल सुई, एक 25 गेज सुई का उपयोग कर मुंडा क्षेत्र में एस॰सी॰.
3. लिम्फोसाइटों का अलगाव और प्रवाह Cytometry विश्लेषण के लिए धुंधला
- लिम्फोसाइटों और splenocytes का अलगाव
- Euthanize2 सह द्वारा टीका लगाया चूहों ग्रीवा विस्थापन के बाद साँस लेना ।
- draining और दूर लिम्फ नोड्स और तिल्ली निकालें और उन्हें अलग पेट्री ऊतक पीस और सेल रिलीज के लिए १०० µm ताकना मेष कप युक्त व्यंजन में जगह है । 1.1.3 के माध्यम से 1.1.2 कदम का पालन करें ।
- supernatant के बाद केंद्रापसारक और शेष पंजाबियों (लगभग १०० µ एल) की एक ही मात्रा में सेल छर्रों फिर से निलंबित कर सकते हैं ।
- प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए धुंधला
- एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में 1 तालिकामें चित्रित सांद्रता में धुंधला एंटीबॉडी युक्त एक मास्टर मिश्रण तैयार है, इस प्रकार एक 2x केंद्रित धुंधला मिश्रण उपज । नमूना प्रति १०० µ एल करने के लिए मास्टर मिश्रण की पर्याप्त मात्रा तैयार करें । मिश्रण कोशिकाओं और मास्टर मिश्रण 1:1 और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर यह मशीन ।
नोट: नमूना प्रति अंतिम धुंधला मात्रा २०० µ एल (१०० µ एल के सेल गोली + १०० µ एल के एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण) होना चाहिए । - 1.1.3 में वर्णित के रूप में दो बार कोशिकाओं को धोने, पंजाब के 10 मिलीलीटर, दो बार जोड़ने ।
- अधिग्रहण के लिए पंजाब के 0.5-1 मिलीलीटर में सना हुआ कोशिकाओं को फिर से निलंबित और निलंबन cytometer ट्यूबों प्रवाह के लिए स्थानांतरण । हमेशा बर्फ पर नमूने रखें और प्रकाश से संरक्षित ।
- एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में 1 तालिकामें चित्रित सांद्रता में धुंधला एंटीबॉडी युक्त एक मास्टर मिश्रण तैयार है, इस प्रकार एक 2x केंद्रित धुंधला मिश्रण उपज । नमूना प्रति १०० µ एल करने के लिए मास्टर मिश्रण की पर्याप्त मात्रा तैयार करें । मिश्रण कोशिकाओं और मास्टर मिश्रण 1:1 और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर यह मशीन ।
4. फ्लो Cytometry
- 70-100 µm फ़िल्टर्स का उपयोग करके कक्ष नमूनों को हमेशा पूर्व फ़िल्टर करें.
- तालिका 1 (मोतियों या कोशिकाओं) में विस्तृत fluorophores के लिए एकल धुंधला मुआवजा नियंत्रण तैयार करें ।
नोट: मुआवजा cytometer या विश्लेषण सॉफ्टवेयर17,18,19 में किया जाना चाहिए और सभी नमूनों के लिए लागू किया । - चित्र 2में दर्शाई गई गेटिंग कार्यनीति का अनुसरण करें. संक्षेप में, फॉरवर्ड छितरा ऊंचाई बनाम फॉरवर्ड तितर बितर क्षेत्र में गेट आबादी (चित्रा 2a), और फिर से साइड तितर बितर चौड़ा बनाम ओर तितर बितर क्षेत्र (SSA, चित्रा बी) क्रम में दोहरी को बाहर करने के लिए ।
- हाई ऑटो फ्लोरोसेंट कोशिकाओं से सच CFSE सना हुआ कोशिकाओं भेदभाव करने के क्रम में वी. बी. ६५० (ऑटो प्रतिदीप्ति) बनाम FITC (CFSE) प्लॉट करके चित्रा बी से आबादी गेट । मोतियों या कोशिकाओं को मुआवजा नियंत्रण में ६५० बी. वी. एंटीबॉडी संयुग्मित के साथ दाग शामिल हैं । बी. ए. ६५० बनाम FITC के इस भूखंड (चित्रा 2c) ओटी-I CFSE सना हुआ कोशिकाओं गेट करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
- गेट के लिए चित्रा 2c से जनसंख्या पीई के लिए-Cy7 (तेरा 1.1-सीडी 90.1-) बनाम APC (सीडी 8) के लिए कोशिकाओं दाता बनाम प्राप्तकर्ता चूहों से व्युत्पंन भेद करने के लिए ।
