Summary
Aquí, describimos un método imagenológico de alta resolución Monte todo en la piel de oreja de ratón adulto entero, que nos permite visualizar la ramificación de la morfogénesis y el patrón de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como distribución de células inmunes.
Abstract
Aquí, presentamos un protocolo de una piel de oreja adulto todo montaje de técnica para estudiar la completa morfogénesis tridimensional de ramificación neuro-vascular y patrones, así como distribución de célula inmune a nivel celular. El análisis de estructuras anatómicas del nervio y los vasos sanguíneos periféricos en tejidos adultos proporciona algunas perspectivas en la comprensión del cableado neuro-vasculares funcional y degeneración neuro-vascular en condiciones patológicas como la cicatrización de heridas. Como un sistema modelo muy informativo, nos hemos centrado nuestros estudios en piel de oreja adulto, que es fácilmente accesible para la disección. Nuestro protocolo simple y reproducible proporciona una descripción exacta de los componentes celulares de la piel entera, tales como los nervios periféricos (axones sensoriales, axones simpáticos y células de Schwann), los vasos sanguíneos (células endoteliales y células musculares lisas vasculares ) y células inflamatorias. Creemos que este protocolo allanará el camino para investigar anormalidades morfológicas en los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como la inflamación en la piel de oreja adulto bajo diferentes condiciones patológicas.
Introduction
Piel se compone de tres capas: la epidermis, la dermis y la hipodermis. Se ha utilizado como sistema modelo para estudiar el mantenimiento de la célula de vástago, la diferenciación y la morfogénesis en el desarrollo así como la regeneración, tumorogénesis e inflamación en adulto. Piel es ricamente vascularizada e inervada de tal manera que el desarrollo del sistema vascular y sistema nervioso periférico es bien coordinado.
Previamente hemos demostrado una técnica de imagen de piel embrionaria todo Monte con etiquetas múltiples para el estudio de los nervios periféricos intactos y los vasos sanguíneos incluyendo sus componentes celulares1,2,3, 4: axones sensoriales, axones simpáticos, las células en los nervios de Schwann, células endoteliales, pericitos y células musculares lisas vasculares (VSMCs) en los vasos sanguíneos. Durante la angiogénesis, una red capilar primaria experimenta intensivo remodelado vascular y se convierte en una red jerárquica de ramificación vascular. En la dermis/hipodermis en vías de desarrollo, las arterias ramifican junto a los nervios sensoriales periféricos y venas entonces forman adyacentes a las arterias. Después de la red vascular jerárquica está bien cubierta con VSMCs, los nervios simpáticos se extienden a lo largo e inervan los vasos sanguíneos de gran diámetro1,5,6. A pesar de la importancia de la estrecha asociación entre los sistemas nerviosos y vasculares en desarrollo, ha sido una cuestión importante abordar lo que ocurre con las redes neuro-vasculares en diferentes situaciones patológicas en adultos. Una proyección de imagen de alta resolución tridimensional es necesario apreciar la patogenesia, junto con morfogénesis ramificación anatómica reconocible y patrones.
Morfogénesis neuronal y vascular en piel de ratón adulto se analizan comúnmente por tejido sección coloración. Otros estudios han utilizado proyección de imagen de conjunto de montaje de la piel para visualizar los nervios periféricos y vasos sanguíneos, además de los folículos pilosos, glándulas sebáceas y del arrector pili músculos7,8,9. Sin embargo, el grueso de la piel adulta ha hecho difícil analizar la piel en toda su profundidad.
En el presente estudio, hemos desarrollado una novela alta resolución montaje en toda la proyección de imagen de piel de oreja adulto para superar estos desafíos. Piel del oído es fácilmente accesible para la disección y posterior montaje de toda la proyección de imagen de la piel en toda su profundidad. Por lo tanto, es un método simple y altamente reproducible que puede aplicarse para comparar la arquitectura tridimensional de los sistemas nerviosos y vasculares periféricos en la piel, con las medidas de cuantificación integral. Hemos demostrado que la alineación de los nervios periféricos sensoriales y simpáticas con los vasos sanguíneos de gran diámetro se conserva en la piel adulta. El objetivo de este protocolo es visualizar la ramificación de la morfogénesis y los patrones de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como la distribución de células inmune a nivel celular en modelos de ratón adulto en varias condiciones tales como la inflamación y regeneración.
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Protocol
Todos los experimentos en esta sección fueron realizados bajo aprobación de la nacional del corazón, pulmón, sangre Institute (NHLBI) Animal atención y Comité de uso.
