Summary
Her, beskriver vi en høj opløsning hele-mount billedmetoden i hele voksen mus øre hud, hvilket gør det muligt at visualisere forgrening morfogenese og mønstre af perifere nerver samt blodkar og immun celle distribution.
Abstract
Vi præsenterer her, en protokol af en helhed-mount voksen øre hud imaging teknik til at studere omfattende tre-dimensionelle neuro-kar forgrening morfogenese og mønstre samt immun celle distribution på et cellulært niveau. Analyse af perifere nerve og blodkar anatomiske strukturer i voksent væv giver nogle indsigt i forståelsen af funktionelle neuro-kar ledningsnet og neuro-kar degeneration i patologiske tilstande såsom sårheling. Som en yderst informativ modelsystem, har vi fokuseret vores undersøgelser på voksne øre hud, som er lettilgængelig for dissektion. Vores enkle og reproducerbare protokollen giver en præcis skildring af de cellulære komponenter i hele huden, såsom perifere nerver (sensoriske axoner, sympatiske axoner og Schwann celler), blodkar (endotel celler og vaskulære glatte muskelceller ), og inflammatoriske celler. Vi mener, at denne protokol vil bane vejen for undersøge morfologiske abnormiteter i perifere nerver og blodkar og betændelse i huden, voksen øre under forskellige patologiske tilstande.
Introduction
Huden består af tre lag: epidermis, dermis og hypodermis. Det har været brugt som et modelsystem til at undersøge stamceller vedligeholdelse, differentiering og morfogenese i udvikling såvel som regenerering, tumordannelse og betændelse i voksen. Huden er rigt vaskulariserede og innerveres sådan, at udviklingen af perifere nervesystem og vaskulære system er velkoordineret.
Vi har tidligere påvist en helhed-mount embryonale hud imaging teknik med flere mærkning for at studere intakt perifere nerver og blodkar, herunder deres cellulære komponenter1,2,3, 4: sensoriske axoner, sympatiske axoner, Schwann celler i nerver, endotelceller, pericytes og vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) i blodkarrene. Under angiogenese, en primær kapillære netværk gennemgår intensiv vaskulære remodellering og udvikler sig til en hierarkisk vaskulære forgrenede netværk. I udvikle dermis/hypodermis, arterier gren sammen med perifere sensoriske nerver og blodårer derefter danne støder op til arterierne. Efter det hierarkiske vaskulære netværk er grundigt dækket med VSMCs, sympatiske nerver udvide langs og innerverer stor diameter blodkar1,5,6. Trods betydning i den tæt tilknytning mellem de udvikle nerve- og vaskulære systems, har en store spørgsmål været at løse, hvad der sker med de neuro-vaskulære netværk i forskellige patologiske situationer hos voksne. En tre-dimensionel høj opløsning imaging er nødvendigt at værdsætte patogenese, sammen med anatomisk genkendelige forgrening morfogenese og mønstre.
Neuronal og vaskulære morfogenese i voksen mus huden er almindeligvis analyseret af væv afsnit farvning. Andre undersøgelser har brugt hele-mount billeddannelse af huden til at visualisere de perifere nerver og blodkar, hårsække, sebaceous kirtel og arrector pili muskler7,8,9. Tykkelsen af voksne hud har imidlertid gjort det vanskeligt at analysere huden over sin hele dybde.
I den foreliggende undersøgelse udviklede vi en roman med høj opløsning hele-mount billeddannelse af voksen øre huden til at overvinde disse udfordringer. Øre hud er let tilgængelige for dissektion og efterfølgende hele-mount billeddannelse af huden over sin hele dybde. Det er således en ligetil og meget reproducerbar metode, der kan anvendes til at sammenligne tre-dimensionelle arkitektur af perifere nerve- og vaskulære systems i huden, med omfattende kvantificering målinger. Vi viste, at justeringen af perifere sensoriske og sympatiske nerver med stor diameter blodkar er bevaret i den voksne hud. Målet med denne protokol er at visualisere forgrening morfogenese og mønstre af perifere nerver samt blodkar og immun celle distribution på et celleniveau i voksen musemodeller i forskellige sygdomme som betændelse og regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter i dette afsnit blev udført under godkendelse fra National Heart, Lung, og Blood Institute (NHLBI) dyrs pleje og brug udvalget.