नोट: ओटी से व्युत्पंन कोशिकाओं-मैं दाता चूहों तेरा 1.1+ (सीडी 90.1) हैं, जबकि WT (C57BL/6, प्राप्तकर्ता) चूहों-व्युत्पंन कोशिकाओं तेरा 1.2+ (सीडी 90.2) (चित्रा 2 डी) हैं । कुछ प्रयोगशालाओं में तेरी 1.2 पृष्ठभूमि में ओटी-I चूहे हैं और WT (C57BL/6) तेरे 1.1 में है । इस मामले में आप के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग किया है तेरा 1.2 OT-मैं सेल गेटिंग के लिए । - पुन: गेट सीडी 8+ से तेरा 1.1+ कोशिकाओं को एक गेट पर साजिश रचने के द्वारा यह बी. वी. ४५० (CD4) बनाम APC (सीडी 8) (चित्रा 2E) शामिल है ।
- सीडी 8+ CFSE (FITC, 530/15 चैनल-ब्लू लेजर) दिखा कोशिकाओं के हिस्टोग्राम प्रदर्शन का उपयोग करके चित्रा 2E में जनसंख्या gated प्रदर्शन, गेट 10 स्तर तक2 से तीव्रता सहित द्वारा proliferated जनसंख्या जहां अविभाजित नियंत्रण आबादी है (तीव्रता ~ 105, CFSE धुंधला और प्रवाह cytometer पर वोल्टेज की स्थापना की प्रभावकारिता पर निर्भर करता है) (चित्रा 2F) ।
- एक अतिरिक्त (चित्र 2 में प्रदर्शित नहीं) गेट बनाओ FITC बनाम एल/डी मार्कर (450/20 चैनल, यूवी लेजर) की साजिश के लिए प्रसार मूल्यांकन के समांतर में मृत कोशिकाओं का आकलन करने के लिए ।
- मुआवजा नियंत्रण और १०.००० घटनाओं (गेट ई, चित्रा 2) के लिए एक प्रवाह cytometer पर नमूनों से कम से ५००० घटनाओं का अधिग्रहण । कम या मध्यम प्रवाह पर cytometer चलाएं (२०.००० घटनाओं की प्रवाह दरों से अधिक नहीं है/
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Representative Results
आदेश में adjuvants (ADJ1 और ADJ2) के एक अलग संयोजन का उपयोग कर उपचार का परीक्षण करने के लिए, हम adoptively स्थानांतरित OT के प्रसार को मापने के द्वारा CTL उत्पादन क्षमता का आकलन किया है-मैं सीडी 8+ टी कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा (चित्रा 2) । इस के लिए, हम पहले से अलग कोशिकाओं को सूखा लिम्फ नोड्स और तिल्ली (तालिका 1) से सना हुआ । लिम्फ नोड्स और तिल्ली में सीडी 8+ टी कोशिकाओं के प्रसार को मापने के द्वारा, हम ADJ1, ओवा अकेले या पंजाब के नियंत्रण की तुलना में ADJ2 के एक उच्च CTL पीढ़ी के लिम्फ नोड्स (चित्रा 3) में क्षमता पुष्ट करने में सक्षम थे । इसके विपरीत, हमने देखा है कि ADJ2 एक प्रणालीगत डिब्बे (तिल्ली) में एक CTL प्रतिक्रिया उत्पन्न करने में सक्षम नहीं था, जबकि ADJ1 प्लीहा सीडी 8+ टी कोशिकाओं द्वारा प्रसार के उच्च स्तर दिखा रहा था, न केवल नियंत्रण (पंजाब और ओवा) की तुलना में भी बेहतर ते ADJ1. vivo प्रसार परख में इस तेजी का उपयोग कर ADJ2 की कार्रवाई विदारक द्वारा, हम एक स्थानीय लेकिन नहीं एक प्रणालीगत CTL जनरेटर के रूप में अपनी मजबूत कार्रवाई की पुष्टि कर सकते हैं । इसके अलावा, ADJ1 इंजेक्शन के स्थानीय साइट पर दोनों कार्य करता है (लिम्फ नोड्स draining) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक वृद्धि की ओटी के साथ प्रणालीबद्ध-मैं तिल्ली में प्रसार. प्राप्त परिणाम हमें सहायक की गतिविधि और इसकी हद, ADJ2 (स्थानीय) और ADJ1 (प्रणालीगत) के मनाया प्रभाव से उदाहरण की विशेषता के लिए अनुमति देते हैं ।
चित्रा 1: परख समयरेखा । परख समय 0 दिन में प्रारंभिक OT-I T सेल हस्तांतरण का प्रतिनिधित्व करता है, 1 दिन में एस॰सी॰ टीकाकरण, और नमूना तिल्ली और draining लिम्फ नोड्स 2 दिन बाद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: गेटिंग रणनीति के प्रवाह आरेख सीडी 8+ टी कोशिकाओं के प्रसार को मापने के बाद (OT-मैं, तेरा 1.1+) प्रवाह cytometry द्वारा । दो नमूने एक बेहतर दृश्य के लिए विभिन्न रंगों (लाल और हल्के नीले रंग) में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. ए-बी. एकल प्रकोष्ठों ने पहले दो द्वारों में दोहरी