Summary
Comprendere le risposte comportamentali di bivalvi sospensione-alimentatori alle variabili ambientali, come l'ossigeno disciolto, può spiegare alcuni processi dell'ecosistema. Abbiamo sviluppato un monitor economico, basato sul laboratorio, strain-gauge (SGM) per misurare le risposte di gape valvola di ostriche, Crassostrea virginica, ipossia diel-ciclismo e pH ciclica.
Abstract
Un monitor di gape valvola poco costoso, basato sul laboratorio, strain-gauge (SGM) è stato sviluppato per monitorare il comportamento di gape valvola di molluschi bivalvi in risposta all'ipossia diel-escursioni in bicicletta. Un ponte di Wheatstone era collegato ad estensimetri che sono stati attaccati ai gusci di ostriche (Crassostrea virginica). I segnali registrati consentito per l'apertura e la chiusura dei bivalvi da registrare continuamente sopra due giorni periodi di ipossia di diel-ciclismo sperimentalmente indotta e diel-ciclismo variazioni di pH. Qui, descriviamo un protocollo per lo sviluppo di un monitor economico strain-gauge e descrivere, in un esperimento di laboratorio di esempio, come abbiamo usato per misurare il comportamento di gape valvola di orientale ostriche (c. virginica), in risposta all'ipossia diel-ciclismo e cicliche variazioni di pH. Gape valvola è stata misurata su ostriche sottoposte a ciclica severa ipossia (0,6 mg/L) dissolto condizioni di ossigeno con e senza cambiamenti ciclici in pH, condizioni cicliche mite hypoxic (1,7 mg/L) e condizioni di normossia (7,3 mg/L). Dimostriamo che quando ostriche incontrano diel ripetuti cicli, rapidamente chiudere loro gusci in risposta all'ipossia severa e chiudere con un ritardo lieve ipossia. Quando viene ripristinato il normoxia, hanno rapidamente aperto nuovamente. Le ostriche non hanno risposto alla condizioni di pH ciclica sovrapposte diel ciclismo ipossia severa. Alle condizioni di ridotta di ossigeno, più di un terzo delle ostriche chiusi contemporaneamente. Dimostriamo che ostriche rispondono all'ipossia diel-escursioni in bicicletta, che deve essere considerato quando valutare il comportamento di bivalvi di ossigeno disciolto. La valvola SGM può essere utilizzata per valutare le risposte dei molluschi bivalvi ai cambiamenti di ossigeno disciolto o contaminanti. Tecniche per migliore guarnizione di tenuta valvola gape estensimetri da acqua di mare hanno bisogno di ulteriore miglioramento per aumentare la longevità dei sensori.
Introduction
Ipossia, cioè, dissolto le concentrazioni ossigeno [] sufficientemente basso per influenzare negativamente biologico e processi ecologici ma spesso funzionalmente definita come [DO] < 2 mg / L1e anossia (funzionalmente definita come [DO] 0,0-0,2 mg/L) si verificano più frequentemente e gravemente in acque costiere del mondo, estuari e il profondo oceano2,3 e sono spesso aggravate dalla crescente eutrofizzazione4,5. Con un crescente estensione areale di ipossia e anossia, macrofauna sono influenzati negativamente e perdere la misura di habitat e qualità dell'habitat. Il cambiamento climatico è preveduto per peggiorare l'ipossia e anossia6.
In molti estuari stratificati, arricchita di sostanze nutritive come la Chesapeake Bay, Stati Uniti d'America, stagionalmente persistente ipossia può prevalere e può verificarsi anno dopo anno2. Inoltre, diel-ciclismo di ipossia è frequente negli estuari come la baia di Chesapeake e altri luoghi e si verifica tardi durante la notte o le prime ore del mattino in estate7,8.
Maggior parte degli studi si sono concentrati sull'effetto dell'esposizione continua di organismi a bassa [DO] e sulla loro tolleranza all'ipossia e anossia9,10,11,12,13,14 . Inoltre, gli studi hanno esaminato il cambiamento su larga scala nella composizione delle distribuzioni, abbondanze e specie specie in risposta a estesa [DO] basso4,15. Spesso specie che sono molto sensibili a bassa [], morire nelle masse,16 spostando le restanti specie di una fauna più giovane, più piccolo di dimensioni, di breve durata come, ad esempio, trovate sulla mensola Louisiana-Texas ecosistema4.
Cambiamenti comportamentali in genere precedono comunità crollo17 e gli studi hanno riferito sulle risposte comportamentali degli organismi a estesa basso [DO]4,16,17,18,19 ,20,21,22,23,24,25. Questi studi, tuttavia, non si concentrano sulle risposte degli organismi alle esposizioni diel-ciclismo di ipossia e la natura fluttuante di [DO] disponibilità negli estuari.
Diel-ciclismo ipossia negli estuari superficiali ha ricevuto crescente consapevolezza come studi monitorare [DO] più frequentemente nel corso dei giorni con sonde in estuari16,26. Acqua può rimanere ipossica per ore alla fine della notte o le prime ore del mattino in estate quando non c'è nessuna fotosintesi di generazione di ossigeno durante la notte, ma che consumano ossigeno alta respirazione aerobica7,16. Si è inoltre constatato che le maree influenzato il diel ciclismo condizioni basso con più estremi minimi osservati quando bassa marea ha coinciso con la fine della notte27. Solo dopo diverse ore di ipossia [DO] tornare a normoxia7,16,28 nel ciclo giornaliero.