1. adultos ratón oído piel colección
- Eutanasia a ratones adultos por la exposición de dióxido de carbono (CO2) en una cámara cerrada y luego confirmar la eutanasia por dislocación cervical.
Nota: El experimento sigue la pauta de institutos nacionales de salud (NIH) para el método de eutanasia. - Diseccionar el oído de la base y colóquelo en una de 35 x 10 mm2 caja de Petri que contiene 2 mL de Hank equilibrada solución de sal (HBSS). Brevemente recortar el vello con unas tijeras.
- Pelar la piel posterior y anterior piel lejos cuidadosamente el cartílago intermedio.
Nota: El cartílago se adhiere a la piel anterior. - Transferencia de la parte posterior y anterior piel por separado para una 24 bien la placa que contiene 1 mL de helado fresco paraformaldehído al 4% (PFA) en tampón fosfato salino (PBS) por pozo. Aplanar la piel anterior y posterior en el 4% del PDC.
- Fijar la piel anterior y posterior con cartílago a 4 ° C durante 1 hora.
- Lave la piel posterior y anterior 3 veces durante 5 minutos en 1 mL de PBS con suaves se mezclan en un mezclador a temperatura ambiente.
- Transferencia de la piel anterior y posterior con cartílago en la parte inferior de 35 x 10 mm2 caja de Petri. Cortar la región de base, que se pliega y adiposo y los tejidos conectivos. Pele el cartílago de la anterior piel con unas pinzas curvas finas.
- Desde el interior de la piel posterior con unas pinzas curvas finas, retire con cuidado los pelos, tejidos adiposos y los tejidos conectivos. Mantener la piel húmeda con PBS.
2. la coloración de Immunohistochemical de whole-mount de piel de oreja de ratón
Nota: Todos los experimentos en las secciones siguientes se realizaron según las pautas de seguridad del laboratorio de NIH.
- Preparar la solución amortiguadora de bloqueo. Filtro inactivado por calor 10% de suero de cabra (HIGS) había diluido en PBS con Tritón 0.2% solución amortiguadora de bloqueo X-100 (TX-100), o 10% de suero de burro (DS) había diluido en PBS con 0.2% solución amortiguadora de bloqueo TX-100, con una unidad de filtro de 0.45 μm.
- Transferencia de la parte posterior y anterior piel 24 bien placa que contiene 1 mL de solución amortiguadora de bloqueo de HIGS de 10% o 10% DS solución amortiguadora de bloqueo por pozo. Incubar la piel por 30 min con suave mezcla en un mezclador a temperatura ambiente.
- Preparar la solución de anticuerpo primario por dilución de los anticuerpos primarios (Tabla de materiales) en solución amortiguadora de bloqueo (ya sea 10% HIGS o 10% DS).
Nota: Mout todo el análisis de immunohistochemical de la piel de oreja adulto con anticuerpos a la clase de neurona específica marcador neuronal pan III β-tubulina (Tuj1, conejo policlonales IgG o ratón monocloncal IgG2a, dilución 1: 500 en la concentración final de 2 μg/mL), molécula de adhesión de células endoteliales pan marcador plaquetas célula endotelial 1 (PECAM-1, hámster monoclonal IgG, 1:300 dilución en la concentración final de 3.3 μg/mL), proteína básica de mielina de marcador de vaina de mielina (MBP, conejo IgG policlonal, dilución 1: 200 en el concentración final de 5 μg/mL) y el marcador inflamatorio células mieloides CD11b (Rat IgG2b monoclonal, 1:50 dilución en la concentración final de 20 μg/mL) se muestra en la figura 1 y figura 2. La piel se incubó con el anticuerpo conjugado con Cy3 para músculo liso vascular células marcador α actinia del músculo liso (αSMA) junto con anticuerpos secundarios (2.6). Los anticuerpos primarios probados por nosotros mismos se enumeran en la Tabla de materiales. Varios anticuerpos primarios derivados de diferentes especies se pueden mezclar al mismo tiempo. - Traslado la piel anterior y posterior al nuevo pozo que contiene 150 μL de la solución de anticuerpos primarios. Incubar la piel con la suave mezcla en un mezclador a 4 ° C durante la noche.
- Al día siguiente, la piel posterior y anterior de transferencia a nuevos pozos en la placa de la pozo 24 o aspire la solución amortiguadora de bloqueo con anticuerpos primarios. Añadir 1 mL de o 2% HIGS diluido en PBS con tampón de lavado de TX-100 0.2% o 2% DS diluido en PBS con tampón de lavado 0.2% TX-100. Lave la piel con 3 cambios de la solución de lavado cada 15 minutos con suaves se mezclan en un mezclador a temperatura ambiente.
