Summary
Wir stellen Ihnen hier einen Antrag auf eine immunologische Standardtechnik (CFSE gebeizt OT-ich Verbreitung) schnell Adjuvans-vermittelten zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Generation überwachen sollen in-vivo. Diese schnelle Abschätzung der CTL-Kapazitäten ist nützlich für die Entwicklung der prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger sowie therapeutische krebsimpfstoffe.
Abstract
Die Bewertung der modernen Untereinheit Impfstoffe zeigt, dass die Generation von neutralisierenden Antikörpern wichtig, aber nicht ausreichend für die adjuvante Auswahl. Daher sind Hilfsstoffe mit humorale und zelluläre Immuno-stimulierende Funktionen, die in der Lage, zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) Antworten zu fördern sind dringend notwendig. So steht treu Überwachung der adjuvanten Kandidaten, die Kreuz-Grundierung zu induzieren und anschließend verbessern CTL-Generation einen entscheidenden Schritt in der Entwicklung von Impfstoffen. Hier präsentieren wir einen Antrag auf eine Methode, die SIINFEKL-spezifische verwendet (OT-ich) T-Zellen, die Kreuz-Präsentation des Modells Antigen Ovalbumin (OVA) in Vivo in Anwesenheit von verschiedenen adjuvante Kandidaten zu überwachen. Diese Methode stellt ein Schnelltest Adjuvantien mit den besten Cross-Priming-Funktionen auswählen. Die Proliferation von CD8+ T Zellen ist die wertvollste Angabe des Kreuz-Grundierung und es gilt auch als Korrelat des Adjuvans-induzierte Kreuz-Präsentation. Diese Funktion kann in verschiedenen immun Organen wie Lymphknoten und Milz ausgewertet werden. Das Ausmaß der CTL-Generation auch überwacht werden kann, wodurch es Erkenntnisse über die Natur eines einheimischen (Lymphknoten vor allem entleeren) oder eine systemische Reaktion (entfernte Lymphknoten und/oder Milz). Diese Technik weiter erlaubt mehrere Modifikationen zum Testen Medikamente, die können hemmen bestimmte Wege Kreuz-Präsentation und bietet auch die Möglichkeit in verschiedene Stämme von konventionellen und gentechnisch veränderten Mäusen verwendet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen wird die Anwendung, die wir hier präsentieren nützlich für Impfstoff-Labors in Industrie oder Wissenschaft sein, entwickeln oder ändern chemischen Hilfsstoffe für Impfstoff-Forschung und Entwicklung.
Introduction
Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzieren Impfstoffe sind wichtige therapeutische Interventionen, die entwickelt wurden, um bestimmte Arten von Krebs1zu kämpfen. CTL sind auch wichtig für prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger2. Darüber hinaus CTL sind eine der wenigen immun Abwehrmechanismen in Gefahr Bevölkerungen wie Neugeborene3,4 wen auch abhängig von CTL gegen frühen Lebens Infektionen5funktionell aktiv. In diesem Zusammenhang führte Impfstoffe gegen Respiratory Syncytial Virus (RSV), die mit Adjuvans entwickelt wurden, die nicht CTL-Antworten (Alaun) entlocken wird ein Totalausfall des Impfstoffes führt zu schwerwiegenden Komplikationen bei Infektionen bei Säuglingen6. Diese negativen Auswirkungen der Impfung können rückgängig gemacht werden, indem eine CD8+ T-Zell Antwort7. Wir haben bereits gezeigt, dass die wichtigsten Zytokine (Typ-I-Interferone) hervorgerufen durch einige Stimulator der Interferon-Genen (STING)-Agonisten unerlässlich für die CTL-Antworten generiert durch diese Adjuvantien8, teilweise sind durch die Messung der Verbreitung von OT-I T-Zellen nach Impfung und anhand dieser Ergebnisse als ein Maß für die CTL induzierende Fähigkeiten beobachtet Impfung Zeitpläne9erweitert. Die Messung der Verbreitung von OT-ich CD8+ T-Zellen in einem Wild-Typ (WT) C57BL/6 Empfänger Maus durch Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) Farbstoff Verdünnung ist eine robuste Einschätzung der Fähigkeit des Adjuvans eines Impfstoffs zu generieren Kreuz-Grundierung von SIINFEKL, (die Immuno-dominante Peptid von Ovalbumin, Eizellen). Variationen dieser Technik sind weit verbreitet für die Beurteilung der Verbreitung von OT-ich CD8+ und OT-II CD4+ T Zellen. Zum Beispiel hat es in Abwesenheit des ausgewählten Zytokine (KO-Mäusen) oder impfstoffwirksamkeit nach Antigen-Rückruf bei WT Tieren Messen eingesetzt. Wir entwickelten ein kurzes Protokoll (4 Tage-Experiment) in dem nach Passive Übertragung der CFSE--gefärbten OT-ich CD8+ T-Zellen, eine subkutane (s.c.)-Immunisierung, bestehend aus einer Dosis von 50 µg von Endotoxin-freie OVA ergänzt mit Test Adjuvantien verabreicht (Abbildung 1). Die Follow-up der Ergebnisse 48 h nach der Impfung bietet zuverlässigen Beweis für die Fähigkeit des Adjuvans, CTL-Antworten zu generieren. Mit dieser Strategie ist es möglich, die Wirksamkeit der lokalen Immunantwort in die drainierenden Lymphknoten nach Immunisierung sowie das Ausmaß der Reaktion zu bewerten, durch Messung der CTL-Aktivität in der Milz (oder entfernte Lymphknoten).