Per determinare la risposta comportamentale di c. virginica diel-ciclismo ipossia e pH abbiamo monitorato l'apertura e la chiusura delle valvole di ostriche esposte al laboratorio indotto diel ciclica e ciclismo di [DO] pH. Gape risposte di bivalvi sono state utilizzate per rilevare condizioni ambientali avverse. Chiusure di valvola di molluschi bivalvi in risposta a contaminanti29,30,31, alghe tossiche32,33,34, l'inquinamento termico35,36 , 37,38,39,40, alimentazione regime39,41, emersione37,42, fotoperiodo43 diminuire la quantità di cibo , 44, pH45,46e combinato pH e ossigeno disciolto47 sono stati misurati. Gape tecniche hanno, ad esempio, incluso osservazioni dirette48,49,13, misurazioni continue utilizzando interruttori reed e magneti (Dreissena monitor)50o sensori in fibra ottica 51 che richiedono acqua limpida. Inoltre, sensori di Hall forza magneti e campi magnetici sono stati utilizzati per studiare la cozza gape angolo52,53,54,55e un sistema di induzione elettromagnetica ad alta frequenza che può misurare la distanza varia tra due bobine elettriche che sono incollati sulle valvole è stato utilizzato56,57,58,59. Una sorgente di alta tensione è necessaria per il sistema di induzione elettromagnetica e potenza deve essere consegnato ad entrambi i lati del guscio52. Questo sistema è anche disponibile nel commercio come il "MOSSELMONITOR" (http://mosselmonitor.nl/).
Un budget di ricerca stretto, abbiamo costruito un monitor economico strain-gauge (SGM) per misurare continuamente gape ostrica sopra indotta da laboratorio diel ciclismo di [DO] e pH, in condizioni di scarsa visibilità. Il nostro sistema è anche molto più semplice rispetto ai sistemi concorrenti, consentendo molti animali da instrumentare durante un esperimento. Abbiamo voluto determinare le risposte comportamentali di c. virginica diel ciclismo grave ([] = 0,6 mg/L) ipossia con pH di controllo (pH = 7.8) e ciclismo pH (pH = 7,8-7.0), rispettivamente e le risposte di gape al delicato ([] = 1,7 mg/L) ipossia. Inoltre, abbiamo voluto determinare se le ostriche sono in grado di rispondere rapidamente ai cambiamenti in [] sopra il diel ciclo e come reagire quando normoxia ritorna dopo un evento hypoxic. Forse le ostriche sono adattate all'ambiente rapidamente fluttuante che si trova in molti estuari16,27 dove vivono. Mentre più complessa valvola gape monitor sono disponibili, la SGM offre una tecnica poco costoso che consente misurazioni continue della valvola gape nelle acque anche in condizioni di scarsa visibilità.
Figura 1. Ponte di Wheatstone per l'apparecchiatura di gape valvola. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I sensori dell'estensimetro utilizzati per il monitoraggio gape bivalvi sono film resistivo in un modello di meandro su un supporto di polyimide. Piccole quantità di sforzo modulano la resistenza del sensore. I bivalvi si flette l'estensimetro quando esso gapes causando un cambiamento nella resistenza del sensore. Abbiamo impiegato un ponte di Wheatstone Annulla, equilibrato, per ogni canale bivalvi come mostrato nella Figura 1 per misurare la variazione nella resistenza del sensore. Il ponte di Wheatstone è annullato dal potenziometro che permette un guadagno abbastanza alto essere impiegato dal datalogger. Un ponte di Wheatstone è un metodo standard per misurare con precisione una resistenza sconosciuta utilizzando un rapporto di un noto standard di resistenza e un voltmetro. La storia di questa antichissima tecnica è discussa in Ekelof (2001)60. Abbiamo integrato 12 canali, ognuno con il proprio ponte di Wheatstone e Annulla potenziometro, Strain Gauge Monitor (SGM).
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Protocol
1. costruzione del ponte di Wheatstone per apparecchiatura di Gape della valvola
Nota: L'estensimetro è nominalmente 1000 Ω, così completamente bilanciare e il ponte di null, tutti i componenti dovrebbero essere 1000 Ω.
- Come illustrato nella Figura 1, resistori di precisione di saldatura due 1 kΩ a vicenda e poi per un resistore ~ 976 Ω e un Ω 100 10 Ruotare il potenziometro. La gamma tipica dell'estensimetro è qualche Ω fuori il Ω di 1000 nominale, quindi solo che questa resistenza deve essere accompagnata. Per questo scopo, utilizzare una resistenza di 976 Ω fissa e una resistenza regolabile (potenziometro a 10 giri).
- Portare un lato del braccio variabile e un lato di 1 resistenza di kΩ a un connettore per fissare l'estensimetro bivalve come mostrato in Figura 1.
- Fissare la parte superiore e parte inferiore del ponte a un alimentatore per fornire corrente al ponte come mostrato nella Figura 1di polarizzazione.
- Collegare i punti medi del ponte per il preamplificatore e il registratore di dati, come illustrato nella Figura 1. Questo registra la risposta bivalve come suo movimento gape modula la resistenza dell'estensimetro.
- Dopo che l'estensimetro bivalve è associato, null il ponte regolando il 10 Ruotare il potenziometro finché la tensione sull'ingresso del registratore di dati è zero. Usare un connettore BNC e una mano tenuta voltmetro per questo scopo.
Nota: Azzeramento l'output significa che guadagni molto elevati possono essere utilizzati con il registratore di dati senza saturare l'input, consentendo tensioni molto precise (risposta gape) deve essere misurata.
