Summary
Her beskriver vi en høyoppløselig hele-mount bildebehandling metode i hele voksen mus øret huden, som gjør det mulig for oss å visualisere branching morphogenesis og mønstre av eksterne nerver og blodkar, samt immun celle distribusjon.
Abstract
Her presenterer vi en protokoll av en hel-mount voksen øre hud tenkelig teknikk for å studere omfattende tredimensjonale Nevro-vaskulær branching morphogenesis og mønstre, samt immun celle distribusjon på cellenivå. Analyse av eksterne nerve og blodkar anatomiske strukturer i voksen vev gir noen innsikt i forståelsen av funksjonelle Nevro-vaskulær ledninger og Nevro-vaskulær degenerasjon i patologiske tilstander som sårtilheling. Som et svært informativ modellsystem, har vi fokusert våre studier på voksen øre hud, som er lett tilgjengelig for disseksjon. Vår enkle og reproduserbar protokollen gir en nøyaktig gjengivelse av cellulære komponenter i hele huden, som eksterne nerver (sensoriske axons, sympatisk axons og Schwann celler), blodkar (endotelceller og vaskulær glatte muskelcellene ), og inflammatoriske celler. Vi tror denne protokollen vil bane vei å undersøke morfologiske avvik i eksterne nerver og blodårene og betennelse i voksen øret huden under ulike patologiske forhold.
Introduction
Huden består av tre lag: overhuden, dermis og epidermis. Det har blitt brukt som et modellsystem for å studere stamcelleforskningen vedlikehold, differensiering og morphogenesis i utvikling og regeneration, tumorigenesis og betennelse i voksen. Huden er rikt Stangeriaceae og innerveres slik at utviklingen av det perifere nervesystemet og vaskulære system er godt koordinert.
Vi har tidligere vist en tenkelig teknikk som helhet-mount embryonale huden med flere merking for å studere intakt perifere nerver og blodkar inkludert deres cellulære komponenter1,2,3, 4: sensoriske axons sympatisk axons, Schwann celler i nerver, endotelceller, pericytes og vaskulær glatt muskelceller (VSMCs) i blodkar. Under angiogenese, en primær capillary nettverket gjennomgår intensiv vaskulær remodeling og utvikler seg til en hierarkisk vaskulær forgrening nettverk. I utviklingsland dermis/epidermis, arterier gren perifere sensoriske nerver og årer og danne ved siden av arteries. Når hierarkisk vaskulære nettverket er grundig dekket med VSMCs, sympatiske nerver strekker seg og innervate stor-diameter blodkar1,5,6. Til tross for betydningen i nær tilknytning mellom de utvikle nervesystemet og vaskulære systemene er et viktig spørsmål å ta hva skjer til Nevro vaskulære nettverk i ulike patologisk situasjoner i voksne. En tredimensjonal høyoppløselige bilder er nødvendig å verdsette patogenesen, anatomisk gjenkjennelig branching morphogenesis og mønstre.
Neuronal og vascular morphogenesis i voksen mus huden er vanligvis analysert av vev delen flekker. Andre studier har brukt hele-mount avbilding av huden for å visualisere perifere nerver og blodkar, i tillegg til hårsekkene, talgkjertlene og arrector pili muskler7,8,9. Men har tykkelsen av voksen hud gjort det vanskelig å analysere huden over hele dybden.
Studien utviklet vi en roman høyoppløselig hele-mount avbilding av voksen øre hud å løse disse utfordringene. Øre hud er lett tilgjengelig for disseksjon og påfølgende hele-mount bildebehandling av huden over hele dybden. Således, det er en enkel og svært reproduserbar metode som kan brukes til å sammenligne tredimensjonale arkitektur av perifere nervesystemet og vaskulære systemer i huden, med omfattende kvantifisering målinger. Vi viste at justeringen av eksterne sensorisk og sympatiske nerver med stor-diameter blodkar opprettholdes i voksen huden. Målet med denne protokollen er å visualisere branching morphogenesis og mønstre av eksterne nerver og blodkar, samt immun celle fordelingen på cellenivå i voksen mus modeller i ulike forhold som betennelse og regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter i denne delen ble utført under godkjenning fra nasjonale hjerte, lunge, og blod Institute (NHLBI) Animal Care og bruk komiteen.
1. voksen mus øret Skin samling
- Euthanize voksen mus av karbondioksid (CO2) eksponering i et lukket kammer og Bekreft euthanasia av cervical forvridning.