क्रमिक से भेदभाव कर आगे-तितर-बितर-ऊँचाई बनाम आगे-तितर-बितर क्षेत्र और पक्ष-तितर-बितर-चौड़ाई बनाम साइड-कैटरिंग-क्षेत्र. C. कोशिकाओं बी में gated के उनके प्रतिदीप्ति की तीव्रता के द्वारा प्रदर्शित किए जाते है ६५० चैनल (ऑटो प्रतिदीप्ति) उनके CFSE के खिलाफ साजिश रची (जहां diming इंगित करता है कोशिकाओं के विभाजन/प्रसार) में 530/30 YG चैनल । यह गेट उन है कि उच्च ऑटो प्रतिदीप्ति है भेदभाव द्वारा सच CFSE सकारात्मक कोशिकाओं के चयन की अनुमति देता है । D. CFSE सकारात्मक कोशिकाओं उनके APC तीव्रता (सीडी 8) बनाम पीई-Cy7 (तेरी 1.1, OT-I कोशिकाओं के लिए मार्कर) के अपने उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ gated थे । ई. बी. वी. ४५० (CD4) APC (सीडी 8) के खिलाफ साजिश रची पहले gated तेरी 1.1 सकारात्मक कोशिकाओं के लिए सही सीडी 8+ टी कोशिकाओं का चयन करें । F. पहले gated सीडी 8+ कोशिकाओं CFSE तीव्रता के खिलाफ एक हिस्टोग्राम में अंत में proliferated जनसंख्या गेट के लिए साजिश रची है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: सहायक संचालित CTL पीढ़ी । स्थानीय या प्रणालीगत CTL प्रतिक्रियाओं को बटोरने की क्षमता 2 अलग सहायक उपचार के लिए दर्शाया गया है (ADJ1 और ADJ2) प्रतिजन और पंजाबियों नियंत्रण के साथ. adoptively स्थानांतरित OT-I T कोशिकाओं के प्रसार लिम्फ नोड में जांच की है (वंक्षण, उदाहरण चमड़े के नीचे (एस॰सी॰) प्रशासन के लिए) और तिल्ली में, के रूप में आंकड़ा पंक्तियों में संकेत दिया । सेल प्रसार सभी प्रासंगिक उपचार (कॉलम) में मापा जाता है ताकि सही अपने स्थानीय में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की हद तक तुलना करने के लिए (लिम्फ नोड draining) या प्रणालीगत (तिल्ली) कार्रवाई की रेंज । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| रंजक-एंटीबॉडी | क्लोन | Fluorophore/चैनल-फ़िल्टर | 2x एकाग्रता |
| तेरा 1.1 (सीडी 90.1) | HIS51 | पे-Cy7-780/60 YG | 1:750 |
| सीडी 8 | 53-6.7 | APC-670/14 आर | 1:280 |
| CD4 | RM4-5 | बी. वी. ४२१-450/50 V | 1:100 |
| CFSE | - | FITC-530/30 YG | (CFSE-दाग प्रोटोकॉल के अनुसार) |
| डीसीएम (डेड सेल मार्कर) | - | -/U.V.-450/50 यूवी | 1:500 |
तालिका 1: प्रवाह cytometry के लिए एंटीबॉडी दाग । Fluorophore-संयुग्मित एंटीबॉडी क्लोन इस्तेमाल किया और धुंधला सांद्रता (2x) की सिफारिश की ।
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Discussion
आधुनिक टीके आदर्श composedof शुद्ध प्रतिजन और adjuvants, liposomes, वायरस की तरह एक वितरण प्रणाली के संभव इसके अलावा के साथ कर रहे हैं, कणों की तरह, नैनोकणों या जीना वैक्टर । एक महत्वपूर्ण पहलू है जब एक टीका डिजाइनिंग के लिए नैदानिक जरूरतों के अनुसार सही सहायक का चयन है । क्षेत्र का हिस्सा एक विनोदी बनाम सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (या दोनों), एक प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बनाम एक स्थानीय (या दोनों) के चुनाव पक्ष शामिल सकता है, और स्मृति की तरह है कि वैक्सीन लक्ष्य जनसंख्या में उत्पंन करना चाहिए । सहायक मूल्यांकन का एक महत्वपूर्ण पहलू को तेजी से अपनी क्षमता निर्धारित करने के लिए CTL उत्पंन है । हम यहां एक पहले से ही ज्ञात तकनीकों पर आधारित विधि प्रस्तुत, तेजी से एक माउस मॉडल में vivo में CTL प्रतिक्रिया की सुविधाओं का निर्धारण करने के लिए OT-I सीडी 8 टी सेल प्रसार को मापने के द्वारा । इस विधि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की शक्ति की भविष्यवाणी के लिए