1. voksen mus øre hud indsamling
- Aflive voksne mus af kuldioxid (CO2) eksponering i et lukket kammer og derefter bekræfte eutanasi af cervikal dislokation.
Bemærk: Eksperimentet følger National Institutes of Health (NIH) retningslinje for metoden eutanasi. - Dissekere øre fra bunden og læg den i en 35 x 10 mm2 petriskål indeholdende 2 mL af Hank's Balanced Salt løsning (HBSS). Kort trimme hår med en saks.
- Skræl posterior hud og anterior hud væk omhyggeligt fra de mellemliggende brusk.
Bemærk: Brusk tillægger den forreste hud. - Overføre bageste og forreste hud separat til et godt 24 plade indeholdende 1 mL iskold frisk 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) pr. brønd. Flade posterior og anterior huden i 4% PFA.
- Fix posterior og anterior huden med brusk ved 4 ° C i 1 time.
- Vask posterior og anterior huden 3 gange for 5 min i 1 mL PBS med blide blanding på en mixer ved stuetemperatur.
- Overføre posterior og anterior huden med brusk til bunden af en 35 x 10 mm2 petriskål. Afbrød regionen base, som er foldet og har fedt og bindevæv. Skrælle brusk fra forreste huden ved hjælp af fine buet pincet.
- Forsigtigt fjerne hår, fedtvæv og bindevævet fra indersiden af posterior huden ved hjælp af fine buet pincet. Holde huden våd med PBS.
2. hele-mount immunhistokemisk farvning af musen øre hud
Bemærk: Alle eksperimenter i de følgende afsnit blev udført i henhold til NIH laboratorium sikkerhedsretningslinjer.
- Forberede den blokerende buffer. Filter 10% varme inaktiveret ged serum (HIGS) fortyndes i PBS med 0,2% triton X-100 (TX-100) blokerende buffer, eller 10% æsel serum (DS) fortyndes i PBS med 0,2% TX-100 blokerende buffer, ved hjælp af et 0,45 µm filterenhed.
- Overføre bageste og forreste huden til en 24 plade godt indeholdende 1 mL 10% HIGS blokerende buffer eller 10% DS blokerende buffer pr. hul. Inkuber huden for 30 min med blide blanding på en mixer ved stuetemperatur.
- Forberede den primære antistof løsning ved at fortynde de primære antistoffer (Table of Materials) i blokerende buffer (enten 10% HIGS eller 10% DS).
Bemærk: Hele-mout immunhistokemisk analyse af voksen øre hud med antistoffer mod pan-neuronal markør neuron-specifik klasse III β-tubulin (Tuj1, kanin polyklonale IgG eller mus monocloncal IgG2a, 1: 500 fortynding på den endelige koncentration af 2 µg/mL), Pan-endotel celle markør trombocyt endotel celle vedhæftning molekyle 1 (PECAM-1, hamster monoklonale IgG, 1: 300 fortynding på den endelige koncentration af 3,3 µg/mL), myelinskeden markør myelin grundlæggende protein (MBP, kanin polyklonale IgG, 1:200 fortynding på den endelig koncentration på 5 µg/mL) og inflammatoriske myeloide celler markør CD11b (rotte monoklonale IgG2b, 1:50 fortynding i en endelig koncentration på 20 µg/mL) var vist i figur 1 og figur 2. Huden var inkuberes med Cy3-konjugeret antistof til vaskulære glatte muskelceller celle markør α glat muskel aktin (αSMA) sammen med sekundær antistoffer (2.6). De primære antistoffer testet af os blev opført i Tabel af materialer. Flere primære antistoffer fremstillet af forskellige arter kan mikses samtidigt. - Overføre posterior og anterior huden til nye godt der indeholder 150 µL af opløsningen primære antistoffer. Inkuber huden med blide blanding på en mixer ved 4 ° C natten over.
- Den følgende dag, overføre posterior og anterior huden til nye brønde i 24 godt pladen eller Opsug den blokerende buffer, som indeholder primære antistoffer. Der tilsættes 1 mL af enten 2% HIGS fortyndes i PBS med 0,2% TX-100 vask buffer eller 2% DS fortyndes i PBS med 0,2% TX-100 vask buffer. Vask huden med 3 ændringer af vask buffer hvert 15 min med blide blanding på en mixer ved stuetemperatur.
