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Developmental Biology

Vollständig-hängen konfokalen Mikroskopie für Erwachsene Ohr Haut: ein Modellsystem, Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Immunzelle Verteilung zu studieren

doi: 10.3791/57406 Published: March 29, 2018

Summary

Hier beschreiben wir ein hohe Auflösung vollständig-hängen bildgebende Verfahren in der gesamten erwachsenen Maus Ohr Haut, die was uns ermöglicht, verzweigte Morphogenese und Strukturierung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie Immunzelle Verteilung zu visualisieren.

Abstract

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll einer ganzen-Mount Erwachsene Ohr Haut imaging Technik um umfassende dreidimensionale Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Strukturierung sowie Immunzelle Verteilung auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Die Analyse der peripheren Nerven und Blutgefäße anatomischen Strukturen in adulten Geweben bietet einige Einblicke in das Verständnis der funktionellen Neuro-vaskuläre Verkabelung und Neuro-vaskuläre Degeneration unter pathologischen Bedingungen wie z. B. die Wundheilung. Als sehr informativ Modellsystem haben wir unsere Studien auf Erwachsene Ohr Haut, konzentriert, die bei Dissektion gut zugänglich ist. Unsere einfache und reproduzierbare Protokoll sieht eine genaue Darstellung der zellulären Komponenten in der gesamten Haut, z. B. periphere Nerven (sensorische Axone, sympathischen Axone und Schwann-Zellen), Blutgefäße (Endothelzellen und vaskulären glatten Muskelzellen ), und Entzündungszellen. Wir glauben, dass dieses Protokoll die Möglichkeit, morphologischen Anomalien in der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie die Entzündung in der Haut von Erwachsenen Ohr unter verschiedenen pathologischen Bedingungen untersuchen ebnen wird.

Introduction

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Haut besteht aus drei Schichten: der Epidermis, Dermis und Hypodermis. Es wurde als Modellsystem verwendet, um Stammzellen Wartung, Differenzierung und Morphogenese in Entwicklung als auch die Regeneration, Tumorgenese und Entzündung in der Erwachsenenbildung zu studieren. Haut ist reich durchblutet und innerviert, so dass die Entwicklung des peripheren Nervensystems und Gefäßsystem gut aufeinander abgestimmt ist.

Eine ganze-Mount embryonalen Haut bildgebendes Verfahren mit mehreren Kennzeichnung auf intakten peripheren Nerven und Blutgefäße einschließlich ihrer zellulären Komponenten1,2,3, zu studieren haben wir bereits gezeigt. 4: sensorische Axone, sympathischen Axone, Schwann-Zellen in den Nerven, Endothelzellen, Perizyten und vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) in den Blutgefäßen. Während die Angiogenese eine primäre Kapillarnetzes erfährt intensive vaskuläre remodeling und entwickelt sich zu einem hierarchischen vaskulären verzweigten Netzwerk. In den Entwicklungsländern Lederhaut/Unterhaut Arterien neben peripheren sensorischen Nerven und Adern verzweigen dann neben den Arterien bilden. Nachdem die hierarchische vaskuläre Netzwerk gründlich mit VSMCs bedeckt ist, sympathische Nerven erstrecken sich entlang und innervieren Großrohre Blutgefäße1,5,6. Trotz der Bedeutung in die enge Beziehung zwischen der Nerven- und Gefäßsystem Systeme entwickeln wurde eine wichtige Frage zu befassen, was passiert mit der Neuro-vaskuläre Netzwerke in verschiedenen pathologischen Situationen bei Erwachsenen. Eine dreidimensionale hochauflösende Bildgebung ist erforderlich, die Pathogenese, zusammen mit anatomisch erkennbaren Verzweigung Morphogenese und Musterung zu schätzen wissen.

Neuronale und vaskuläre Morphogenese in erwachsenen Maus Haut wird häufig durch Gewebe Abschnitt Färbung analysiert. Andere Studien haben ganze-Mount Bildgebung der Haut verwendet, um die peripheren Nerven und Blutgefäße, neben Arrector Pili Muskeln7,8,9, Haarfollikel und Talgdrüsen zu visualisieren. Allerdings hat die Dicke der Erwachsenen Haut, die Haut über seine gesamte Tiefe zu analysieren erschwert.