अनुमति देता है adjuvants (OT के प्रसार-I टी कोशिकाओं) केवल 4 कार्य दिवसों में । इस विधि आगे प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (स्थानीय बनाम प्रणालीगत) और उसके प्रभावी कार्रवाई के मामले में adjuvants के कार्यों की तुलना की सुविधा । यहां, हम कैसे अलग सहायक उपचार (ADJ1 बनाम ADJ2) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित करेगा के साथ प्रतिरक्षण पर एक उदाहरण से पता चला है । ADJ2 की कार्रवाई जहां यह draining लिम्फ नोड्स में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को सक्रिय करता है प्रशासन के स्थानीय क्षेत्र के लिए प्रतिबंधित किया गया था, जबकि एक ही खुराक के साथ ADJ1 की कार्रवाई अधिक व्यापक था, दोनों स्थानीय और प्रणालीगत स्तर पर एक CTL प्रतिक्रिया पैदा लेकिन draining लिम्फ नोड्स में ADJ2 की तुलना में कम शक्ति के साथ ।
एक सहायक CTL क्षमता के सफल मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण कदम युवा OT-I जानवरों की पसंद कर रहे है (सीडी 8 टी कोशिकाओं के एक स्रोत के रूप में) और प्रतिरक्षण के लिए endotoxin मुक्त ओवा का उपयोग करें । चूंकि OT-i चूहों ट्रांसजेनिक सीडी 8 टी कोशिकाओं है कि एक MHC-i संदर्भ में ओवा पेप्टाइड SIINFEKL पहचान का उत्पादन करने के लिए उत्पंन जानवरों रहे हैं, माउस TCR के अपने कृत्रिम चयन हाइपर प्रफलन सीडी 8 के छपने बढ़ जाती है+ टी20 उंर के साथ कोशिकाओं । कांख लिम्फ नोड्स की सूजन इस प्रकार वृद्ध ओटी-I चूहों की एक अधिक आम सुविधा है । इस खाते में ले, यह युवा OT-मैं जब संभव पशुओं का उपयोग करने की सिफारिश की है (6-9 सप्ताह पुराने जानवरों) और किसी भी बढ़े हुए अंगों से कोशिकाओं को अलग से बचने के लिए (या तो लिम्फ नोड्स की तिल्ली) । proliferating सीडी 8 टी कोशिकाओं के साथ बढ़े अंगों का उपयोग पूरे परख को प्रभावित करेगा क्योंकि नियंत्रण और उपचार के बीच प्रसार में सबसे अधिक संभावना मतभेद प्राप्त नहीं किया जाएगा । सहायक CTL उत्पादन क्षमता के भेदभाव के लिए एक समान ख़तरा endotoxin के निशान के साथ ओवा प्रोटीन का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है, जो एक और अधिक शक्तिशाली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में endotoxin-मुक्त ओवा21,22 की तुलना में कर सकते हैं (देखें सामग्री और रिएजेंट), के बाद से endotoxins मजबूत इंयूनो-से 23 प्रति मॉडुलन कर रहे हैं । इसलिए, प्रतिरक्षण के लिए उपयोग किया जाने वाला ओवा प्रोटीन endotoxin-मुक्त होना चाहिए. endotoxin के 20 या ५० µ जी का उपयोग-मुक्त ओवा प्रतिरक्षण मार्ग पर निर्भर करता है ५० µ g adjuvants के चमड़े के नीचे के परीक्षण के लिए एक उपयुक्त खुराक. इसके अतिरिक्त, CFSE के उच्च सांद्रता का उपयोग साहित्य में सूचित किया गया है कि दाग24 कोशिकाओं को मारने और भी परख की विफलता में परिणाम सकता है ।
कुछ संशोधनों या विभिंन प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया तकनीकों में सुधार के लिए लागू किया गया ताकि पशुओं के तनाव को कम करने के लिए, प्रयोगों की reproducibility वृद्धि हुई है । उदाहरण के लिए, बस वापस हीटिंग और चूहों और नहीं पूरे जानवर की पूंछ से पशुओं के ताप को कम करने के लिए, या टीकाकरण से पहले पशुओं anesthetizing द्वारा उपचर्म इंजेक्शन संबंधित तनाव से बचने के लिए । संज्ञाहरण एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए पशु कल्याण विनियमों द्वारा की आवश्यकता नहीं है, लेकिन हमारे अनुभव में, यह तनाव प्रतिक्रिया द्वारा शुरू की भिन्नता को कम करने से reproducibility में सुधार.