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Protocol
Alle Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden aus dem C57BL/6-Hintergrund. Alle Tiere wurden unter Pathogen-freies Bedingungen gehalten. Alle Experimente wurden nach den normativen das deutsche Tierschutzgesetz (TierSchG BGBl. durchgeführt. ICH S 1105; 25.05.1998) und des unteren Sachsen-Ausschusses für die Ethik von Tierversuchen und das Landesamt (untere Sachsen Stand für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit), unter der Genehmigung Nr. 33,4-42502-04-13/1281 und 162280 angenommen wurden.
1. CFSE-Färbung des OT-I T-Zellen und Adoptiv-Transfer
Hinweis: OT-ich Mäuse sind Transgen generierten Tiere, die einen T-Zell-Rezeptor (TCR) Ausdrücken mit festen α und β-Ketten, die zusammen die Immuno-Dominant-Peptid der OVA, erkennen SIINFEKL10,11. Infolgedessen haben diese Mäuse eine deutlich hohe Anzahl von SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zellen (97 %)12 im Vergleich zu normalen oder OVA geimpften Mäuse (≤ 1 %)13.
- Isolierung von nachvollziehbar CD8+ T-Zellen von OT-ich Mäuse mit dem Ausdruck T-Lymphozyten-spezifischen Thy1ein (Thy1.1) Allel:
- Einschläfern 6-9 Wochen alten OT-ich Mäuse durch CO2 Inhalation gefolgt von zervikale Dislokation14. Die Milz und große Lymphknoten (leisten-, axillären und zervikalen Paare nur) indem die Haut mit chirurgische Scheren, ablösen der Haut aus dem Körper mit Hilfe von chirurgischen Zangen und Pinzetten zu sezieren und legen Sie sie in Petrischalen (60 x 15 mm) jeweils ein 100 µm Pore Netz Tasse Gewebe Schleifen und Zelle Freilassung.
- Pflegen Sie Petrischalen (jeweils mit einem Mesh-Cup) in 3-5 mL des kompletten RPMI Medium (RPMI 1640, 10 % V/V FCS, 100 U/mL Penicillin, Streptomycin 50 µg/mL) auf Eis gehalten.
- Pürieren Sie die Organe mit Hilfe von einem Spritzenkolben oder ein ähnliches steriles Instrument (vorherige schneiden ist nicht erforderlich) und sammeln Sie die entstandene Suspension Einzelzelle in 15 mL Zentrifuge Röhren.
- Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand. Waschen Sie die Zellen in 10 mL kaltem PBS durch Zentrifugation und lyse der Erythrozyten aus der Milz wieder aussetzen das Pellet in 1 mL/Milz Ammoniumchlorid Puffers (ACK-Puffer, im Handel erhältlich). Brüten Sie die Zellen für 1,5 min auf Eis, und waschen Sie anschließend die Zellen mit 10 mL kaltem PBS durch Zentrifugieren (wie zuvor).
- Wieder aussetzen Sie das Pellet in das gleiche Rohr in 1 mL PBS (pH 7,2) mit 5 % fötalen Rinderserum für magnetische Isolierung.