Merk: Eksperimentet følger National Institutes of Health (NIH) retningslinjen for metoden euthanasia. - Dissekere øret fra basen og plassere den i en 35 x 10 mm2 Petriskål inneholder 2 mL av Hanks balansert Salt løsning (HBSS). Kort klippe hår med saks.
- Skrell bakre huden og fremre huden unna nøye fra mellomliggende brusk.
Merk: Brusk festes til fremre huden. - Overføre bakre og fremre huden separat til en 24 godt plate som inneholder 1 mL av iskalde frisk 4% paraformaldehyde (PFA) i fosfat bufret saltvann (PBS) per brønn. Flat bakre og fremre huden i 4% PFA.
- Fastsette bakre og fremre huden med brusk i 4 ° C i 1 time.
- Vask bakre og fremre huden 3 ganger i 5 min i 1 mL av PBS med mild blande på et blandebatteri ved romtemperatur.
- Overføre bakre og fremre huden med brusk til bunnen av en 35 x 10 mm2 Petriskål. Avskåret regionen base, som er brettet og har liggende under adipose og bindevev. Løsner brusk fra fremre huden ved hjelp av fine buet pinsett.
- Nøye fjerne hår, liggende under adipose vev og bindevev fra innsiden av bakre huden ved hjelp av fine buet pinsett. Holde huden våt med PBS.
2. hele-mount Immunohistochemical farging av musen øre hud
Merk: Alle eksperimentene nedenfor ble utført i henhold til NIH laboratorium sikkerhet veiledning.
- Forberede blokkerer bufferen. Filteret 10% varme inaktivert geit serum (HIGS) fortynnet i PBS med 0,2% triton X-100 (TX-100) blokkerer bufferen, eller 10% esel serum (DS) fortynnet i PBS med 0,2% TX-100 blokkerer buffer, bruker en 0,45 µm filter enhet.
- Overføre bakre og fremre huden til en 24 plate godt som inneholder 1 mL av 10% HIGS blokkerer buffer eller 10% DS blokkerer buffer per brønn. Inkuber huden for 30 min med mild blande på et blandebatteri ved romtemperatur.
- Forberede den primære antistoff-løsningen ved å fortynne primære antistoffer (Tabell for materiale) i blokkering buffer (enten 10% HIGS eller 10% DS).
Merk: Hele-mout immunohistochemical analyse av voksen øre hud med antistoffer til pan-nevrale markør Nevron-spesifikke klasse III β-tubulin (Tuj1, kanin polyklonale IgG eller mus monocloncal IgG2a, 1:500 fortynning på siste konsentrasjonen av 2 µg/mL), Pan-endothelial celle markør Platederivert endothelial celle vedheft molekyl 1 (PECAM-1, hamster monoklonale IgG, 1:300 fortynning på siste konsentrasjonen av 3.3 µg/mL), myelin-skjeden markør myelin basic protein (MBP, kanin polyklonale IgG, 1:200 fortynning på den siste konsentrasjon av 5 µg/mL) og provoserende myelogen celle markør CD11b (rotte monoklonalt IgG2b, 1:50 fortynning på siste konsentrasjonen av 20 µg/mL) ble vist i figur 1 og figur 2. Huden ble inkubert med Cy3-konjugerte antistoffer for vaskulær glatt muskel celle markør α glatt muskel utgangen (αSMA) sammen med sekundær antistoffer (2.6). Primære antistoffer testet av oss var oppført i Tabell for materiale. Flere primære antistoffer avledet fra ulike arter kan blandes samtidig. - Overføre bakre og fremre huden til ny brønn som inneholder 150 µL av primære antistoffer løsningen. Inkuber huden med mild blande på et blandebatteri på 4 ° C over natten.
- Overføre bakre og fremre huden til nye brønner i 24 godt platen eller Sug opp blokkering bufferen som inneholder primære antistoffer på dagen. Legge 1 mL av enten 2% HIGS fortynnet i PBS med 0,2% TX-100 vaske bufferen eller 2% DS fortynnet i PBS med 0,2% TX-100 vaske bufferen. Vask huden med 3 endringer vaske bufferen hvert 15 min med mild blande på et blandebatteri ved romtemperatur.