इस विधि का एक बड़ा सीमा है कि जब से CFSE कोशिकाओं की झिल्ली दाग, अपने उच्च चमक आमतौर पर cytosol से संकेतों का पता लगाने के बिगड़ जाती है । इसलिए, यदि CTL क्षमता की पुष्टि की जरूरत है, IFN के स्राव-γ एक विशिष्ट स्राव परख 25द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए, और नहीं intracellular cytokine धुंधला द्वारा ।
प्रसार की माप का उपयोग करने के लिए सिर्फ 4 दिनों में adjuvants द्वारा CTL पीढ़ी की क्षमता का अनुमान है कम समय के लाभ पारंपरिक CTL परख26 से जरूरत है और यह मामले में एक अच्छा संभावित प्रयोग है जहां आगे अंय विधियों द्वारा पुष्टि की जरूरत है ।
हालांकि एक प्रतिजन के रूप में ओवा करने के लिए प्रतिबंधित है, और इसलिए OT-I T कोशिकाओं के उपयोग के लिए, यहां प्रस्तुत विधि proliferated कोशिकाओं की छंटाई के बाद अलग adjuvants द्वारा प्रेरित सक्रियण के गुणों के अध्ययन की अनुमति देता है । संभव आवेदनों में से एक proliferated OT-I टी कोशिकाओं और27स्मृति के विकास के साथ अपने संबंधों में अलग adjuvants द्वारा प्रेरित चयापचय हस्ताक्षर के अध्ययन है । अतिरिक्त द्वितीयक screening उत्तेजित कोशिकाओं के जैविक गुणों का मूल्यांकन कर सकता है, जैसे कि vivo CTL टेस्ट्स8 में प्रदर्शन करके फ्लो cytometry या उनकी साइटोटोक्सिक क्षमता द्वारा साइटोकिंस या दानेदार मार्कर की अभिव्यक्ति, 26 , २८. इस आवेदन के चूहों में इसके उपयोग की सीमा है के बाद से, मनुष्यों के लिए extrapolations मानव रहित चूहों के आधार पर विक्रीings शोषण द्वारा किया जा सकता है29,30,31.
इस विधि के रूप में हम यहां प्रस्तुत किया है काफी मजबूत करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया उत्प्रेरक के चयन के लिए एक पहली स्क्रीनिंग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और भी काफी लचीला संशोधित या proliferated टी कोशिकाओं के आगे विश्लेषण करने के लिए युग्मित । सारांश में, इस तेजी से vivo आकलन में सहायक CTL पीढ़ी की क्षमता को शिक्षा और उद्योग में वैक्सीन प्रयोगशालाओं के लिए एक आदर्श उपकरण है कि उनके सहायक उंमीदवार अणुओं की कार्रवाई की विधा के एक तेजी से लक्षण वर्णन में रुचि रखते हैं ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम अपने तकनीकी सहायकों के ऋणी हैं: Bröder और H Shkarlet, जिंहोंने प्रायोगिक प्रक्रियाओं के दौरान हमारी सहायता की । यह काम आंशिक रूप से यूरोपीय संघ अनुदान (UniVax, अनुबंध no. ६०१७३८, और TRANSVAC2, अनुबंध no. ७३०९६४), और एक Helmholtz एसोसिएशन अनुदान (HAI-IDR) द्वारा वित्त पोषित किया गया था । धन स्रोतों अनुसंधान डिजाइन, पांडुलिपि या यह प्रकाशन के लिए प्रस्तुत करने का निर्णय की पीढ़ी को प्रभावित नहीं किया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
| CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
| APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
| BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
| Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
| EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
| Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
| Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
| C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
| OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
| FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
| Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
| PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
| Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
| Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
| RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
| Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
| Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
| Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |
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