- Um magnetische Isolierung durchzuführen, gehen Sie zu der negativen Auslese der CD8+ T-Zellen durch die Verwendung eines magnetischen isolierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers oder Protokolle15veröffentlicht.
- Zur Durchführung CFSE-Färbung, zuerst die Anzahl der CD8+ T Zellen gewonnenen OT-ich Mäuse mit einem automatisierten Zelle Zähler (Partikelzähler). Fleck 1-5 x 107 Zellen/mL in ein Volumen von 1-5 mL mit 5 µM CFSE mit PBS-Puffer für 7 min bei 37 ° C, lichtgeschützt in einem 15 ml Falcon-Röhrchen.
- Stillen Sie die CFSE-Färbung der Zellen das gleiche Volumen (1:1) des fötalen Rinderserum hinzufügen zu, und inkubieren sie zusätzliche 7 min bei 37 ° C, vor Licht geschützt. Waschen Sie die Zellen mit 10 mL PBS zweimal.
- Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler. Festlegen der Zellzahl auf 3-5 x 107 Zellen/mL PBS um 3-5 x 106 Zellen/Maus in 100 µL intravenös zu injizieren (i.v.) über die Rute Vene.
- Zum Heck Vene Injektionen durchführen zu immobilisieren die Mäuse in entsprechenden wachstumsbefürworter. Wärmen Sie den Rückenbereich und Tail der Mäuse injiziert werden, mithilfe einer Rotlicht-Lampe, zwischen 20 bis 25 cm entfernt von den Mäusen für 1-3 min zum Heck Vene Vasodilatation zu ermöglichen.
Hinweis: Dadurch Leichtigkeit Vene Erkennung und Verwaltung der Zellsuspension. - (Mit der Hand zwischen die Mäuse und die Lampe platziert) sicherzustellen, dass es nicht zu heiß für die Mäuse und wenn die Rute Venen deutlich sichtbar sind, fahren Sie mit der Injektion. Injizieren Sie die Zellen in der seitlichen oder dorsalen Schweif Ader mit einer 1mL Spritze mit einem 25-Gauge-Nadel16.
2. Immunisierung (Endo-freie OVA +/-adjuvante)
- Legen Sie die Mäuse transplantiert mit OT-ich Zellen (Schritt 1.7, Abbildung 1) in einer Narkose-Kammer und Isofluran in Sauerstoff durch eine Anästhesie Maschine14zu verwalten.
- Wenn die Maus völlig eingeschlafen unter Narkose ist, nehmen Sie es aus der Kammer und rasieren Sie das Fell der Maus auf den Bereich über den Gluteus Superficialis (seitlichen unteren Rücken) mithilfe einer elektrischen Haar Beschneidemaschine, um eine saubere Injektion durchführen mit einen guten Blick auf das Einsatzgebiet.
- 50 µL des Impfstoffes, s.c. in den rasierten Bereich mit einer 25-Gauge-Nadel zu injizieren.
3. Isolation von Lymphozyten und Färbung für Flow Cytometry Analysis
- Isolierung von Lymphozyten und splenocyten
- Einschläfern Sie die geimpften Mäuse durch CO2 Einatmen, gefolgt von zervikale Dislokation.
- Extrahieren Sie der Entwässerung und entfernten Lymphknoten und der Milz und legen Sie sie in separaten Petrischalen mit 100 µm Pore Netz Tassen Gewebe Schleifen und Zelle Freilassung. Führen Sie die Schritte 1.1.2 durch 1.1.3.
- Abgießen Sie den überstand nach Zentrifugation und wieder auszusetzen Sie, die Zelle Pellets in das gleiche Volumen der Überrest PBS (ca. 100 µL).
- Färbung für Flow-zytometrie-Analyse
- In einem 15 mL Zentrifugenröhrchen bereiten Sie einen master-Mix enthält die Färbung Antikörper in den Konzentrationen, die in Tabelle 1dargestellt, ein 2 X so nachgiebig Färbung Mischung konzentriert. Bereiten Sie genügend Volumen des master-Mix, 100 µL pro Probe zu haben. Die Zellen und die master-Mix 1:1 mischen und bei 4° C für 30 min inkubieren.
Hinweis: Der letzte Färbung Band pro Probe sollte 200 µL (100 µL der Zelle Pellet + 100 µL Antikörper-master-Mix). - Waschen Sie die Zellen zweimal durch Zentrifugation, wie unter 1.1.3, Hinzufügen von 10 mL PBS, zweimal.