In der vorliegenden Studie entwickelten wir eine neuartige hochauflösende ganze-Mount Imaging Erwachsene Ohr Haut, diese Herausforderungen zu meistern. Ohr Haut ist über seine gesamte Tiefe für die Dissektion und anschließende ganze-Mount-Bildgebung der Haut leicht zugänglich. So ist es eine einfache und hoch reproduzierbare Methode, die angewendet werden kann, um dreidimensionale Architektur der peripheren Nerven- und Gefäßsystem Systeme in der Haut, mit umfassender Quantifizierung Messungen zu vergleichen. Wir zeigten, dass die Ausrichtung der peripheren sensorischen und sympathischen Nerven mit großem Durchmesser Blutgefäße in der Erwachsenen Haut erhalten bleibt. Das Ziel dieses Protokolls ist, verzweigte Morphogenese und die Strukturierung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie die Immunzelle Verteilung auf zellulärer Ebene in erwachsenen Maus-Modellen in verschiedenen Erkrankungen wie Entzündungen zu visualisieren und Regeneration.

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Protocol

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Alle Versuche in diesem Abschnitt wurden unter Zustimmung vom National Heart, Lung, Blood Institute (NHLBI) Animal Care und Use Committee durchgeführt.

1. erwachsener Mäuse Ohr Haut Kollektion

  1. Einschläfern Sie erwachsener Mäuse durch Kohlendioxid (CO2) Exposition in einer geschlossenen Kammer und bestätigen Sie die Euthanasie durch zervikale Dislokation.
    Hinweis: Das Experiment folgt der National Institutes of Health (NIH)-Leitfaden für die Euthanasie-Methode.
  2. Sezieren Sie das Ohr von der Basis zu und platzieren Sie es in ein 35 x 10 mm2 Petrischale mit 2 mL von Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS). Kurz schneiden Sie Haare mit einer Schere.
  3. Schälen Sie die hinteren Haut und vorderen Haut entfernt von den dazwischen liegenden Knorpel vorsichtig.
    Hinweis: Knorpel legt auf die vorderen Haut.
  4. Transfer den hinteren und vorderen Haut separat auf einem gut 24 Teller mit 1 mL der eiskalte frische 4 % Paraformaldehyd (PFA) in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pro Bohrloch. Glätten Sie die hintere und vordere Haut in den 4 % PFA.
  5. Befestigen Sie die hintere und vordere Haut mit Knorpel bei 4 ° C für 1 h.
  6. Waschen Sie die hintere und vordere Haut 3 Mal für 5 min in 1 mL PBS mit schonendes Mischen auf einem Mischer bei Raumtemperatur.
  7. Die hintere und vordere Haut mit Knorpel an der Unterseite eines 35 x 10 mm2 Petrischale zu übertragen. Schneiden Sie den Basisbereich, die gefaltet und Fettgewebe und Bindegewebe. Der Knorpel vom vorderen Haut mit feinen gebogenen Pinzette abziehen.
  8. Entfernen Sie vorsichtig die Haare, Fettgewebe und Bindegewebe von der Innenseite der hinteren Haut mit feinen gebogenen Pinzette. Halten Sie die Haut nass mit PBS.

2. gesamte-Mount immunhistochemische Färbung der Maus Ohr Haut

Hinweis: Alle Experimente in den folgenden Abschnitten wurden entsprechend der NIH Labor Sicherheits-Richtlinien durchgeführt.

