Summary
ここでは、分岐の形態形成および末梢神経、血管、免疫細胞分布のパターンを視覚化することを可能にする全体の大人マウス耳介皮膚に高解像度全体マウント画像処理手法について述べる。
Abstract
ここでは、包括的な三次元神経血管の分岐形態形成、パターニング、細胞レベルでの免疫細胞の分布を研究するイメージング全体マウント大人の耳皮のプロトコルを提案します。成体組織の末梢神経や血管の解剖学的構造の解析は、神経血管機能の配線と創傷治癒など病態における神経血管変性の理解にいくつかの洞察を提供します。非常に有益なモデル システムとして解離しやすく、大人の耳の皮膚に私たちの研究をしました。私たちのシンプルで再現性のあるプロトコルが全身の皮膚、末梢神経 (感覚軸索、交感神経の軸索とシュワン細胞) など血管 (血管内皮細胞と血管平滑筋細胞の細胞内成分の正確な描写を提供します)、および炎症性細胞。このプロトコルは異なる病態下大人の耳の皮膚の炎症だけでなく、末梢神経や血管の形態異常を調査する道を開くだろうと考えています。
Introduction
皮膚は 3 つの層で構成されています: 表皮、真皮および皮下。それは、研究開発と同様に再生、腫瘍、および大人の炎症の形態形成、分化、幹細胞維持にモデル システムとして使用されています。皮膚はさまざまな血管や末梢神経系と血管系の開発がとれたように支配されています。
以前そのままの末梢神経や血管、細胞成分1,2,3,を含む研究に複数付け全体マウント胚皮膚イメージングを実現しました。4: 感覚軸索、交感神経の軸索、シュワン神経細胞、内皮細胞、周、血管での血管平滑筋細胞 (VSMCs)。血管新生、中にプライマリ毛細血管網は集中血管リモデリングを受け、階層型血管分岐ネットワークに発展します。発展途上の真皮・皮下、動脈末梢感覚神経と静脈と一緒に分岐し、動脈に隣接して形成します。階層型の血管のネットワークは、VSMCs で覆われて徹底的に、交感神経に沿って延びるし、大径血管1,5,6を支配します。密接に関連開発神経系と血管系の意義、にもかかわらず主要な質問は大人でさまざまな病的状況で神経・血管のネットワークはどう対処してきました。三次元高分解能イメージングは、解剖学的に認識可能な形態とパターニングの病因を理解する必要です。
アダルト マウス皮膚の神経と血管の形態形成をよくティッシュ セクションの汚損によって解析しました。他の研究は、末梢神経、毛包、皮脂腺、arrector pili 筋肉7,8,9に加えて、血管を可視化するのに皮膚の全体マウント画像を使用しています。ただし、成人の皮膚の厚さは、その全体の深さで皮膚を分析することは困難が。
本研究では、大人の耳皮膚これらの課題を克服するための新高解像度全取り付けるイメージングを開発しました。耳の皮膚はその全体の深さを郭清と皮膚の後続の全体マウント イメージングの容易にアクセス可能です。したがって、包括的な定量化測定で、皮膚の末梢神経系と血管系の三次元のアーキテクチャを比較に適用することができます簡単で再現性の高い方法です。大人の肌に大径血管と末梢の感覚と交感神経神経の配置が保持されることを行った。このプロトコルの目標分岐の形態形成と末梢神経、血管、炎症など様々 な条件下で成体マウス モデルにおける細胞レベルでの免疫細胞の分布のパターンを視覚化することですし、再生。
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Protocol
このセクションのすべての実験は、国立心臓、肺および血の協会 (NHLBI) 動物のケアおよび使用委員会の承認の下で行った。
1. アダルト マウス耳皮膚コレクション
- 密閉室内の二酸化炭素 (CO2) 暴露による成体を安楽死させるし、頚部転位による安楽死を確認します。
注: 実験安楽死法の国立衛生研究所 (NIH) のガイドラインに従った。 - ベースから耳を解剖し、2 mL のハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) を含むシャーレ 35 x 10 mm2に配置。簡単にハサミで毛をトリミングします。
- 後部の皮膚と、介在する軟骨から慎重に離れて前方の皮膚の皮をむきます。