- Wieder aussetzen der gefärbten Zellen in 0,5-1 mL PBS für Erwerb und die Übertragung der Aussetzung zu Flow Cytometer Röhren. Immer die Proben auf Eis und vor Licht geschützt werden.
- In einem 15 mL Zentrifugenröhrchen bereiten Sie einen master-Mix enthält die Färbung Antikörper in den Konzentrationen, die in Tabelle 1dargestellt, ein 2 X so nachgiebig Färbung Mischung konzentriert. Bereiten Sie genügend Volumen des master-Mix, 100 µL pro Probe zu haben. Die Zellen und die master-Mix 1:1 mischen und bei 4° C für 30 min inkubieren.
4. die Durchflusszytometrie
- Immer Vorfilter die Zellproben mit 70-100 µm filtern.
- Die Fluorophore detailliert in Tabelle 1 (Perlen oder Zellen) bereiten Sie einheitliche Färbung Entschädigung Kontrollen vor.
Hinweis: Entschädigung sollte durchgeführt im Cytometer oder Analyse-Software17,18,19 und auf alle Proben angewendet werden. - Folgen Sie der gating-Strategie in Abbildung 2dargestellt. Kurz, Tor Populationen im forward Scatter Höhe vs. forward Scatter Bereich (Abbildung 2A), und wieder Seite streuen breit vs. Scatter Seitenbereich (SSA, Abb. 2 b), um Dubletten auszuschließen.
- Tor der Bevölkerung aus Figur 2 b durch Plotten BV 650 (Auto-Fluoreszenz) vs. FITC (CFSE) um echte CFSE-zu diskriminieren gefärbten Zellen aus hohen Auto-fluoreszierende Zellen. Enthalten Sie Perlen oder Zellen befleckt mit Antikörper konjugiert BV 650 in Entschädigung Steuerelemente. Dieses Grundstück (Abbildung 2) BV 650 vs. FITC wird verwendet, um die OT Tor-ich CFSE gefärbten Zellen.
- Tor der Bevölkerung aus Figur 2 C für Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs. APC (CD8) um Zellen aus Spender vs. Empfänger Mäusen zu unterscheiden.
Hinweis: Zellen abgeleitet von OT-ich Spender Mäuse sind Thy1.1+ (CD90.1), WT (C57BL/6, Empfänger) Mäuse-abgeleitete Zellen Thy1.2+ (CD90.2) (Abb. 2D). Einige Labore haben OT-ich Mäuse in einem Thy1.2 Hintergrund und WT (C57BL/6) in einem Thy1.1. In diesem Fall müssen Sie einen Antikörper gegen Thy1.2 für OT verwenden-ich Handy-gating. - Re Tor CD8+ Zellen von Thy1.1+ Bevölkerung durch Plotten es auf ein Tor, bestehend aus BV 450 (CD4) vs. APC (CD8) (Abb. 2E).
- Anzeigen die Bevölkerung in Abbildung 2E mithilfe eine Histogrammanzeige von der CD8 gated+ Zellen zeigen CFSE (FITC, 530/15-Kanal - blaue Laser-), Tor die proliferierte Bevölkerung durch die Einbeziehung der Intensitäten von 102 bis auf die Ebene wo die ungeteilten Kontrolle Bevölkerungen sind (Intensitäten ~ 105, abhängig von der Wirksamkeit der CFSE-Färbung und die Spannungseinstellung auf das Durchflusszytometer) (Abb. 2F).
- Machen Sie einen zusätzliches Tor (nicht in Abbildung 2 dargestellt) Plotten FITC vs. L/D-Marker (450/20 Kanal, UV-Laser), um tote Zellen parallel zur Verbreitung Bewertung bewerten.
- Erwerben Sie mindestens 5000 Ereignisse für die Entschädigung Steuerelemente und 10,000 Ereignisse (Tor E, Abbildung 2) aus den Proben in einem Durchflusszytometer. Laufen die Cytometer mit geringer oder mittlerer Durchfluss (Flussraten von 20.000 Veranstaltungen/s nicht überschreiten).