Nota: Il nostro setup multicanale utilizza saldati su un normale pezzo di elettronica "perf-Pensione" a mano componenti discreti. Questo potrebbe facilmente essere formalizzato su un circuito molto economico con un piccolo sforzo aggiuntivo.
2. generale impostazione per pH Diel-ciclismo ipossia e Cyclical
- Mantenere le ostriche con malattia nota bassa prevalenza61 negli acquari 75-L sotto una luce h 14: fotoperiodo scuro 10 h, 7 giorni alla settimana48ed esporre loro di cambiamenti ciclici in [DO] che imita diel-ciclismo ipossia come trovati in natura7, 8. durante 14 h di luce, simulare i livelli di luce in una giornata di sole a 2 m di profondità nel Rhode River, nel Maryland61.
- Impostare diel-ciclismo ipossia e ciclica pH in laboratorio per esperimenti a lungo termine come descritto in dettaglio da Burrell et al. (2015) 49. manipolare [DO] e pH in ogni acquario e mantenere a livelli pre-determinati in ogni momento. Per evitare la chiusura della valvola a causa della limitazione del cibo, è necessario aggiungere fitoplancton62 per gli acquari. Compensare eventuali potenziali l'assorbimento dalla decomposizione delle alghe regolando [DO] in ogni acquario.
3. bivalvi acclimatazione
- Acclimatare ostriche all'ipossia diel-in bicicletta per circa una settimana prima di eseguire esperimenti di gape.
4. impostazione fasi di Plateau di ipossia Diel-ciclismo
Figura 2 . [DO] fu manipolato sperimentalmente ogni giorno per generare diel ciclismo ipossia. Qui 2 cicli consecutivi diel mostrati sopra quale gape misurazioni sono state effettuate. Ogni ciclo di diel contiene quattro fasi [DO]: un = soprasaturazione (SS), b = normoxia dopo soprasaturazione, c = basso altopiano (LP), d = normoxia dopo basso altopiano. Per l'altopiano di basso, l'ipossia severa ([] = 0,6 mg/L) con controllo o ciclismo pH è indicato con una linea nera spessa, lieve ipossia ([] = 1,7 mg/L) con ciclismo pH con una sottile linea grigia e normoxia ([] = 7,3 mg/L) con una linea tratteggiata. Caselle grigie indicano intervalli scuri 10-h in due giorni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Per creare diel ciclismo ipossia, regolare [DO] nel corso di una giornata in quattro fasi consecutive dove [DO] è mantenuta costante: soprasaturazione 2h, 6h normoxia dopo soprasaturazione, 4h basso altopiano (normoxia nel caso i controlli) e normoxia 2 h dopo il basso fasi di Plateau.
- Durante la fase di plateau basso, mantenere il trattamento di condizioni di normossia costante a un [DO] di 7,3 mg/L, la costante lievemente ipossico trattamento presso un [DO] di 1,7 mg/L e la costante di ipossia severa trattamenti presso un [DO] di 0,6 mg/L.
- Per ipossia severa, eseguire due trattamenti di pH durante il basso altopiano, cioè, l'ipossia severa con pH di controllo in cui il pH viene mantenuto al 7,8 e l'ipossia severa con ciclica pH dove il pH viene avviato da 7,8 a 7.0 durante il plateau basso. Eseguire il trattamento leggermente ipossico con ciclica pH dove il pH è pedalato da 7,8 a 7.0. Eseguire un secondo trattamento leggermente ipossico con pH costante se lo si desidera.
5. lavorazione in rampa su/giù di [DO] tra le varie fasi di Plateau
- Pianificare la rampa verso l'alto o verso il basso di [DO] tra le quattro fasi costante di prendere 2 h ciascuna, tranne per la rampa verso il basso da normoxia dopo soprasaturazione alla fase basso altopiano, che prende spesso h. 3, ipossia è stato trovato per accadere in ritardo nelle ore di notte o la mattina presto nel estate7,8; quindi, mantenere la fase di plateau basso nel buio, così come i periodi in rampa fino ad esso o fino da esso, per una lunghezza totale di oscurità di 10 h.
- Ripetere ipossia diel-ciclismo 4-5 giorni una settimana61.
- Aggiungere le ostriche con sensori in fase di ramp-up di prima soprasaturazione e rimuoverli, dopo la loro chiusura, due giorni più tardi quindi sperimentare due cicli completi diel (Figura 2) con sensori collegati.
6. rendere il cavo del sensore
Figura 3 . Sensore valvola di bivalvi SGM estensimetrico. (a) sensore estensimetrico, strain-gauge (b) collegato a un'ostrica mostrando un ciclo del ceppo calibro tra entrambe le valvole, (c) strain-gauge sensore montato su un'ostrica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Costruire i cavi dei sensori di gape valvola ruotando due 32 AWG (7/40) cavi (Vedi Tabella materiali) di colore (Figura 3un) desiderato. Tagli una lunghezza del filo due volte la lunghezza del cavo del sensore desiderato gape, vale a dire, due volte la lunghezza dall'acquario per la SGM più un piccolo extra.
- Avere due persone stand di fronte a vicenda, ogni azienda un'estremità del cavo.
- Spingere la maniglia di un paio di forbici sopra il cavo in modo che al centro del cavo un paio di forbici è detenuto dal cavo. Tenere il cavo sotto tensione a tutte le ore (non può andare lento).
- Sono entrambi persone torcere il cavo nella direzione opposta, mantenendo il cavo sotto tensione. Come il cavo inizia a ruotare, il paio di forbici nel mezzo (che fornisce il peso) affonderà, ed entrambe le estremità del cavo possono ruotare intorno a vicenda.