  1. Bereiten Sie die blockierenden Puffer. Filter 10 % Hitze inaktiviert Ziegenserum (HIGS) mit PBS-Puffer mit 0,2 % Triton x-100 (TX-100) blockierende Puffer verdünnt, oder 10 % Esel Serum (DS) verdünnt mit PBS-Puffer mit 0,2 % TX-100 blockierende Puffer, mit einer 0,45 µm-Filter-Einheit.
  2. Übertragen den hinteren und vorderen Haut auf einem 24 Teller gut mit 1 mL 10 % HIGS blockierende Puffer oder 10 % DS blockierende Puffer pro Bohrloch. Inkubieren Sie die Haut für 30 min mit schonendes Mischen auf einem Mischer bei Raumtemperatur.
  3. Bereiten Sie die primären Antikörper-Lösung durch die primären Antikörper (Table of Materials) in blocking-Puffer verdünnen (entweder 10 % HIGS oder 10 % DS).
    Hinweis: Ganze Mout immunhistochemische Analyse der Erwachsenen Ohr Haut mit Antikörper gegen Pan-neuronale Marker Neuron-spezifische Klasse III β-Tubulin (Tuj1, Kaninchen polyklonalen IgG oder Maus Monocloncal IgG2a, 1: 500 Verdünnung auf die letztendliche Konzentration von 2 µg/mL), Pan-Endothelzellen Marker Thrombozyten Endothelzellen Adhäsionsmolekül 1 (PECAM-1, Hamster monoklonaler IgG, Verdünnung 1: 300 an die Endkonzentration von 3,3 µg/mL), Myelinscheide Marker Myelin basic Protein (MBP, Kaninchen polyklonalen IgG, Verdünnung 1: 200 bei der Endkonzentration von 5 µg/mL) und entzündlichen myeloische Zellmarkierung CD11b (Ratte monoklonalen IgG2b, 01:50 Verdünnung auf die Endkonzentration von 20 µg/mL) wurde in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt. Die Haut wurde mit Cy3 konjugierten Antikörper für vaskuläre Glattmuskel Zelle Marker α Glattmuskel Aktin (αSMA) sowie sekundäre Antikörper (2.6) inkubiert. Die primäre Antikörper, die von uns getestet wurden in Tabelle Materialienaufgeführt. Gleichzeitig können mehrere primäre Antikörper abgeleitet aus verschiedenen Arten gemischt werden.
  4. Übertragen Sie die hintere und vordere Haut auf neuen Brunnen mit 150 µL Primärantikörper Lösung. Inkubieren Sie die Haut mit schonendes Mischen auf einem Mischer bei 4 ° C über Nacht.
  5. Am nächsten Tag die hintere und vordere Haut auf neue Brunnen in der 24-well-Platte übertragen oder Aspirieren des blockierenden Puffers, primäre Antikörper enthält. Fügen Sie 1 mL oder 2 %, die HIGS verdünnt in PBS mit TX-100 waschen Puffer 0,2 % oder 2 % DS mit PBS-Puffer mit 0,2 % TX-100 waschen Puffer verdünnt. Waschen Sie die Haut mit 3 Änderungen des Puffers waschen alle 15 min mit schonendes Mischen auf einem Mischer bei Raumtemperatur.
  6. Bereiten Sie die sekundäre Antikörper-Lösung (Table of Materials). Sekundäre Antikörper in der blocking-Puffer verdünnen (entweder 10 % HIGS oder 10 % DS) und Filter der blockierende Puffer mit sekundären Antikörper durch einen 0,22 µm Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Spritze Membranfilter an eine 1 mL Spritze angeschlossen.
    Hinweis: Alexa 488 oder 633 konjugiert Ziege Anti-Kaninchen IgG (H + L) oder Maus IgG2a für Tuj1, Alexa 647 konjugiert Ziege Anti-Hamster IgG (H + L) für PECAM-1, Alexa 488 konjugiert Ziege Anti-Kaninchen IgG (H + L) für MBP, und Alexa 594 konjugiert Ratte IgG (H + L) für CD11b dienten mit 1: 250 Verdünnung auf die Endkonzentration von 8 µg/mL. Die Haut wurde mit Cy3 konjugiert αSMA Antikörper (Verdünnung 1: 500 an die Endkonzentration von 2 bis 3 µg/mL) in Kombination mit dieser Sekundärantikörper inkubiert.
  7. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 13.000 x g für 10 min, aggregierte Teilchen der sekundären Antikörper aus dem blockierenden Puffer zu entfernen.
    Hinweis: Verschiedene fluoreszierende konjugierten Sekundärantikörper abgeleitet aus verschiedenen Arten können gleichzeitig gemischt werden.
  8. Übertragen Sie die hintere und vordere Haut auf gut mit 150 µL der Sekundärantikörper Lösung. Wickeln Sie die 24-well-Platte in Alu-Folie zu vermeiden, Licht und die Haut für 1 h mit schonendes Mischen auf einem Mischer bei Raumtemperatur inkubieren.
  9. Übertragen Sie die hintere und vordere Haut auf neue Brunnen in der 24-well-Platte oder aspirieren Sie die sekundäre Antikörper-Lösung vollständig durch pipettieren. Fügen Sie 1 mL 2 % HIGS waschen Puffer oder 2 % DS waschen Puffer.
  10. Die 24-well-Platte in Alufolie wickeln und waschen mit 3 Änderungen des Puffers waschen alle 15 min mit schonendes Mischen auf einem Mischer bei Raumtemperatur.