- Forberede sekundær antistof løsning (Tabel af materialer). Fortynd sekundære antistoffer i blokerende buffer (enten 10% HIGS eller 10% DS) og filtrere de blokerende buffer indeholdende sekundære antistoffer gennem et 0,22 µm polyvinylidene xenondifluorid (PVDF) membran sprøjte filter tilsluttet en 1 mL sprøjte.
Bemærk: Alexa 488 eller 633-konjugeret gede anti-kanin IgG (H + L) eller mus IgG2a for Tuj1, Alexa 647-konjugeret gede anti-hamster IgG (H + L) til PECAM-1, Alexa 488-konjugeret gede anti-kanin IgG (H + L) til MBP, og Alexa 594-konjugeret rotte IgG (H + L) til CD11b blev anvendt med 1:250 fortynding i den endelige koncentration af 8 µg/mL. Huden var inkuberes med Cy3-konjugeret αSMA antistof (1: 500 fortynding i en endelig koncentration på 2-3 µg/mL) i kombination med disse sekundære antistoffer. - Der centrifugeres løsning på 13.000 x g i 10 min. at fjerne aggregerede partikler af de sekundære antistoffer fra den blokerende buffer.
Bemærk: Forskellige fluorescerende konjugeret sekundære antistoffer fremstillet af forskellige arter kan blandet samtidigt. - Overføre posterior og anterior huden til godt indeholdende 150 µL af opløsningen sekundære antistoffer. Wrap 24 godt pladen i aluminiumsfolie for at undgå lys og inkuberes huden for 1 h med blide blanding på en mixer ved stuetemperatur.
- Overføre posterior og anterior huden til nye brønde i 24 godt pladen eller Aspirér sekundær antistof løsning af afpipetteres helt. Der tilsættes 1 mL 2% HIGS vaske buffer eller 2% DS vask buffer.
- Wrap 24 godt pladen i aluminiumsfolie og vask med 3 ændringer af vask buffer hvert 15 min med blide blanding på en mixer ved stuetemperatur.
3. montering øre hud på dias
- Placer huden på bunden af en 35 x 10 mm2 petriskål. Forsigtigt fjerne hår, fedtvæv, bindevæv, støv og fibre fra indersiden af huden med fint buet pincet under stereomikroskopet med lav belysning til at minimere omfattende foto blegning. Holde huden våd med PBS.
- Overføre huden til en klæbende objektglas med pincet. Placer posterior og anterior huden med indersiden opad på diaset. Flade huden med pincet.
- Montere huden i en flydende anti-fade montering medium til at undgå photobleaching og bevare fluorescerende signaler. Sørg for at ingen luftbobler er på eller omkring huden.
- Dække med coverslip på huden prøver omhyggeligt og gemme monteret hud prøve dias i den mørke overnatning ved stuetemperatur til at tillade montering medierne får fast. Forsegle coverslip til dias med neglelak og opbevares ved 4 ° C til langtidsopbevaring.
4. konfokalmikroskopi
- Oprette passende lasere til fluorophores. En Konfokal mikroskop med tre laser kilder (Argon 488 nm, DPSS 561 nm og HeNe 633 nm) er brugt i dette eksperiment.
- Brug værktøjet sekventielle scanning, som samtidig pirrer triple-farvede prøver at undgå og begrænse nogen overlapning.
Bemærk: Billeder vil blive taget sekventielt ved hjælp af den sekventielle scanningstilstand. - Billedet under en 10 X mål. Brug værktøjet flise scanning til at fange hele øret hud. Indstille Z-stakken og sørge for, at z-position dækker hele tykkelsen af øre hud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voksen mus posterior øre hud (figur 1A) og anterior øre hud (figur 1B) var immunostained med antistoffer mod αSMA (rød), Tuj1 (grøn), og PECAM-1 (blå). Posterior hud blev immunostained at studere neuro-immune distribution ved hjælp af antistoffer mod CD11b (rød) og MBP er (grøn), sammen med Tuj1 (blå) (figur 2A). Distribution af CD11b+ inflammatoriske celler, herunder makrofager blev opdaget ved en enkelt cellulære opløsning (figur 2B).