- Mettere insieme le due estremità del cavo e tenerli in alto, non permettendo le forbici con il cavo per toccare la terra o andare slack. Al termine del cavo di torsione, tagliare il cavo su altra estremità, quindi ci sono 4 cavo conduce totale, due su ciascuna estremità.
- In alternativa, per velocizzare questo passaggio, sono una persona tenere un trapano con i fili bloccati in su un'estremità, mantenere la tensione sui cavi e attorcigliare i fili accendendo il trapano.
- Fascia di 2 cm di isolamento dai fili ad ogni estremità del doppino.
7. il sensore di saldatura
- Stagno del cavo esposto.
- Pretinning i perni e inserendo i cavi di saldatura pin Dsub connettore maschio a crimpare i due conduttori su un'estremità del cavo del sensore.
- Quindi, è possibile isolare i cavi mettendo termorestringente sopra ogni cavo. Scegliere che la tubazione degli strizzacervelli non sono molto più grande di diametro i conduttori del cavo. Compattare il termorestringente con una pistola termica. Il tubazione degli strizzacervelli ora dovrebbero essere strettamente avvolto intorno i cavi.
Nota: Questi due cavi ottenere collegati il ponte di Wheatstone durante gli esperimenti. - Saldare l'altro terminale del cavo del sensore per i due contatti di un ceppo di 1000 Ω gauge con dimensioni di griglie di 13,5 mm * 5.5 mm su due rimanenti conduce (Figura 3a).
- Aggiungi un sensore di identificazione tag per il cavo del sensore (Figura 3a).
8. il sensore di tenuta
Nota: Gli estensimetri corrodono rapidamente in acqua di mare e così deve essere molto ben sigillati. La qualità del sigillo influisce la vita utile del sensore.
- Sigillare gli estensimetri allegandoli al PCT-2A nastro lasciando 15 mm di nastro alle estremità lunga e 2 mm sui lati del sensore (Figura 3a). Dopo il collegamento nastro PCT-2A per la parte inferiore dell'estensimetro, Aggiungi gel di rapida sui cavi del sensore e l'annesso estremità aperte dei cavi.
- Collegare un secondo pezzo di nastro di PCT-2A della stessa dimensione come il pezzo inferiore al lato superiore del sensore e collegare insieme due pezzi di nastro con l'estensimetro nel mezzo. Non permettono il gel rapido al flusso in qualsiasi punto diverso da quello sopra i cavi e i cavi del sensore.
- Per migliorare la tenuta, è necessario aggiungere sottili strisce di nastro PCT-2A ai bordi dove si incontrano i due pezzi di nastro che circonda il sensore. Fare questo per i tre bordi esposti dei sensori.
- Ripetere i passaggi da 6.1 a 8.4 undici volte per costruire 12 cavi dei sensori con sensori, uno per ogni canale sul ponte di Wheatstone.
Nota: Sigillatura di successo degli estensimetri era la variabile chiave bivalvi gape sensore sopravvivenza in acqua di mare e per la minimizzazione occasionali "salti" in uscita del sensore. Precedenti studi senza la tenuta tecnica sopra descritta ha provocato precoce corrosione sensore e successivo fallimento o rapida deriva oltre l'intervallo di misurazione. Miglioramenti futuri dovrebbero includere tecniche per migliorare la tenuta.
9. Fissare il sensore di Gape valvola per un Bivalve (Figura 3b, c)
- Rimuovere ostrica da diel-ciclismo Acquario di ipossia prima della fase di plateau basso.
- Con smalto scrivere un numero di identificazione sul guscio di ogni c. virginicapulito e asciutto.
- Fissare gli estensimetri sigillati alle valvole pulite e secche del live c. virginica (Figura 3b, c) con sigillante per acquario per consentire al sensore di essere rimosso dopo l'esecuzione. Fissare il sensore di gape con i cavi sulla valvola di destra (piatto) dell'ostrica circa a metà strada sul guscio (Figura 3c) e lasciare un ciclo di estensimetri (Figura 3b) attraverso le valvole per non ostacolare l'apertura delle valvole ( Figura 3b). Incollare l'estremità libera rimanente del sensore della valvola sinistra.
Nota: Le osservazioni confermano che le ostriche aprano loro valvole normalmente con i sensori nel posto. - Non importa quale modo attorno al sensore è incollato, tuttavia, la direzione del segnale verrà modificata se alcuni cavi sono incollati sopra la valvola di sinistra e alcuni sulla valvola di destra. La direzione del segnale diventa chiaro dalla chiusura forzata di bivalve alla fine di una corsa. Per tutti i bivalvi, incollare la parte di strain-gauge con il sensore porta sullo stesso lato della valvola per una direzione coerente di variazione del segnale di risposta gape.
- Durante ciascun passo del processo di sigillatura sensori e associandoli alle ostriche, controllare periodicamente la resistenza del sensore per assicurarsi che rimanga all'interno della gamma dell'elettronica di lettura e per controllare i danni potenziali sensore durante l'elaborazione.
- Collegare 12 ostriche a 12 sensori per riempire tutti i 12 canali della SGM.
- Aggiungere le ostriche diversi acquari appena prima della fase di plateau di sovrasaturazione.
10. installazione di Datalogger e Multiplexer per apparecchiatura di Gape della valvola
- Allegare un sensore per i molluschi bivalvi e quindi collegare il cavo alla SGM con ponti di Wheatstone individuali (Figura 1) per ogni sensore (un totale di 12 ponti) e collegato ad un datalogger.