- Preparar la solución de anticuerpo secundario (Tabla de materiales). Diluir los anticuerpos secundarios en la solución amortiguadora de bloqueo (ya sea 10% HIGS o 10% DS) y el filtro de la solución amortiguadora de bloqueo que contiene anticuerpos secundarios a través de un 0.22 μm del polivinilideno (PVDF) de difluoruro jeringa filtro de membrana conectada a una jeringa de 1 mL.
Nota: Alexa 488 o 633-conjugado de cabra anti-conejo IgG (H+L) o ratón IgG2a para Tuj1, hamster contra cabra 647 Alexa Conjugado IgG (H+L) de PECAM-1, conjugados con Alexa 488 cabra anti-conejo IgG (H+L) de MBP, y se utilizaron conjugados con Alexa 594 rat IgG (H+L) de CD11b con dilución 1: 250 en la concentración final de 8 μg/mL. La piel se incubó con el anticuerpo αSMA conjugado con Cy3 (dilución 1: 500 en la concentración final de 2-3 μg/mL) en combinación con estos anticuerpos secundarios. - Centrifugue la solución a 13.000 x g por 10 min eliminar las partículas agregadas de los anticuerpos secundarios de la solución amortiguadora de bloqueo.
Nota: Diversos anticuerpos secundarios conjugados fluorescentes derivados de diferentes especies se pueden mezclar al mismo tiempo. - Traslado la piel posterior y anterior al bien que contiene 150 μL de la solución de anticuerpos secundarios. Envolver la placa 24 bien en papel aluminio para evitar la luz e incubar la piel durante 1 h con suaves se mezclan en un mezclador a temperatura ambiente.
- Transfiera la piel anterior y posterior al nuevos pozos en la placa de la pozo 24 o aspirar la solución de anticuerpo secundario por pipeta completamente. Añadir 1 mL de tampón de lavado 2% HIGS o tampón de lavado 2% DS.
- Envolver la placa de la pozo 24 en papel de aluminio y lavar con 3 cambios de la solución de lavado cada 15 minutos con suaves se mezclan en un mezclador a temperatura ambiente.
3. la piel de la oreja de montaje en portaobjetos
- Colocar la piel en la parte inferior de 35 x 10 mm2 caja de Petri. Retire con cuidado los pelos, tejido adiposo, tejidos conectivos, polvos y fibras desde el interior de la piel utilizando fórceps curvado fino bajo Estereomicroscopio con iluminación baja para minimizar la foto amplia de blanqueo. Mantener la piel húmeda con PBS.
- Transferencia de la piel a un adhesivo portaobjetos usando pinzas. Coloca la piel anterior y posterior con la parte interior hacia arriba en la diapositiva. Aplanar la piel con unas pinzas.
- Montaje de la piel en un medio líquido montaje anti-fade para evitar fotoblanqueo y preservar las señales fluorescentes. Asegúrese de que no hay burbujas de aire en o alrededor de la piel.
- Cubrir con cubreobjetos sobre las muestras de piel con cuidado y guardar las diapositivas de muestra de piel montada en la oscura noche a temperatura ambiente para permitir que los medios de montaje conseguir la firmes. Sellar el cubreobjetos a la diapositiva con esmalte de uñas y almacenar a 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.
4. confocal microscopio
- Configurar láser apropiada para fluoróforos. Un microscopio confocal con tres fuentes de láser (argón 488 nm, DPSS 561 nm y HeNe 633 nanómetro) se utiliza en este experimento.
- Utilice la herramienta de exploración secuencial, que excita al mismo tiempo muestras de triple tinción, para evitar y reducir cualquier superposición.
Nota: Se tomarán imágenes de manera secuencial utilizando el modo de exploración secuencial. - Imagen bajo un objetivo de X 10. Utilice la herramienta de exploración de azulejo para capturar la piel de la oreja entera. Conjunto Z-stack y asegúrese de que la posición de z abarca todo el espesor de la piel del oído.
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Representative Results
Ratón adulto posterior oído piel (figura 1A) y anterior de la oreja (figura 1B) immunostained con anticuerpos αSMA (rojo), Tuj1 (verde) y PECAM-1 (azul). Piel posterior era immunostained para estudiar la distribución de neuro-inmune con anticuerpos CD11b (rojo) y MBP (verde), junto con Tuj1 (azul) (figura 2A). Distribución de CD11b+ las células inflamatorias, incluyendo macrófagos fue detectado en una sola resolución celular (figura 2B).