3. Montage der Ohr Haut auf Folie

  1. Legen Sie die Haut an der Unterseite eines 35 x 10 mm2 Petrischale. Entfernen Sie vorsichtig die Haare, Fettgewebe, Bindegewebe, Stäube und Fasern aus dem Inneren der Haut mit feinen gebogenen Pinzette unter Stereomikroskop mit geringer Beleuchtung, um umfangreiche Foto bleichen zu minimieren. Halten Sie die Haut nass mit PBS.
  2. Übertragen Sie die Haut auf eine selbstklebende Mikroskop-Objektträger mit Pinzette. Legen Sie die hintere und vordere Haut mit der Innenseite nach oben auf der Folie. Glätten Sie die Haut mit einer Pinzette.
  3. Montieren Sie die Haut in eine flüssige Anti-Fade Eindeckmittel zu vermeiden Immunofluoreszenz und fluoreszierende Signale zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im oder rund um die Haut sind.
  4. Abdecken mit Deckglas auf der Hautproben sorgfältig und Lagern montiert Haut Probe Folien in der dunklen Nacht bei Raumtemperatur, damit sich die Montage Medien fest bekommen. Das Deckglas auf die Folie mit Nagellack versiegeln und bei 4 ° C für die Langzeitspeicherung zu speichern.

4. der konfokalen Mikroskopie

  1. Richten Sie entsprechende Laser für Fluorophore. Ein confocal Mikroskop mit drei Laserquellen (Argon 488 nm, DPSS 561 nm und HeNe 633 nm) wird in diesem Experiment verwendet.
  2. Verwenden Sie das sequentieller Scan-Tool, das welches gleichzeitig Triple-gefärbten Proben erregt zu vermeiden und reduzieren Überschneidungen.
    Hinweis: Bilder werden in einer sequenziellen Weise mit sequentieller Scan-Modus aufgenommen werden.
  3. Bild unter einem 10 X-Objektiv. Verwenden Sie die Kachel-Scan-Tool, um das ganze Ohr Haut zu erfassen. Z-Stapel und stellen Sie sicher, dass die Z-Position die gesamte Dicke der Ohr Haut deckt.

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Representative Results

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Erwachsenen Maus posterior Ohr (Abbildung 1A) und vorderen Ohr Haut (Abbildung 1 b) wurden Immunostained mit Antikörpern gegen αSMA (rot), Tuj1 (grün), und PECAM-1 (blau). Hinteren Haut war Immunostained, Neuro-immun-Verteilung über Antikörper gegen CD11b (rot) und MBP (grün), zusammen mit Tuj1 (blau) (Abbildung 2A) zu studieren. Vertrieb von CD11b+ Entzündungszellen, einschließlich Makrophagen mit einer einzigen zellulären Auflösung (Abb. 2 b) erkannt wurde.