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Representative Results
Um die Behandlungen mit einer anderen Kombination von Adjuvantien (ADJ1 und ADJ2) zu testen, beurteilten wir die CTL-Erzeugungskapazitäten durch Messung der Verbreitung von adoptively übertragenen OT-ich CD8+ T-Zellen durch Durchflusszytometrie (Abbildung 2). Hierzu gebeizt wir zuvor isolierte Zellen aus der drainierenden Lymphknoten und der Milz (Tabelle 1). Durch die Messung der Proliferation von CD8+ T Zellen in Lymphknoten und Milz, konnten wir eine höhere CTL Erzeugungskapazität von ADJ2 in den Lymphknoten (Abbildung 3) bestätigen im Vergleich zu ADJ1, OVA allein oder PBS Kontrolle. Im Gegensatz dazu haben wir beobachtet, dass ADJ2 war nicht in der Lage, eine CTL-Antwort in einem systemischen Fach (Milz) zu generieren, während ADJ1 zeigen hohe Verbreitung durch Milz CD8 war+ T-Zellen, nicht nur im Vergleich zu den Kontrollen (PBS und OVA) aber auch überlegen zu ADJ1. Durch die Aktion des ADJ2 mithilfe dieser schnelle in-Vivo -Verbreitung-Assay sezieren, können wir ihre starke Wirkung als eine lokale, aber keine systemische CTL-Generator bestätigen. Darüber hinaus wirkt sowohl auf den lokalen Standort der Einspritzung (Lymphknoten) ADJ1 sowie als systemisch mit einer erhöhten OT-ich Verbreitung in der Milz. Die erzielten Ergebnisse erlauben uns, die adjuvante Aktivität und seine Ausdehnung, veranschaulicht durch die beobachteten Effekte von ADJ2 (lokal) und ADJ1 (systemischen) charakterisieren.
Abbildung 1: der Assay-Zeitleiste. Die Assay-Zeitleiste stellt die ersten OT-ich T Zelle übertragen an Tag 0, s.c.-Impfung am Tag 1, und die Probenahme Milz und Entwässerung Lymphknoten 2 Tage später. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Flussdiagramm der gating-Strategie gefolgt, die Proliferation von CD8 Messen+ T Zellen (OT-ich, Thy1.1+) durch Durchflusszytometrie. Zwei Proben werden in verschiedenen Farben (rot und blau) für eine bessere Visualisierung dargestellt. A-B. Einzelne Zellen sind von Dubletten sukzessive in den ersten beiden Toren diskriminiert, durch Plotten vorwärts-Scatter-Höhe vs. vorwärts-Scatter-Bereich und Breite Streuung Seite vs. Seitenbereich streuen. C. gated in B Zellen werden durch ihre Fluoreszenz-Intensität von BV 650 Kanal (Auto-Fluoreszenz) aufgetragen gegen ihre CFSE-Intensität (wobei Diming Zellen Divisionen/Verbreitung angibt) im 530/30 YG Kanal angezeigt. Dieses Tor ermöglicht die Auswahl von true CFSE-positive Zellen durch diskriminierende diejenigen, die hohe Auto-Fluoreszenz haben. D. CFSE-positive Zellen wurden gated mit ihrer hohen Fluoreszenzintensität von Pe-Cy7 (Thy1.1, Marker für OT-ich Zellen) vs. ihre APC-Intensität (CD8). E. BV 450 (CD4) aufgetragen gegen APC (CD8) für zuvor gated Thy1.1 positive Zellen markieren genau CD8+ T Zellen. F. gated zuvor CD8+ Zellen werden in einem Histogramm gegen die CFSE-Intensität, schließlich die zunehmende Bevölkerung Tor dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: adjuvante CTL Generation angetrieben. Die Fähigkeit, lokale oder systemische CTL-Antworten zu entlocken ist für 2 verschiedene adjuvante Behandlungen (ADJ1 und ADJ2) entlang Antigen und PBS-Steuerelemente dargestellt. Die Verbreitung der adoptively übertragenen OT-I T-Zellen wird untersucht, in die drainierenden Lymphknoten (leisten-, für die beispielhaft subkutaner (SC)) und in der Milz, wie in der Abbildung Zeilen angegeben. Die Zellproliferation wird gemessen, um das Ausmaß der Immunantwort genau vergleichen in allen relevanten Behandlungen (Spalten), in seiner lokalen (Drainierende Lymphknoten) oder systemischen (Milz) Aktionsradius. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Farbstoffe - Antikörper | Klon | Fluorophor/Kanal-filter | Konzentration 2 X |
| Thy1.1 (CD90.1) | HIS51 | PE-Cy7-780/60 YG | 1:750 |
| CD8 | 53-6,7 | APC - 670/14 R | 1:280 |
| CD4 | RM4-5 | BV 421-450/50 V | 1: 100 |
| CFSE | - | FITC - 530/30 YG | (nach CFSE--Färbung-Protokoll) |
| DCM (Tote Zelle Marker) | - | -/ U.V. - 450/50 UV | 1: 500 |
Tabelle 1: Keramikschalen Antikörper für die Durchflusszytometrie. Fluorophor-konjugierten Antikörpern Klone verwendet und empfohlen, Färbung Konzentrationen (2 X).