Figura 1: alineación ofperipheral nervios y vasos sanguíneos en la piel del oído adulto. Conjunto montaje triple inmunofluorescencia microscopia confocal de la piel anterior y posterior del oído con anticuerpos αSMA (rojo), Tuj1 (verde), y se muestra PECAM-1 (azul). (A) cubierta de Coevolución gran diámetro vasos alineados con los nervios periféricos en la piel posterior de la oreja. (B) diámetro más pequeño vasos sanguíneos cubiertos con VSMCs alinee con paquetes de nervio periférico de menor diámetro en la piel anterior del oído. Barra de escala = 1 mm haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Mielinización de los nervios periféricos y CD11b+ distribución de células mieloides en la piel de oreja adulto. Conjunto montaje triple inmunofluorescencia microscopia confocal de piel posterior del oído con los anticuerpos a CD11b (rojo) y MBP (verde), junto con Tuj1 (azul), se muestra. (A) nervios periféricos de medio a gran diámetro son myelinated. Imagen de primer plano (B) en (A). CD11b+ las células inflamatorias se distribuyen uniformemente en la piel posterior de la oreja. Barra de escala = 1 mm (A), 100 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe la imagen de conjunto-Monte immunonohistochemical de piel de oreja adulto para el análisis de estructuras neuro-vasculares y la distribución de células inmunitarias. Creemos que este método tiene numerosas ventajas experimentales para investigadores para el estudio de ramificación de la morfogénesis y los patrones de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como la distribución tridimensional de los componentes de la piel incluyendo el pelo y las células inmunes folículos. Los resultados de la proyección de imagen pueden ser cuantificados usando proyección de imagen de software para análisis cuantitativo.
Preparación adecuada de la piel del oído es fundamental para el éxito de este protocolo. En primer lugar, la piel de la oreja debe cuidadosamente disecada poco después euthanizing el ratón. La parte posterior de la piel del oído debe pelarse de cartílago. Entonces, el cartílago debe ser pelado de la piel anterior antes de la tinción. En segundo lugar, los tejidos conectivos, tejidos adiposos y pelos deben eliminarse suavemente y a fondo antes del montaje. Debido a la existencia de los nervios periféricos en la superficie de la piel, eliminar es necesaria para evitar daños en los nervios. En tercer lugar, la piel de la oreja debe ser revelada con el retiro de algunos tejidos gruesos de la piel del oído. Finalmente, la piel de la oreja debe ser piso-montado sin burbujas de aire.
Una limitación de este protocolo es que piel etiqueta de oído del oído no es apropiada para el análisis como etiqueta de oído causa un agujero o una cicatriz. Por lo tanto, la identificación de los ratones por métodos distintos de arete como etiquetado en la cola es necesario en caso de que hay varios ratones para analizar.
La piel de la oreja entera puede digitalizarse mediante microscopía confocal con una herramienta de exploración de azulejo, aunque un informes anteriores demostraron que una región de interés puede ser reflejada con una alta resolución de10. Curiosamente, la imagen de conjunto de montaje de la piel de la oreja entera revela distintas ramas morfogénesis y patrones de los nervios periféricos y vasos sanguíneos entre la piel anterior y posterior (figura 1): la piel posterior tiene gran diámetro del nervio paquetes (20 – 50 μm) alineados con remodelado vasos sanguíneos de gran diámetro cubiertos con αSMA+ VSMCs (20-60 μm), mientras que la anterior piel tiene paquetes del nervio de menor diámetro (< 20 μm) alineado con los vasos sanguíneos de menor diámetro pero remodelados cubiertos con αSMA+ VSMCs (< 20 μm).
Hay un número notable de ratón modelos11 para aclarar el mecanismo de enfermedades dermatológicas como la dermatitis atópica12, psoriasis13, herida curación14y15de la neuropatía diabética. Han aplicado este protocolo a la piel del oído de los ratones de obesidad inducida por la dieta y el tipo 2 diabéticos ratones para el estudio de neuropatía diabética16. Este protocolo puede aplicarse de juvenil a la piel de ratón adulto en diversas condiciones patológicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos la gestión del laboratorio K. Gill y soporte técnico, J. Hawkins y el personal de institutos nacionales de salud (NIH) facilidad del edificio 50 animales para la ayuda del ratón, y R. Reed y F. Baldrey para asistencia administrativa. Gracias también a Motegi S. y M. Udey para compartir su oído piel disección Protocolo N. quemaduras ayuda editorial y los miembros del laboratorio de células madre y biología Neuro-Vascular para la ayuda técnica y discusión reflexiva. T. Yamazaki fue apoyada por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) NIH-KAITOKU. Este trabajo fue financiado por el programa de investigación intramuros de la National Heart, Lung and Blood Institute (HL005702-11 para Y.M.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-αSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III β-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-β-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
References
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