- Forberede den sekundære antistoff løsningen (Tabell for materiale). Fortynne sekundære antistoffer i blokkering bufferen (enten 10% HIGS eller 10% DS) og filter blokkerer bufferen som inneholder sekundære antistoffer gjennom et 0.22 µm polyvinylidene difluoride (PVDF) membran sprøyte filter koblet til en 1 mL sprøyte.
Merk: Alexa 488 eller 633-konjugerte geit anti-kanin IgG (H + L) eller mus IgG2a for Tuj1, Alexa 647-konjugerte geit anti-hamster IgG (H + L) for PECAM-1, Alexa 488-konjugerte geit anti-kaninen IgG (H + L) for MBP, og Alexa 594-konjugerte rotte IgG (H + L) for CD11b ble brukt med 1:250 fortynning på siste konsentrasjonen av 8 µg/mL. Huden ble inkubert med Cy3-konjugerte αSMA antistoff (1:500 fortynning på siste konsentrasjonen av 2-3 µg/mL) i kombinasjon med disse sekundære antistoffer. - Sentrifuge løsningen på 13000 x g i 10 min å fjerne oppsamlet partikler av sekundær antistoffer fra blokkerer bufferen.
Merk: Forskjellige fluorescerende konjugert sekundære antistoffer avledet fra ulike arter kan blandes samtidig. - Overføre bakre og fremre huden til godt inneholder 150 µL av sekundær antistoffer løsningen. Pakk 24 godt platen i aluminiumsfolie å unngå lys og ruge huden 1t med mild blande på et blandebatteri ved romtemperatur.
- Overføre bakre og fremre huden til nye brønner i 24 godt platen eller Sug opp den sekundære antistoff løsningen av Pipetter helt. Legg 1 mL av enten 2% HIGS vask buffer eller 2% DS vaske bufferen.
- Pakk 24 godt platen i aluminiumsfolie og vask med 3 endringer av vaske bufferen hvert 15 min med mild blande på et blandebatteri ved romtemperatur.
3. montering det øre hud på lysbildet
- Plass huden på bunnen av en 35 x 10 mm2 Petriskål. Nøye fjerne hår, liggende under adipose vev, bindevev, støv og fiber fra innsiden av huden med fine buet tang under stereomicroscope med lav belysning for å minimere omfattende bilde bleking. Holde huden våt med PBS.
- Overføre huden til en selvklebende microscope skyve ved hjelp av pinsett. Plasser bakre og fremre huden med innsiden vendt opp på lysbildet. Flat huden ved hjelp av pinsett.
- Montere huden i et flytende anti-fade montering medium for å unngå photobleaching og bevare fluorescerende signaler. Kontroller at ingen luftbobler er på eller rundt huden.
- Dekk med dekkglassvæske på huden prøvene nøye og lagre eksempellysbilder montert huden i den mørke natten ved romtemperatur å tillate montering media få fast. Seal dekkglassvæske til lysbildet som neglelakk og lagre den på 4 ° C for langtidslagring.
4. AC confocal mikroskopi
- Angi riktig laser for fluorophores. AC confocal mikroskop med tre laser kilder (Argon 488 nm, DPSS 561 nm og HeNe 633 nm) brukes i dette eksperimentet.
- Bruk sekvensiell skanneverktøyet, som samtidig interesserer trippel-farget prøver, å unngå og redusere eventuelle Overlapp.
Merk: Bilder vil tas en sekvensiell måte bruke til sekvensiell skannemodus. - Bildet under et 10 X mål. Bruke skanneverktøyet flis for å fange det hel øre hud. Angi Z stabel og kontroller at z-posisjonen dekker hele tykkelsen på øre hud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voksen mus bakre øre hud (figur 1A) og fremre øre hud (figur 1B) var immunostained med antistoffer mot αSMA (rød), Tuj1 (grønn), og PECAM-1 (blå). Bakre hud var immunostained å studere Nevro-immune distribusjon ved hjelp av antistoffer mot CD11b (rød) og MBP (grønn), sammen med Tuj1 (blå) (figur 2A). Distribusjon av CD11b+ inflammatoriske celler, inkludert makrofager ble oppdaget på én mobilnettet oppløsning (figur 2B).