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Discussion
Moderne Impfstoffe sind im Idealfall Composedof gereinigte Antigen und Hilfsstoffe, mit den möglichen Zusatz eines Liefersysteme wie Liposomen, virusähnliche Partikel, Nanopartikel oder live Vektoren. Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung eines Impfstoffes ist, die richtigen adjuvanten nach den klinischen Bedürfnissen wählen. Bestandteil des Lieferumfangs könnte begünstigt eine humorale vs. zelluläre Immunantwort (oder beides), die Wahl eines lokalen vs. einer systemischen Immunantwort (oder beides) und die Art des Speichers, die der Impfstoff in der Zielpopulation generieren muss. Ein wesentlicher Aspekt der adjuvanten Bewertung ist seine Fähigkeit, CTL erzeugen schnell bestimmen. Hier präsentierten wir eine Methode basiert auf der bereits bekannten Techniken, um die Funktionen des CTL Antwort in Vivo in einem Mausmodell schnell bestimmen, indem Sie messen OT-I CD8 T-Zell-Proliferation. Diese Methode ermöglicht die Vorhersage der Potenz der Immunantwort ausgelöst durch Adjuvantien (Verbreitung von OT-I T-Zellen) in nur 4 Werktagen. Diese Methode weiter erleichtert den Vergleich von den Aktionen der Adjuvantien in Bezug auf die Immunantwort (lokal vs. systemische) und seine wirksame Maßnahmen. Hier haben wir ein Beispiel gezeigt, wie Immunisierung mit verschiedenen adjuvante Behandlungen (ADJ1 vs. ADJ2) die Immunantwort beeinflussen wird. Die Wirkung der ADJ2 beschränkte sich auf der näheren Umgebung der Verwaltung, wo es die Immunantwort in die drainierenden Lymphknoten aktiviert, während der Einwirkung von ADJ1 mit der gleichen Dosis weiter verbreitet, generieren eine CTL Reaktion auf die lokale und systemische Ebene, sondern war mit weniger Potenz als ADJ2 in den Lymphknoten.
Wichtige Schritte für die erfolgreiche Evaluation ein Adjuvans CTL Kapazität sind die Wahl der jungen OT-ich Tiere (als eine Quelle von CD8 T-Zellen) und die Verwendung von Endotoxin-freie Eizellen für die Immunisierung. Seit OT-ich Mäuse sind Transgene Tiere generiert, um CD8 T-Zellen zu produzieren, die OVA Peptid SIINFEKL in einem MHC zu erkennen-ich Kontext, die künstliche Selektion der Maus TCR erhöht die Auftritte der hyper proliferative CD8+ T Zellen20 mit dem Alter. Eine Entzündung der axillären Lymphknoten ist damit ein häufiger Bestandteil Alter OT-ich Mäuse. Wenn man dies berücksichtigt, es empfiehlt sich, junge OT verwenden-ich Tiere wenn möglich (6-9-Wochen alten Tiere) und um zu vermeiden, Isolieren von Zellen aus einem erweiterten Organe (entweder Milz Lymphknoten). Die Verwendung von vergrößerten Organe mit wuchernden CD8 T-Zellen wird den ganze Test auswirken, da am ehesten Unterschiede in der Verbreitung zwischen Kontrollen und Behandlungen nicht erzielt werden. Eine ähnliche Gefahr für die Diskriminierung der adjuvanten CTL Erzeugungskapazität konnte mithilfe OVA Protein mit Spuren von Endotoxin, die eine stärkere Immunantwort gegenüber Endotoxin-freie OVA21,22 (siehe entlocken können generiert werden Materialien und Reagenzien), da Endotoxine starke Immuno-Modulatoren pro se 23 sind. Daher muss die OVA-Protein verwendet für die Immunisierung Endotoxin-frei sein. Die Verwendung von 20 oder 50 µg von Endotoxin-freie OVA richtet sich nach der Immunisierung Route wird 50 µg eine geeignete Dosis für subkutane Prüfung von Adjuvantien. Darüber hinaus die Verwendung von hohen Konzentrationen von CFSE wurde in der Literatur berichtet, der gefärbten Zellen24 töten und könnte auch das Scheitern des Assays.