Figur 1: justering ofperipheral nerver og blodkar i voksen øre hud. Hele-mount tredobbelt immunofluorescens Konfokal mikroskopi af posterior og anterior øre hud med antistoffer mod αSMA (rød), Tuj1 (grøn), og PECAM-1 (blå) er vist. (A) VSMC-dækkede store diameter blodkar Juster med perifere nerver i posterior øre hud. (B) mindre-diameter blodkar dækket med VSMCs justeres med mindre diameter perifere nerve bundter i det forreste øre hud. Skalalinjen = 1 mm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Myelination af perifere nerver og CD11b+ myeloid celle distribution i voksen øre hud. Hele-mount tredobbelt immunofluorescens Konfokal mikroskopi af posterior øre hud med antistoffer mod CD11b (rød) og MBP (grøn), sammen med Tuj1 (blå), er vist. (A) Medium til stor diameter perifere nerver er myelinerede. (B) Close-up billede i (A). CD11b+ inflammatoriske celler distribuere jævnt i posterior øre hud. Skalalinjen = 1 mm (A), 100 µm (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver hele-mount immunonohistochemical billeddannelse af voksen øre hud til analyse af neuro-vaskulære strukturer og immun celle distribution. Vi mener, at denne metode har mange eksperimentelle fordele for forskere at studere forgrening morfogenese og mønstre af perifere nerver og blodkar, og tre-dimensionelle distribution af hud komponenter omfatter immunceller og hår follikler. Resultaterne af imaging kan kvantificeres ved hjælp af billedbehandling software for yderligere kvantitative analyser.
Korrekt forberedelse af øre hud er afgørende for succes i denne protokol. Først, øre hud bør omhyggeligt dissekeret snart efter euthanizing musen. Den bageste del af øret huden skal være skrællet væk fra brusk. Derefter, brusk bør være skrælles fra forreste hud før farvning. Andet, bindevæv, fedtvæv og hår skal fjernes forsigtigt og grundigt før montering. På grund af eksistensen af perifere nerver på overfladen af huden kræves omhyggelig fjernelse at undgå at beskadige nerver. For det tredje bør øre hud udfoldet med fjernelse af nogle tykke væv fra øre hud. Endelig bør øre hud være fast monteret uden luftbobler.
En begrænsning af denne protokol er at øre-tagged øre hud ikke er relevante for analysen som øremærke forårsager et hul eller et ar. Identifikation af mus af forskellige andre metoder end øremærke såsom mærkning på halen er derfor nødvendigt, hvis der er flere mus til at analysere.
Hele øre hud kan scannes af konfokalmikroskopi med en flise scanningsværktøj, selv om en tidligere rapporter viste, at en region af interesse kan være afbildet med en høj opløsning10. Interessant, det hele-mount billeddannelse af hele øre hud afslører særskilte forgrening morfogenese og mønstre af perifere nerver og blodkar mellem posterior og anterior huden (figur 1): den bageste hud har stor diameter nerve bundter (20 – 50 µm) på linje med remodeled stor diameter blodkar dækket med αSMA+ VSMCs (20-60 µm), mens den forreste hud har mindre diameter nerve bundter (< 20 µm) på linje med mindre diameter, men ombygget blodkar dækket med αSMA+ VSMCs (< 20 µm).
Der er en bemærkelsesværdig række mus modeller11 at belyse mekanismen af menneskelige dermatologiske sygdomme som atopisk dermatitis12, psoriasis13, sår healing14og diabetisk neuropati15. Vi har anvendt denne protokol øre huden af kost-induceret fedme mus og type 2 diabetisk mus for at studere diabetisk neuropati16. Denne protokol kan anvendes fra ungfisk til voksen mus hud i forskellige patologiske tilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker K. Gill for laboratoriet forvaltningen og teknisk support, J. Hawkins og personale af National Institutes of Health (NIH) bygning 50 dyr facilitet for bistand med musen pleje, og R. Reed og F. Baldrey for administrativ bistand. Tak også til S. Motegi og M. Udey for at dele deres øre hud dissektion protokol, N. Burns for redaktionel hjælp, og medlemmer af laboratoriet for stamcelleforskning og Neuro-kar biologi for teknisk hjælp og tankevækkende diskussion. T. Yamazaki blev støttet af Japan-samfund til fremme af videnskab (JSP'ER) NIH-KAITOKU. Dette arbejde blev støttet af murene forskningsprogrammet National Heart, Lung og Blood Institute (HL005702-11 til Y.M.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-αSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III β-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-β-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
References
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
- Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. , (2011).
- Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
- Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
- Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. , e51749 (2014).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. , (2017).
- Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
- Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
- Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
- Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
- Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
- O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
- Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).