注: 軟骨は前方の皮膚に付着します。 - 後部を転送やよく 24 に分けて前方皮膚板含む 1 mL 冷たい新鮮な 4% パラホルムアルデヒド (PFA) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ウェルあたりで。4% の後部と前部の皮膚を平らにする PFA。
- 1 h の 4 ° C で軟骨の後部と前部の皮膚を修正します。
- 穏やかな室温でミキサーの混合 1 mL の PBS で 3 時間 5 分の後部と前部の皮膚を洗浄します。
- 軟骨の後部と前部の皮膚をシャーレ 35 x 10 mm2の下部に転送します。折り畳まれ、脂肪や結合組織を持っているベースの領域を遮断します。良いカーブタイプ鉗子を使用して前方の皮膚から軟骨をはがします。
- 高級ピンセットを使用して後部の皮膚の内側から毛、脂肪組織や結合組織を注意深く取り外します。PBS に濡れた肌を保ちます。
2. ホール マウント免疫組織染色マウス耳介皮膚
注: NIH 研究所安全ガイドラインに従って次のセクションですべての実験を行った。
- ブロックのバッファーを準備します。0.2% triton X-100 (テキサス州-100) ブロック バッファーのフィルター 10% 熱不活化ヤギ血清 (HIGS) PBS で希釈または 0.45 μ m のフィルター ユニットを使用してテキサス州 100 ブロック バッファー 0.2% で PBS で希釈した 10% ロバ血清 (DS)。
- 後部を転送し、前方の皮膚の 24 ウェル プレート含む 1 mL の 10 %higs ブロック バッファーかウェルあたり 10 %ds ブロック バッファー。室温でのミキサーで穏やかな混合と 30 分のため皮膚を孵化させなさい。
- 一次抗体 (材料表) ブロック バッファーで希釈することによって一次抗体溶液を調製 (いずれか 10% HIGS 10 %ds)。
注: 全体 mout 免疫組織化学的解析パン神経マーカー ニューロン固有クラス III β-チューブリン抗体による大人の耳の皮膚の (Tuj1、ウサギ ポリクローナル IgG またはマウス monocloncal igg2a 産、2 μ G/ml の最終濃度 1: 500 希釈)パン血管内皮細胞マーカー血小板内皮細胞接着分子 1 (PECAM-1、ハムスター モノクローナル IgG、1: 300 3.3 μ G/ml の最終濃度に希釈)、髄鞘マーカー ミエリン塩基性タンパク質 (MBP、ウサギ ポリクローナル IgG、1: 200 で希釈、最終濃度 5 μ G/ml) と炎症性の骨髄球系細胞マーカー CD11b (ラット モノクローナル IgG2b, 1:50 最終 20 μ G/ml の濃度で希釈)図 1と図 2に示した。皮膚は血管平滑筋細胞マーカー α 平滑筋アクチン (αSMA) 二次抗体 (2.6) と共に、Cy3 標識抗体とインキュベートだった。自分でテストした一次抗体は、材料表に記載されました。種から派生した複数の一次抗体を同時に混合することができます。 - 後方と前方の皮膚を一次抗体溶液 150 μ L を含む新しい井戸に転送します。一晩に 4 ° C でミキサー穏やかな混合肌を孵化させなさい。
- 次の日に 24 well プレートに新しい井戸を後部と前部の皮膚を転送または一次抗体を含むブロック バッファーを吸引します。PBS 0.2% テキサス州 100 洗浄バッファーまたは 2% 0.2% テキサス州 100 洗浄バッファーで PBS で希釈した DS で HIGS 希釈いずれか 2 %1 mL を追加します。洗浄液室温でミキサーで穏やかな混合と 15 分毎の 3 変化で皮膚を洗ってください。
- 二次抗体の解決 (資材表) を準備します。ブロック バッファー内の二次抗体を希釈 (いずれか 10% HIGS 10 %ds) と 0.22 μ m ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜シリンジ フィルターを通して二次抗体を含むブロックのバッファーを 1 mL の注射器に接続されているフィルター。