Einige Änderungen oder Verbesserungen an verschiedene Techniken verwendet in dem Protokoll wurden umgesetzt, um den Stress der Tiere, Erhöhung der Reproduzierbarkeit der Experimente zu reduzieren. Zum Beispiel im Zusammenhang mit der Heizung der Tiere zu minimieren, indem Sie nur Heizung hinten und das Heck der Mäuse und nicht das ganze Tier, oder subkutane Injektion zu vermeiden Stress durch Betäuben der Tiere vor der Impfung. Die Narkose ist nicht erforderlich, durch Tierschutzbestimmungen für eine subkutane Injektion, aber nach unserer Erfahrung es Reproduzierbarkeit verbessert, verringernd, Variationen von der Stressantwort eingeführt.
Eine große Einschränkung dieser Methode ist, dass da CFSE der Membran von Zellen Flecken, die hohe Helligkeit in der Regel die Erkennung von Signalen aus dem Zytosol beeinträchtigt. Daher, wenn die Bestätigung von CTL Kapazität benötigt wird, sollte die Sekretion von IFN-γ durch einen spezifischen Sekretion Assay 25und nicht durch intrazelluläre Zytokin Färbung bewertet werden.
Die Verwendung der Messung der Verbreitung, der CTL Erzeugungskapazität von Adjuvantien in nur 4 Tagen zu schätzen hat den Vorteil kürzerer Zeit als traditionelle CTL26 Assays und es ist eine gute Interessenten im Fall wo weitere Experimentieren erforderlich Bestätigung durch andere Methoden ist erforderlich.
Obwohl auf OVA als Antigen, beschränkt und daher auf die Verwendung von OT-I T-Zellen, die vorgestellte Methode ermöglicht die Untersuchung der Eigenschaften der Aktivierung durch verschiedene Adjuvantien nach dem Sortieren der proliferierte Zellen induziert. Eine der möglichen Anwendungen ist die Studie der metabolischen Signaturen induziert durch verschiedene Adjuvantien in der proliferierte OT-I T-Zellen und ihre Beziehungen mit der Entwicklung der Speicher27. Zusätzliche sekundäre Vorführungen konnten die biologischen Eigenschaften der stimulierten Zellen, z. B. den Ausdruck von Zytokinen oder Degranulation Marker durch Durchflusszytometrie oder ihre zytotoxische Kapazität durch die Durchführung von in-vivo CTL Tests8, bewerten 26 , 28. Da diese Anwendung die Einschränkung des Konsums bei Mäusen hat, können Extrapolation auf den Menschen durch Ausnutzung Vorführungen basierend auf humanisierten Mäuse29,30,31durchgeführt werden.
Diese Methode, da wir hier vorgestellt haben ist robust genug, um als erste Screening für die Auswahl der zellulären Antwort Aktivatoren verwendet werden und auch flexibel genug, um verändert oder zur weiteren Analyse der proliferierte T-Zellen gekoppelt werden. Zusammenfassend ist dieses in-vivo schnellbewertung adjuvante CTL Erzeugungskapazität ein ideales Werkzeug für Impfstoff Laboratorien in Wissenschaft und Industrie, die eine schnelle Charakterisierung der Wirkungsweise ihrer adjuvante Kandidat Moleküle interessiert sind.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir sind verpflichtet, unseren technischen Assistenten: U. Bröder und H. Shkarlet, die uns während der experimentellen Verfahren geholfen. Diese Arbeit wurde teilweise von EU-Zuschüssen (UniVax, Vertrag Nr. 601738 und TRANSVAC2, Vertrag Nr. 730964) und ein Stipendium der Helmholtz-Gemeinschaft (HAI-IDR) finanziert. Die Finanzierungsquellen hat keinen Einfluss auf die Forschung design, Erzeugung von Manuskript oder Entscheidung, zur Veröffentlichung übermitteln.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
| CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
| APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
| BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
| Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
| EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
| Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
| Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
| C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
| OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
| FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
| Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
| PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
| Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
| Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
| RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
| Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
| Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
| Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |
References
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