Summary
Nous décrivons ici une méthode d’imagerie de haute résolution entier-montent dans la peau d’oreille de souris adulte entier, qui nous permet de visualiser la ramification de la morphogenèse et structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que distribution de cellules immunitaires.
Abstract
Nous présentons ici un protocole d’une peau d’oreille d’adulte entier-montent d’imagerie technique pour étudier la morphogenèse de ramification neuro-vasculaire tridimensionnelle complète et structuration, ainsi que distribution de cellules immunitaires au niveau cellulaire. L’analyse des structures anatomiques nerveuses et des vaisseaux sanguins périphériques dans les tissus adultes fournit un aperçu de la compréhension du câblage neuro-vasculaire fonctionnelle et la dégénérescence neuro-vasculaires dans certaines pathologies telles que la cicatrisation des plaies. Comme système modèle hautement instructif, nous avons concentré nos études sur peau d’oreille d’adulte, qui est facilement accessible pour la dissection. Notre protocole simple et reproductible fournit une description précise des composants cellulaires de la peau entière, tels que les nerfs périphériques (axones sensoriels, axones sympathiques et les cellules de Schwann), des vaisseaux sanguins (cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses vasculaires ) et des cellules inflammatoires. Nous croyons que ce protocole préparera le terrain pour enquêter sur des anomalies morphologiques dans les nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que l’inflammation dans la peau de l’oreille d’adulte dans des conditions pathologiques différentes.
Introduction
La peau se compose de trois couches : épiderme, derme et hypoderme. Il a servi comme modèle pour étudier les cellules souches entretien, différenciation et morphogenèse en développement ainsi que la régénération, tumorigenèse et l’inflammation chez les adultes. La peau est richement vascularisée et innervée tels que le développement du système nerveux périphérique et du système vasculaire est bien coordonné.
Nous avons déjà démontré une technique d’imagerie entier-Montez la peau embryonnaire avec étiquetage multiples pour l’étude des nerfs périphériques intacts et les vaisseaux sanguins, y compris leurs composants cellulaires1,2,3, 4: axones sensoriels, axones sympathiques, Schwann dans les nerfs, les cellules, les cellules endothéliales, péricytes et cellules de muscle lisse vasculaire (CMLV) dans les vaisseaux sanguins. Au cours de l’angiogenèse, un premier réseau capillaire subit un remodelage vasculaire intense et se développe en un réseau de ramification vasculaire hiérarchique. Dans le derme en développement/hypoderme, artères branche aux côtés des veines et des nerfs sensoriels périphériques puis forment adjacentes aux artères. Une fois le réseau vasculaire hiérarchique est complètement recouvert de CMLV, nerfs sympathiques s’étendent le long et innervent le grand diamètre des vaisseaux sanguins1,5,6. Malgré l’importance de l’association étroite entre les développement des systèmes nerveux et vasculaires, une question importante a consisté à aborder ce qui se passe aux réseaux neuro-vasculaires dans diverses situations pathologiques chez l’adulte. Une imagerie de haute résolution en trois dimensions est nécessaire pour apprécier la pathogenèse, ainsi que de la morphogenèse ramification reconnaissable anatomiquement et structuration.
Morphogenèse neuronale et vasculaire dans la peau de souris adulte est couramment analysée par la coloration de la section de tissu. D’autres études ont utilisé entier-Montez l’imagerie de la peau pour visualiser les nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, en plus les follicules pileux, glandes sébacées et arrecteur pili muscles7,8,9. Cependant, l’épaisseur de la peau adulte a rendu difficile analyser la peau dans son ensemble de la profondeur.
Dans la présente étude, nous avons développé une nouvelle imagerie haute résolution d’entier-montent de peau d’oreille d’adulte pour surmonter ces difficultés. Peau de l’oreille est facilement accessible pour la dissection et l’imagerie entier-Montez subséquent de la peau sur l’ensemble de la profondeur. Ainsi, c’est une méthode simple et hautement reproductible qui peut être appliquée pour comparer l’architecture tridimensionnelle des systèmes nerveux et vasculaires périphériques dans la peau, avec des mesures de quantification globale. Nous avons démontré que l’alignement des nerfs sensitifs et sympathiques périphériques avec grand diamètre des vaisseaux sanguins est préservée dans la peau de l’adulte. Le but du présent protocole est de visualiser la ramification de la morphogénèse et la structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que la distribution des cellules immunitaires au niveau cellulaire dans les modèles de souris adulte dans diverses conditions telles que l’inflammation et régénération.
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Protocol
Toutes les expériences dans cette section ont été effectuées en vertu de l’approbation de la National Heart, Lung et Blood Institute (NHLBI) et animalier Comité d’urbanisme.
1. adult Mouse Ear peau Collection
- Euthanasier des souris adultes par l’exposition de dioxyde de carbone (CO2) dans une chambre fermée, puis vérifiez l’euthanasie par dislocation cervicale.
Remarque : L’expérience fait suite à la recommandation de la National Institutes of Health (NIH) pour la méthode d’euthanasie. - Disséquer l’oreille de la base et le placer dans un 35 x 10 mm2 boîte de Pétri contenant 2 mL de Hank Balanced Salt Solution (HBSS). Brièvement couper les poils avec des ciseaux.
- Peler la peau postérieure et antérieure peau loin soigneusement de cartilage intermédiaire.
Remarque : Le Cartilage s’attache à la peau antérieure. - Transférer la partie postérieure et antérieure peau séparément à un 24 puits plaque contenant 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % frais glacé (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par puits. Aplatir la peau postérieure et antérieure sous les 4 % PFA.