注: Alexa 488 または 633 共役ヤギ抗うさぎ IgG (H + L) マウス IgG2a PECAM 1、アレクサ 488 標識ヤギ抗ウサギ IgG (H + L)、MBP のための Alexa 647 標識ヤギ抗ハムスター IgG (H + L) Tuj1 や Alexa 594 共役ラット IgG (H + L) CD11b のために使用されました。1: 250 最終 8 μ G/ml の濃度で希釈。皮膚は、Cy3 共役 αSMA 抗体 (最終濃度 2 〜 3 μ g/mL で希釈 1: 500) の組み合わせでこれらの二次抗体とインキュベートだった。 - ブロック バッファーから二次抗体の粒子を削除する 10 分 13,000 x g で溶液を遠心します。
注: 種から派生した異なる蛍光共役二次抗体を同時に混合することができます。 - まあ二次抗体溶液 150 μ L を含む後部と前部の皮膚に転送します。光を避けるために、1 時間室温でミキサーに穏やかな混合肌をインキュベートするアルミ箔で 24 well プレートをラップします。
- 24 well プレートに新しい井戸を後部と前部の皮膚を転送したり完全にピペットで二次抗体溶液を吸引します。2 %higs 洗浄液または 2 %ds 洗浄液の 1 mL を追加します。
- 24 well プレートをアルミ箔で包むし、洗う洗浄バッファーの 3 つの変更と室温でのミキサーで穏やかな混合と 15 分毎。
3. スライドの耳介皮膚をマウント
- 皮膚をシャーレ 35 x 10 mm2の下部に配置します。広汎な写真の漂白を最小限に抑える低照明顕微鏡下の微細カーブタイプ鉗子を使用して肌の内側から毛、脂肪組織、結合組織、粉塵、繊維を慎重に取り外します。PBS に濡れた肌を保ちます。
- 皮膚を鉗子を使用して剥離防止用スライドに転送します。内側の後部と前部の皮膚を置くスライド上を向いてします。鉗子を使用して皮膚を平らにします。
- 退色を避けるために、蛍光信号を保持液耐フェード取付中肌をマウントします。空気の泡に上または皮膚の周りされていないことを確認します。
- 皮膚サンプル coverslip 慎重にカバーし、メディアをマウントをしっかり得るように常温で暗い夜間にマウントされた皮膚サンプル スライドを保存します。マニキュアとスライドする coverslip を密封し、長期保存のための 4 ° C で保存します。
4. 共焦点顕微鏡
- Fluorophores の適切なレーザーを設定します。3 つのレーザー ソース (アルゴン 488 nm、DPSS 561 nm および HeNe 633 nm) と共焦点顕微鏡は、この実験で使用されます。
- 同時に避けるために、すべての重複を減らすのトリプル染色サンプルを興奮させる逐次スキャン ツールを使用します。
注: 画像は逐次スキャン モードを使用して連続的に行われます。 - 対物レンズ 10 倍の下のイメージ。タイルのスキャン ツールを使用して全体の耳介皮膚をキャプチャします。Z スタックを設定し、z 位置が耳の皮の全体の厚さをカバーするかどうかを確認します。
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Representative Results
成体マウス後部耳介皮膚 (図 1 a)、前耳介皮膚 (図 1 b) が αSMA (赤), Tuj1 (緑)、抗体 immunostained と PECAM-1 (青)。後部の皮膚だった CD11b (赤) と MBP (緑)、Tuj1 (青) と (図 2 a) に対する抗体を用いた神経免疫分布を研究する immunostained です。CD11b の分布+単一セルの解像度 (図 2 b) でマクロファージなどの炎症細胞が検出されました。
図 1: 配置末梢性ニューロパチーの神経や大人の耳の皮膚血管。全体マウント αSMA (赤), Tuj1 (緑) に対する抗体と後部と前部耳介皮膚のトリプル蛍光共焦点顕微鏡と PECAM 1 (青) が表示されます。(A) 細胞に覆われた大径血管に揃えて後部耳介皮膚末梢神経。(B) のより小さい直径前部耳介皮膚に小さい直径末梢神経束に揃えて血管 VSMCs で覆われています。スケール バー 1 mm =この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 髄鞘形成の末梢神経と CD11b+大人の耳の皮膚の分布を骨髄球系細胞。CD11b (赤) と MBP (緑)、Tuj1 (青)、一緒に抗体と後部耳介皮膚の全体マウント トリプル蛍光共焦点顕微鏡を示します。