- Impostare il data logger periodo campione di leggere una volta ogni 2,5 s e quindi una media di 15 s.
Nota: La memoria di campione 62 k il datalogger usato qui ammessi 12 h di funzionamento incustodito. Datalogger più grandi e più veloci tassi di campionamento possono essere selezionati, se lo si desidera. - Zero, il segnale di gape per ciascun sensore dopo applicato il sensore per un bivalve mediante il potenziometro si connette sulla SGM.
- Quando necessario, come più alta salinità, correggere ogni sensore periodicamente per drift in risposta del sensore in modo che il sensore rimane nella gamma della SGM (da -25 a + 25 mV) uscita del ponte di Wheatstone. La gamma SGM è stato scelto per la massima sensibilità tra il ponte di Wheatstone e l'ingresso del datalogger.
11. distribuzione di molluschi bivalvi con sensori di Gape in ipossia Diel-ciclismo
- Dopo l'acquario sigillante ha curato (ca 30 min) tornare i bivalvi in un secchio di detenzione ossigenato con flusso continuo di acqua per almeno 5 h per consentire il sigillante di acquario a lisciviare prima immersione nell'esperimento.
- Posizionare le ostriche negli acquari durante la fase di rampa verso l'altopiano di sovrasaturazione (SS) (Figura 2).
12. recupero di bivalvi con sensori Gape
- Quando si ripristina l'ostrica dall'acquario con diel-ciclismo hypoxiaat la fine del periodo di due giorni, è possibile utilizzare le dita per far scattare l'ostrica per chiudere e produrre un segnale di chiusura nella tensione del sensore. In questo modo, la direzione e l'intensità del segnale chiusura può essere registrati
- Definire l'ostrica come Apri, se il valore del sensore è maggiore di ½ del valore chiuso. Definire l'ostrica come chiusa se il valore del sensore è più piccolo di ½ il valore di chiusura.
Nota: Le ostriche orientale non aprono tanto a raggio intermedio.
13. linearizzazione della valvola crudo Gape dati
Nella figura 4. Linearizzazione dei dati grezzi gape di un'ostrica. (a) luce h 14: 10 h scuro fasi, (b) [DO] su un periodo di due giorni con periodi di ipossia severa ([fanno] 0,6 mg/L), (c) dati Raw gape tempo serie di un'ostrica. Drift lineare dei dati è causata dalla corrosione del sensore e deve essere rimosso in post-elaborazione, (d) gape serie temporali di dati dopo la post-elaborazione, tempo reale approssimativa (e) . Per determinare la grandezza e la direzione di chiusura spike, l'ostrica viene attivato per chiudere alla fine di una corsa. Grandezze variano tra i diversi sensori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Visivamente identificare oyster gape attività e utilizzare il chiuso (o aprire, se uno è più lungo) fasi di bivalvi per determinare la direzione dello strumento. Utilizzare istruzioni IF nel software del foglio elettronico per selezionare i valori chiusi con uno ed aprire valori con zero (ad es., = se (Cell > 5, 1 (vero), 0 (false))).
- Rimuovere le fasi più breve ed eseguire una regressione lineare sui dati raw rimanenti. Utilizzare l'equazione di regressione per linearizzare i dati sperimentali (Figura 4). Linearizzazione deve essere fatto individualmente per ciascun sensore.
Nota: Deriva del sensore è lineare per breve (minuti) e molto tempo di (giorni) scale e la quantità di drift varia da sensore a sensore. Drift è in genere trascurabile negli intervalli di tempo breve ad esempio un'ora, in cui solo occasionalmente deriva lineare è stato notato. Deriva del sensore richiede che calibrazioni di gape valvola e gape sensore devono essere fatto separatamente per ogni sensore e che una linearizzazione deve essere fatto per ogni sensore in post-processing dei dati.
14. calibrazione dei sensori: Gape effettiva larghezza rispetto al sensore mV
In un esperimento di lato, tensione del sensore può essere calibrato alla larghezza effettiva gape di ostriche.
- In un acquario, impostare un'ostrica con un sensore di gape. Avviare la registrazione di gape. Innescare l'ostrica per chiudere toccandola. Poco dopo, l'ostrica si aprirà nuovamente.
- Come l'ostrica è l'apertura, scattare fotografie e annotare la tensione del sensore dell'apparato gape ogni volta che viene scattata una fotografia. Tenere traccia di quali fotografia va con quale lettura apparato gape. Posto una scala di riferimento nella fotografia, allo stesso livello delle valvole.
- Analizzare la distanza l'ostrica è aperto in ogni fotografia (mm) utilizzando un programma di elaborazione di immagine open source quali ImageJ.
- Confronta gape effettiva larghezza di tensione del sensore ed eseguire un'analisi di regressione. Questo dà la calibrazione per lo stato di effettiva apertura e ulteriori misure di sensore quindi possono essere correlate a gape effettiva larghezza del bivalve.
Nota: Mentre questo dimostra gape larghezza è linearmente relativo a tensione del sensore, in realtà, questo processo richiede troppo tempo e non è stato eseguito per gli esperimenti di gape di ipossia. Per gli esperimenti di gape ipossia era importante rimuovere le ostriche per la minor quantità di tempo necessario da loro acquari a dotarli di sensori e restituirli per gli acquari. Per alcuni esperimenti, la misura della larghezza di gape può essere importante e le tecniche di calibrazione sopra devono essere seguite.