Figure 1
Abbildung 1: Ausrichtung Ofperipheral Nerven und Blutgefäße in Erwachsene Ohr Haut. Vollständig-hängen dreifach Immunfluoreszenz konfokalen Mikroskopie der hinteren und vorderen Ohr Haut mit Antikörper gegen αSMA (rot), Tuj1 (grün), und PECAM-1 (blau) wird angezeigt. (A) VSMC bedeckten Großrohre Blutgefäße mit peripheren Nerven in der hinteren Ohr Haut ausrichten. (B) kleiner Durchmesser Blutgefäße mit VSMCs bedeckt mit kleinerem Durchmesser peripheren Nervenbündel in der vorderen Ohr Haut ausrichten. Maßstabsleiste = 1 mm Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Myelinisierung der peripheren Nerven und CD11b+ myeloische Zellen Verteilung in Erwachsene Ohr Haut. Vollständig-hängen dreifach Immunfluoreszenz konfokalen Mikroskopie der hinteren Ohr Haut mit Antikörpern gegen CD11b (rot) und MBP (grün), zusammen mit Tuj1 (blau), wird angezeigt. (A) mittlere bis große Durchmesser periphere Nerven sind Markhaltige. (B) Nahaufnahme Bild in (A). CD11b+ Entzündungszellen in der hinteren Ohr Haut gleichmäßig verteilen. Maßstabsleiste = 1 mm (A), 100 µm (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Dieses Protokoll beschreibt die gesamte-Mount Immunonohistochemical Bildgebung Erwachsene Ohr Haut für die Analyse von Neuro-vaskuläre Strukturen und Immunzelle Verteilung. Wir glauben, dass diese Methode hat zahlreiche experimentelle Vorteile für Forscher, verzweigte Morphogenese und die Musterung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie dreidimensionale Verteilung der Haut-Komponenten einschließlich Immunzellen und Haare zu studieren Follikel. Die Ergebnisse der Bildgebung können mit imaging Software für weitere Quantitative Analyse quantifiziert werden.

Richtige Vorbereitung der Ohr Haut ist entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls. Erstens sollte die Ohr Haut sorgfältig seziert werden, bald nach euthanizing der Maus. Der hintere Teil der Ohr Haut sollte weg von der Knorpel geschält werden. Dann sollte der Knorpel vom vorderen Haut vor Verschmutzung abgeschält werden. Zweitens, Bindegewebe, Fettgewebe und Haare sanft und gründlich vor der Montage zu streichen. Aufgrund der Existenz von peripheren Nerven auf der Oberfläche der Haut ist sorgfältige Entfernung erforderlich, um eine Beschädigung der Nerven. Drittens sollte die Ohr Haut entfaltet mit der Entfernung von einigen dicken Gewebe aus dem Ohr Haut. Schließlich sollte die Ohr Haut Wohnung blasenfrei montiert werden.

Eine Einschränkung dieses Protokolls ist, dass Ohr-Tags Ohr Haut nicht geeignet für die Analyse, da Ohrmarke ein Loch oder eine Narbe verursacht. Daher ist Identifikation von Mäusen mit verschiedenen Methoden außer Ohrmarke wie z. B. die Beschriftung am Heck notwendig, für den Fall, dass es gibt mehrere Mäuse zu analysieren.

Die gesamte Ohr Haut kann durch konfokale Mikroskopie mit einer Kachel-Scan-Tool gescannt werden, obwohl eine frühere Berichte zeigten, dass eine Zielregion mit hoher Auflösung10abgebildet werden kann. Interessant ist, die gesamte-Mount Bildgebung der gesamten Ohr Haut zeigt deutliche Verzweigung Morphogenese und Strukturierung von peripheren Nerven und Blutgefäße zwischen der hinteren und vorderen Haut (Abbildung 1): die hintere Haut hat große Durchmesser Nerven Bundles (20 – 50 µm) ausgerichtet mit umgebauten Großrohre Blutgefäßen bedeckt mit αSMA+ VSMCs (20 – 60 µm), während die vorderen Haut hat kleinere Durchmesser Nervenbündel (< 20 µm) mit kleinerem Durchmesser, aber renovierten Blutgefäße ausgerichtet mit αSMA+ VSMCs bedeckt (< 20 µm).