Figur 1: justering ofperipheral nerver og blodårer i voksen øre hud. Hele-mount trippel immunofluorescence AC confocal mikroskopi bakre og fremre øre hud med antistoffer mot αSMA (rød), Tuj1 (grønn), og PECAM-1 (blå) vises. (A) VSMC-dekket stor-diameter blodkar justere med eksterne nerver i det bakre øre hud. (B) mindre-diameter blodkar dekket med VSMCs tråd med mindre diameter perifere nerve bunter i det fremre øre hud. Skala bar = 1 mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Myelination til eksterne nerver og CD11b+ myelogen celle distribusjon i voksen øre hud. Hele-mount trippel immunofluorescence AC confocal mikroskopi bakre øre hud med antistoffer mot CD11b (rød) og MBP (grønn), sammen med Tuj1 (blå), vises. (A) middels til store diameter perifere nerver er myelinated. (B) Nærbilde bilde i (A). CD11b+ betennelsesceller fordel jevnt i bakre øret huden. Skala bar = 1 mm (A), 100 µm (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver hele-mount immunonohistochemical avbilding av voksen øre hud for analyse av Nevro vaskulære strukturer og immun celle distribusjon. Vi tror denne metoden har mange eksperimentelle fordeler for forskere å studere branching morphogenesis og mønstre av eksterne nerver og blodkar og tredimensjonale distribusjon huden komponenter inkludert immunceller og hår follikler. Resultatene av avbilding kan kvantifiseres bruke tenkelig programvare for videre kvantitativ analyse.
Riktig forberedelse av det øre hud er avgjørende for suksessen til denne protokollen. Først bør det øre hud være omhyggelig dissekert etter euthanizing musen. Den bakre delen av det øre hud bør bli skrelt fra brusk. Deretter bør brusken bli skrellet av fra fremre huden før farging. Andre bør bindevev, liggende under adipose vev og hår fjernes forsiktig og nøye før monteringen. På grunn av eksistensen av eksterne nerver på overflaten av huden, er forsiktig fjerning nødvendig for å unngå å skade nerver. Tredje bør det øre hud være brettet med fjerning av litt tykk vev fra det øre hud. Til slutt, det øre hud bør være flat-montert uten luftbobler.
En begrensning av denne protokollen er at øret-merket øre hud ikke er riktig for analyse som øre-kode forårsaker hull eller et arr. Identifikasjon av mus ved forskjellige metoder enn øre-kode som merking på halen er derfor nødvendig i tilfelle det er flere mus å analysere.
Det hel øre hud kan skannes av AC confocal mikroskopi med en flis skanning verktøyet, selv om en tidligere rapporter viste at et område av interesse kan avbildes med en høy oppløsning10. Interessant, hele-mount avbilding av hele øret huden avslører distinkte branching morphogenesis og mønstre av eksterne nerver og blodkar mellom fremre og bakre huden (figur 1): bakre huden har stor-diameter nerve bunter (20-50 µm) linje med ombygde stor-diameter blodkar dekket med αSMA+ VSMCs (20 – 60 µm), mens den fremre huden har mindre-diameter nerve bunter (< 20 µm) linje med mindre-diameter men oppusset blodkar dekket med αSMA+ VSMCs (< 20 µm).
Det er en bemerkelsesverdig rekke musen modeller11 å belyse mekanisme menneskelige dermatologiske sykdommer som atopisk dermatitt12, psoriasis13, sår helbredelse14, og diabetiker neuropathy15. Vi har brukt denne protokollen å det øre hud av diett-indusert fedme mus og type 2 diabetiker mus for å studere diabetiker neuropathy16. Denne protokollen kan brukes fra unge voksne mus huden i ulike patologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker K. Gill for laboratoriet administrasjon og teknisk støtte, J. Hawkins og personale av National Institutes of Health (NIH) bygge 50 dyr anlegg for hjelp med musen omsorg, og R. Reed og F. Baldrey for administrativ hjelp. Takk også til S. Motegi og M. Udey for deler deres øre hud disseksjon protokollen, N. Burns redaksjonelle hjelp og medlemmer av laboratoriet av stilk cellen og Nevro-vaskulær biologi for teknisk hjelp og tankevekkende diskusjon. T. Yamazaki ble støttet av Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) NIH-KAITOKU. Dette arbeidet ble støttet av Intramural forskningsprogrammet av nasjonale hjerte, lunge og blod Institute (HL005702-11 til Y.M.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-αSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III β-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-β-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
References
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
- Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. , (2011).
- Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
- Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
- Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. , e51749 (2014).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. , (2017).
- Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
- Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
- Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
- Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
- Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
- O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
- Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).