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Representative Results
Ostriche esposte all'acqua di estuario normoxic ininterrotta (senza ipossia durante la fase di plateau basso del ciclo giornaliero) sono stati aperte la maggior parte del tempo e soltanto brevemente chiuso raramente (Figura 5). Quando hanno chiuso varia da ostrica di ostrica. Questo modello è stato trovato anche da Loosanoff e Nomejko 194644 e Higgins 198039. Ostriche, inoltre, non hanno risposto alla differenza nelle fasi di chiaro e scure.
Figura 5 . (a-g) Un sottoinsieme di gape risposte di sette ostriche esposte a (h) due giorni di normoxia ([] = 7,3 mg/L) in alcuni casi, chiudere ogni ostrica con un modello diverso. Tempo di notte simulata è indicato nelle barre nere, simulate tempo giorno con barre bianche. Questa figura è stata modificata da Porter e 2016 Breitburg63. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La maggior parte delle ostriche esposte ad ipossia severa ([] = 0,6 mg/L) durante il plateau basso fase durante l'ipossia diel-ciclismo chiuso poco dopo è stato raggiunto l'obiettivo [DO], ed alcune ostriche anche chiusi prima della destinazione [DO] è stato raggiunto e rimase chiuso per la maggior parte del tempo che l'ipossia severa continuato (Figura 6). Controllo e pH ciclico non ha colpito gape.
Nella figura 6. (a-g) Un sottoinsieme delle risposte di gape di sette ostriche esposte a (h) due giorni di ciclismo diel ipossia con ipossia severa ([] = 0,6 mg/L) durante la fase di plateau basso. Tempo di notte simulata è indicato nelle barre nere, simulate tempo giorno con barre bianche. Questa figura è stata modificata da Porter e 2016 Breitburg63. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Con lieve ipossia ([] = 1,7 mg/L), chiusure spesso si è verificato più tardi durante la fase di plateau basso anziché al punto quando obiettivo [DO] è stato raggiunto (Figura 7).
Nella figura 7. (a-g) Un sottoinsieme delle risposte di gape di sette ostriche esposte a (h) due giorni di ciclismo diel ipossia con lieve ipossia ([] = 1,7 mg/L) durante la fase di plateau basso. Tempo di notte simulata è indicato nelle barre nere, simulate tempo giorno con barre bianche. In c, e, g ("no data") è stata interrotta l'alimentazione. Questa figura è stata modificata da Porter e 2016 Breitburg63. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Durante la fase di basso altopiano con vario [DO], ostriche sotto severa ([] = 0,6 mg/L) diel-ciclismo ipossia con pH di controllo (pH = 7,8) così come ciclico pH (pH = 7.8–7.0) erano chiusi significativamente più lungamente di ostriche sotto normoxia (7,3 mg / L). Non c'erano differenze significative nella quantità di chiusure tra il controllo ed il ciclico pH sotto ipossia severa. Le ostriche sotto lieve ([] = 1,7 mg/L) diel-ciclismo ipossia erano chiusi simili quantità di tempo durante il plateau basso come ostriche sotto ipossia severa con controllo pH o pH ciclica. Inoltre, le ostriche sotto lieve ipossia diel-ciclismo erano chiusi una simile quantità di tempo come le ostriche sotto normoxia durante la fase di plateau basso. Non c'erano differenze significative nella quantità di chiusure tra il controllo ed il ciclico pH sotto ipossia severa in una qualsiasi delle fasi.
Durante la fase di normoxia dopo l'altopiano basso, ostriche che ha avvertito l'ipossia severa durante il plateau basso erano aperte la maggior parte del tempo (Figura 8) e hanno spesso aperto mentre [DO] livelli erano dilagare, anche prima che fosse raggiunto l'altopiano di normoxia ( Figura 6). Durante la soprasaturazione e il normoxia dopo fasi di sovrasaturazione, rispettivamente, le ostriche di tutti i trattamenti erano aperte la maggior parte del tempo. Le ostriche hanno mostrato questi modelli sopra diel ripetuti cicli nell'arco di due giorni di tempo.
Figura 8. Percentuale di tempo ostriche erano chiusi durante il plateau (a) basso, (b) normoxia dopo il basso altopiano e la soprasaturazione (c) (d) normoxia dopo suspersaturation fasi durante il diel ciclismo di [DO]. Durante la fase di plateau basso in (a): "0.6, ciclica" = [DO] di 0,6 mg/L (l'ipossia severa), ciclico pH (pH = 7.8–7.0) (n = 4); "0,6, controllo" = [DO] di 0,6 mg/L (l'ipossia severa), controllo pH (pH = 7,8) (n = 4); "1.7, ciclica" = [DO] di 1,7 mg/L (lieve ipossia), ciclico pH (pH = 7.8–7.0) (n = 4); "controllo, controllo" = [DO] di 7,3 mg (normoxia), controllo pH (pH = 7,8) (n = 4). Le differenze statistiche sono indicate da lettere differenti sopra le barre (Nested ANOVA, p≤ 0,05). Barre di errore sono errori standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Durante la fase di plateau basso, 1/3 o più ostriche dall'ipossia severa, pH ciclici sono stati chiusi il 70% del tempo e ostriche da ipossia severa, controllano pH erano chiuso 49% del tempo (Figura 9). Al contrario, durante la fase di plateau basso, 1/3 o più ostriche dal delicato pH ciclico hypoxic erano chiuso 29% del tempo e dal trattamento normoxic controllo pH 12% del tempo. La maggior parte delle ostriche che chiuso simultaneamente durante la fase di plateau basso, erano 82% e 67% delle ostriche in ipossia severa, pH ciclico e l'ipossia severa, controllano trattamenti pH, rispettivamente. Nel delicato pH hypoxic, ciclico trattamento, un massimo del 45% delle ostriche chiuse durante il plateau basso e ostriche esposto al solo normoxia un massimo di 42% brevemente chiusi contemporaneamente. In normoxia dopo l'altopiano di basso, la sovrasaturazione e il normoxia dopo soprasaturazione, raramente più di 1/3 di ostriche chiuso in qualsiasi momento.