(A) 中型-大型直径末梢神経は有髄。(A) (B) のクローズ アップのイメージします。CD11b+後部耳介皮膚に均等に炎症性細胞。スケール バー = 1 mm (A)、(B) 100 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、大人の耳の皮膚神経血管構造と免疫細胞分布の分析のための全体マウント immunonohistochemical イメージングについて説明します。このメソッドは分岐の形態形成と末梢神経や血管のパターンだけでなく、免疫細胞と髪を含む皮膚成分の三次元分布を研究する研究者のための多くの実験的利点と考えています卵胞。さらに定量分析のためのイメージング ソフトウェアを使用してイメージングの結果を定量化することができます。
耳の皮膚の適切な準備は、このプロトコルの成功にとって重要です。まず、マウスを安楽死させる後すぐに耳介皮膚を慎重に解剖する必要があります。耳の皮膚の後部の部分は軟骨から剥離する必要があります。その後、軟骨は、染色前のプロセス前方の皮膚からを剥がす必要があります。第二に、結合組織、脂肪組織、および毛除去されるべき慎重かつ徹底的にマウントする前に。皮膚の表面に末梢神経が存在するため、神経の損傷を避けるために慎重に除去が必要です。第三に、耳介皮膚が耳の皮膚からいくつかの厚い組織の除去を 2 つ折りにする必要があります。最後に、耳の皮膚は、気泡なしフラット マウントする必要があります。
このプロトコルの制限の 1 つはタグ付きの耳の耳介皮膚が耳にタグは、穴や傷を原因として分析のため不適切であります。したがって、尾のラベル付けなど耳にタグ以外の異なる方法によるマウスの同定は、分析に複数のマウスがある場合必要です。
以前のレポートを示した関心領域を高解像度10と視覚化されることが全体の耳介皮膚をタイルのスキャン ツールでは、共焦点顕微鏡でスキャンできます。興味深いことに、全体の耳介皮膚全体マウント イメージング異なる分岐の形態形成と末梢神経の後部と前部の皮膚 (図 1) との間の血管パターンを明らかにする: 後部の皮膚は大径前方中神経束 (20-50 μ m) αSMA+ VSMCs (20-60 μ m) で覆われて改造された大径血管揃えて皮膚に直径の小さい神経束 (< 20 μ m) 小さい直径が改造された血管に揃えてαSMA+ VSMCs で覆われている (< 20 μ m)。
アトピー性皮膚炎12、13乾癬など皮膚科疾患のメカニズムを解明、創傷治癒14, と糖尿病性神経障害15マウス モデル11の顕著な数があります。我々 は食餌誘導性肥満マウスの耳の皮膚にこのプロトコルを適用したし、糖尿病性神経障害16を勉強する糖尿病マウスを入力します。このプロトコルは、少年から各種病態における成体マウスの皮膚に適用できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
室管理ありがとう k. ギル、テクニカル サポート、j. ホーキンスとスタッフの国立機関の健康 (NIH) マウス ・ r ・ リードとの援助のための 50 の動物実験施設と行政支援のため f. Baldrey を構築します。その耳は解剖のプロトコルを皮膚、編集のヘルプ、および幹細胞研究室のメンバーのため N. やけどや技術的なヘルプと思慮深い議論の神経血管生物学を共有するための s. 茂木と m. Udey にも感謝。拓山崎は、科学振興 (JSPS) NIH 海徳の日本社会によって支えられました。この作品は、国立心臓、肺、血液研究所 (y. m. に HL005702-11) の学内研究プログラムによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-αSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III β-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-β-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
References
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