Es gibt eine bemerkenswerte Anzahl von Maus-Modelle11 , erläutern den Mechanismus der menschlichen Hautkrankheiten wie Neurodermitis12, Schuppenflechte13, Wundheilung, Heilung14und diabetischer Neuropathie15. Wir haben dieses Protokoll auf das Ohr Haut von Mäusen, Diät-induzierten Adipositas angewendet, und geben Sie 2 diabetische Mäusen um diabetische Neuropathie16zu studieren. Dieses Protokoll kann von Jugendlichen, Erwachsenen Maus Haut in verschiedenen pathologischen Bedingungen angewendet werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken K. Gill für die Labor-Management und technische Unterstützung, J. Hawkins und das Personal des National Institute of Health (NIH) 50 Tierhaus für die Unterstützung bei der Maus Pflege und R. Reed und F. Baldrey für die Amtshilfe. Vielen Dank auch an S. Motegi und M. Udey für ihr Ohr Haut Dissektion Protokoll, N. Burns für redaktionelle Hilfe und Mitglieder von Labor Stem Cell und Neuro-vaskuläre Biologie für technische Hilfe und nachdenkliche Diskussion. T. Yamazaki wurde von der Japan Society für die Promotion of Science (JSPS) NIH-KAITOKU unterstützt. Diese Arbeit wurde von den intramuralen Forschungsprogramm von der National Heart, Lung and Blood Institute (HL005702-11, Y.M) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 x Phosphate Buffered Saline KD Medical RGE-3210 PBS, without Ca2+/Mg2+
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025-092 HBSS, with Ca2+/Mg2+
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in PBS
Triton X-100 Sigma X100 Detergent
Normal goat serum Gibco 16210064 Component of blocking/washing buffer
Normal donkey serum Jackson Immuno research 017-000-121 Component of blocking/washing buffer
Curved fine tweezers Dumont RS-5047
Curved tweezers Integra Miltex Vantage V918-782, V918-784
Filter Unit 0.45 mm Thermo Scientific 157-0045 For filtration
1 mL syringe Coviden 8881501400 For filtration
Syringe filter Unit 0.22 mm Millex-GV SLGVR04NL For filtration
ProLong Gold Thermo Scientific P36934 Anti-fade mounting medium
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing
Dissecting microscope Leica MZ95
Confocal microscope Leica TCS SP5
Photoshop CC 2017 Adobe Graphics editor software
Illustrator CC 2017 Adobe Graphics editor software
Image J NIH Image processing software
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody Millipore MAB1398Z Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody BD Pharmingen 553369 Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-αSMA antibody conjugated with cy-3 Sigma C6198 Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500
Anti-EphB1 antibody Santa Cruz sc-9319 Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100
Anti-neuron-specific Class III β-tubulin (Tuj1) Abcam AB18207 Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500
Anti-Tuj1 antibody Covance MMS-435P Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500
Anti-MBP antibody Abcam AB40390 Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody Chemicon AB152 Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500
Anti-Peripherin antibody Chemicon AB1530 Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antibody Bio-Rad MCA74G Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50
Anti-CD45 antibody Thermo Fisher Scientific 14-0451-85 Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500
Anti-CD3 antibody Bio-Rad MCA1477T Rat IgG1, immune cell marker, 1:100
Anti-CD45R (B220) antibody Thermo Fisher Scientific 14-0452 Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A11122 Rabbit polyclonal, 1:300
Anti-GFP antibody Abcam Ab13970 Chicken polyclonal, 1:500
Anti-β-gal antibody Cappel 55976 Rabbit polyclonal, 1:5000
Anti-RFP antibody Abcam Ab62341 Rabbit polyclonal, 1:300
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A11034 Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 Jackson Immuno research 127-605-160 Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 Jackson Immuno research 112-585-167 Rat polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 Thermo Fisher Scientific A21136 Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250

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References

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
  3. Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. (2011).
  4. Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
  5. Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
  6. Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
  7. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. e51749 (2014).
  8. Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. (2017).
  9. Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540 (2014).
  10. Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
  11. Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
  12. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
  13. Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
  14. Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
  15. O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
  16. Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).
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Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).More

Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).

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