Figura 9 . Per cento delle ostriche chiuso allo stesso tempo durante il plateau basso, normoxia dopo basso altopiano, soprasaturazione e normoxia dopo fasi di supersaturazione raffiguratoFigura 2. Per (a), l'altopiano di basso era gravemente ipossica ([] = 0,6 mg/L) e aveva ciclico pH (pH = 7.8–7.0) (n = 13 ostriche). Per (b), l'altopiano di basso era lievemente ipossico ([] = 1,7 mg/L) e aveva ciclico pH (pH = 7.8–7.0) (n = 11 ostriche). Per (c), l'altopiano di basso era gravemente ipossica ([] = 0,6 mg/L) ed ha avuto controllo pH (pH = 7,8) (n = 11 ostriche). (D), la fase di plateau basso era normoxic ([] = 7,3 mg/L) (n = 11 ostriche). Linea orizzontale raffigura dove un terzo delle ostriche erano chiusi contemporaneamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Larghezza di gape è linearmente relativo a sensore mV (Figura 10). La direzione che il sensore è incollato sulla valvola determina la direzione del segnale.
Figura 10 . Calibrazioni di tensione del sensore gape gape effettiva larghezza delle ostriche. (a, b) Gape sensore porta apposta per la valvola destra delle ostriche, sensore gape (c, d) conduce apposto alla valvola di sinistra. Per coerenza nella direzione della risposta, i sensori devono essere apposta nella stessa direzione valvola di ogni ostrica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Focus tipici studi su continuo, estesi periodi di condizioni di bassa dell'ossigeno e la risposta, spesso misurata come la sopravvivenza, degli animali. Tuttavia, allo stato attuale, la nostra comprensione delle risposte comportamentali degli animali all'ipossia diel-ciclismo è minimo63. Quindi, ulteriori studi dovrebbero concentrarsi sul comportamento degli organismi in risposta all'ipossia diel-escursioni in bicicletta, che si verifica regolarmente durante l'estate in molti estuari7,8.
Qui, presentiamo un metodo di misurazione continuamente le risposte comportamentali di bivalvi al diel-ciclismo ipossia e pH ciclica. Le ostriche non hanno risposto comportamentale al diel-ciclismo di pH. Tuttavia, le ostriche ha risposto fortemente a condizioni di ossigeno basso riducendo notevolmente gape shell. Inoltre, più di un terzo delle ostriche chiuso contemporaneamente per lunghi periodi di tempo sotto il trattamento ipossico ma più aperto nuovamente sotto la fase normoxic che seguirono. Aumentando gape e riducendo la chiusura delle valvole per compensare per esteso volte della valvola di chiusura durante l'ipossia severa potrebbe ridurre gli effetti dell'ipossia diel-ciclismo sulle ostriche se stessi e il fitoplancton filtrano. Pertanto, tale compensazione comportamentale potrebbe ridurre al minimo cibo web o effetti sull'ecosistema.
Un passaggio fondamentale in questo metodo SGM è di sigillare correttamente il sensore gape. Se il sensore non è adeguatamente sigillato, con acqua di mare può raggiungere l'estensimetro, aumentare deriva e alla fine rendere inutilizzabile. 29 sensori sono stati distribuiti nel corso di un esperimento di mesocosmo Bergeron (2005)64 e valutata la quantità di tempo che hanno funzionato. I sensori più longevo ha funzionato per più di 16 d, quando l'esperimento è stato terminato. Il breve lasso di tempo che è durato un sensore: 0,5 d. La lunghezza media della distribuzione di successo sensore era 4,9 ± 3,0 giorni, che comprende i sensori che sono stati terminati all'inizio. Maggior parte dei sensori hanno funzionato sopra la distribuzione di due giorni nel diel-ciclismo esperimento di ipossia.
La durata dei sensori deve essere migliorata, anche se il dispositivo corrente è adatto a molte applicazioni. Il sigillante acquario contiene acido acetico che possono aumentare la corrosione nei sensori. In futuro, deve essere utilizzato il silicone RTV grado di elettronica non acida. Questo può anche evitare la deriva lineare che è stato trovato e che ha dovuto essere rimosso in post-elaborazione. Allo stato attuale, si consiglia di costruire un nuovo sensore per ogni gape eseguire.
Una limitazione presente è che la SGM è stato utilizzato solo in un ambiente di laboratorio e i cavi dei sensori devono essere fatte sufficientemente lungo per raggiungere i vari acquari. Un'altra limitazione del metodo è che analisi non vengono eseguiti automaticamente e devono essere eseguite a mano e la deriva lineare deve essere corretto individualmente. Se lo spazio effettivo gape del bivalve deve essere misurato, ogni sensore deve essere calibrato singolarmente, come la grandezza del segnale varia da sensore a sensore. È importante alla fine di una corsa per innescare il bivalve per ottenere vicino alla grandezza e la direzione di chiusura spike. Se gape è misurata nel campo, condizioni ambientali avverse, quali i periodi di condizioni di ossigeno basso possono essere rilevate monitorando i bivalvi utilizzando la SGM e rilevare quando più di un terzo chiudere contemporaneamente.
Prima del Porter e Breitburg (2016)63, gape valvola non era stato misurato su bivalvi esposti ad ipossia diel-escursioni in bicicletta. Tuttavia, varie tecniche disponibili per misurare gape valvola. Un vantaggio di questa tecnica è che è molto costoso e non necessita di linea diretta di vista per i molluschi bivalvi. Costi ricorrenti sono solo i costi per gli estensimetri. Il sistema può anche essere fatto distribuibili nel campo ospitando il ponte di Wheatstone e datalogger in un alloggiamento impermeabile per essere rimosse periodicamente per scaricare i dati. I bivalvi sarebbero essere alloggiati in un vano bagnato.
Dimostriamo le risposte di gape valvola significativo delle ostriche alla ipossia diel-ciclismo e dimostrare che le ostriche non rispondono ai cambiamenti ciclici in pH. Lavori futuri dovrebbero concentrarsi sulla migliore tenuta del sensore per ulteriormente ridurre guasto sensore iniziale e deriva possibilmente usando nastro adesivo flessibile calore-si fondono come in Jou et al. (2013) 57 e utilizzando silicone RTV grado elettronico privo di acidi. Gli studi futuri dovrebbero misurare la risposta di gape valvola di altre specie di bivalvi all'ipossia diel-escursioni in bicicletta e anche esaminare l'effetto di limitazione di ipossia e cibo diel-ciclismo sul comportamento gape valvola. È noto che bivalvi chiudono in risposta alle concentrazioni basse cibo ma non è stato esaminato l'interazione tra diel-ciclismo ipossia e concentrazione di cibo.
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Disclosures
Non abbiamo niente di divulgare.
Acknowledgments
Si ringrazia Melinda Forseth per scattare foto di ostriche e misurando la loro larghezza di gape in ImageJ. Ringraziamo Denise Breitburg per l'accesso per gli acquari con diel ciclismo ipossia e condizioni di pH ciclica. Si ringrazia il centro di ricerca ambientale Smithsonian, Edgewater, Maryland, per lo spazio per gli esperimenti. Gli esperimenti di ipossia sono stati finanziati da un National Oceanic and Atmospheric Administration - Center per sponsorizzato Coastal Ocean Research grant No. NA10NOS4780138 e il fondo di Hunterdon Smithsonian a Denise Breitburg. La valvola gape misurazioni durante l'ipossia esperimenti erano finanziati da una sovvenzione di potenziamento di facoltà di Washington College di Elka T. Porter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Campbell CR 10x data logger | Campbell Scientific, Logan, Utah | Or other data logger. At Campbell the CR 10X has been replaced with the CR 1000 | |
| Campbell CR 10x multiplexer | Campbell Scientific, Logan, Utah | Data logger needs to have space for 12 channels | |
| Dsub connector male crimp pins | TE Connectivity | 205089-1 | pins for gape sensor leads |
| PCA tape | Micro Measurements Corp, NC | To seal the strain gauge | |
| Duro Quick Gel | Ace Hardware | Superglue | |
| SG13/1000-LY43 or LY41 | Omega Engineering Inc., Stanford, CT | Strain gauges | |
| 32 AWG (7/40) teflon Alpha wires | AlphaWire, Elizabeth, NJ | 2840/7 | Sensor cables, different colors are available |
| 1/16" heat shrink tubing | Qualtek | B01A3QKKO6 | To seal the leads of the sensor cable |
| Weller WES51 Analog Soldering Station | Amazon | Lots of soldering, need a good soldering iron. https://www.amazon.com/Weller-WES51-Analog-Soldering-Station/dp/B000BRC2XU/ref=sr_1_23?s=hi&ie=UTF8&qid=1505654295 &sr=1-23&keywords=soldering+iron |
|
| Rosin Soldering Flux Paste | Amazon | Needed for soldering | |
| 60-40 Tin Lead Rosin Core Solder Wire | Amazon | Needed for soldering | |
| Aquarium sealant | Home Depot | Attach sensors to bivalve | |
| PC Laptop | Any old PC to run Campbell gape program | ||
| heat gun | Amazon | shrink shrink tubing | |
| Drill | Hardware store, Amazon | for twisting wires to make sensor cables | |
| AC to DC power module | Acopian | DB15-30 | Wheatstone bridge power supply |
| Poteniometer | Clarostat | 733A | Wheatsone bridge nulling |
| isolating BNC connector | Sterren Electronics | "200-148 | Wheatstone bridge output for multimeter |
| Fused AC receptical panel module | Adam technologies | IEC-GS-1-200 | Wheatstone bridge power supply connector |
| 976 ohm 1% resistor | Vishay Dale | CMF50976R00FHEB | Wheatstone bridge resistor |
| 1 kohm 1% resistor | Vishay Dale | CMF501K0000FHEB | Wheatstone bridge resistor |
| Potentiometer scale dial | Kilo International | 462 | 10 turn dial for nulling potentiometer |
| DB25 male panel connector | TE connectivity | 1757819-8 | Data logger connector on Wheatstone bridge |
| DB25 female panel connector | TE connectivity | 1757819-8 | Sensor connector to Wheatstone bridge |
| perforated circuit board | Vector electronics | 64P44WE | circuit board for mounting of bridge components |
| enclosure | Hammond Manufacturing | 1444-29 | Enclosure for sensor readout electronics |
References
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