- Fixer la peau postérieure et antérieure avec cartilage à 4 ° C pendant 1 h.
- Laver la peau postérieure et antérieure 3 fois pendant 5 min dans 1 mL de PBS avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.
- Transférer la peau postérieure et antérieure avec cartilage au fond d’un 35 x 10 mm2 boîte de Pétri. Couper la base région, qui est pliée et a des tissus adipeux et les tissus conjonctifs. Décollez le cartilage de peau antérieur avec une pincette courbée fine.
- Retirez soigneusement les poils, les tissus adipeux et les tissus conjonctifs de l’intérieur de la peau postérieure à l’aide de la pincette courbée fine. Garder la peau humide avec du PBS.
2. entier-Montez Immunohistochemical souillant de peau d’oreille de souris
Remarque : Toutes les expériences dans les sections suivantes ont été effectuées selon les directives de sécurité de laboratoire de NIH.
- Préparer le tampon de blocage. Sérum de chèvre filtre chaleur 10 % inactivé (HIGS) dilué dans du PBS avec 0,2 % triton de tampon de blocage de X-100 (TX-100), ou 10 % de sérum d’âne (DS) dilué dans du PBS avec 0,2 % de tampon de blocage TX-100, à l’aide d’un filtre de 0,45 µm.
- Transférer la partie postérieure et antérieure peau à un 24 plaque bien contenant 1 mL de tampon de blocage de HIGS 10 % ou 10 % tampon de blocage DS / puits. Incuber la peau pendant 30 min avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.
- Préparer la solution d’anticorps primaire en diluant l’anticorps primaires (Table des matières) dans un tampon bloquant (soit 10 %, soit 10 % HIGS DS).
NOTE : Ensemble-mout immunohistochemical analyse de peau d’oreille d’adulte avec des anticorps de classe de neurone-spécifique de marqueurs pan-neuronale III β-tubuline (Tuj1, IgG ou souris lapin polyclonal monocloncal IgG2a, dilution de 1/500 à la concentration finale de 2 µg/mL), molécule d’adhésion cellulaire endothéliale Pan-endothélial marqueur plaquettes 1 (PECAM-1, hamster monoclonale IgG, dilution de 1 : 300 à la concentration finale de 3,3 µg/mL), la protéine basique de la myéline de marqueur de gaine de myéline (MBP, lapin IgG polyclonaux, dilution de 1 : 200 à la concentration finale de 5 µg/mL) et un marqueur inflammatoire cellulaire myéloïde CD11b (Rat monoclonal IgG2b, 01:50 dilution à une concentration finale de 20 µg/mL) a été montré dans la Figure 1 et Figure 2. La peau a été incubée avec l’anticorps conjugué Cy3 pour le muscle lisse vasculaire marqueur α muscle lisse actine cellulaire (αSMA) ainsi que des anticorps secondaires (2.6). Les anticorps primaires testées par nous-mêmes ne figuraient dans la Table des matières. Les anticorps primaires multiples provenant de différentes espèces peuvent être mélangées en même temps. - Transférer la peau postérieure et antérieure à nouveau puits contenant 150 µL de la solution d’anticorps primaires. Incuber la peau avec un mélange doux sur une table de mixage à 4 ° C durant la nuit.
- Le lendemain, la peau de la partie postérieure et antérieure de transfert de nouveaux puits dans la plaque 24 puits ou aspirer le tampon de blocage contenant des anticorps primaires. Ajouter 1 mL de soit 2 % HIGS dilué dans du PBS avec du tampon de lavage pour le TX-100 0,2 % ou 2 % DS dilué dans du PBS avec du tampon de lavage pour le TX-100 0,2 %. Laver la peau avec 3 changements de la mémoire tampon de lavage toutes les 15 min avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.
- Préparer la solution d’anticorps secondaire (Table des matières). Diluer l’anticorps secondaires dans le tampon de blocage (soit 10 % HIGS ou 10 % DS) et filtre le tampon de blocage contenant des anticorps secondaires à travers un filtre de seringue en membrane 0,22 µm polyvinylidène difluoride (PVDF) relié à une seringue de 1 mL.
NOTE : Alexa 488 ou chèvre 633-conjugués du anti-lapin IgG (H + L) ou IgG2a de souris pour Tuj1, anti-hamster de chèvre Alexa 647 Conjugué IgG (H + L) pour chèvre PECAM-1, conjugué Alexa 488 du anti-lapin IgG (H + L) pour MBP, et rat Alexa 594 Conjugué IgG (H + L) pour CD11b servaient avec la dilution de 1/250 à la concentration finale de 8 µg/mL. La peau est incubée avec un anticorps conjugué Cy3 αSMA (dilution 1/500 à la concentration finale de 2 à 3 µg/mL) en combinaison avec ces anticorps secondaires. - Centrifuger la solution à 13 000 x g pendant 10 min enlever les particules agrégées de l’anticorps secondaires de la mémoire tampon de blocage.
Remarque : Les types d’anticorps secondaires conjugués fluorescents provenant de différentes espèces peuvent être mélangées en même temps. - Transférer la peau postérieure et antérieure à cupule contenant 150 µL de la solution d’anticorps secondaires. Enrouler la plaque 24 puits dans du papier aluminium pour éviter la lumière et incuber la peau pendant 1 h avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.
- Transférez la peau postérieure et antérieure aux nouveaux puits de la plaque 24 puits ou aspirer la solution d’anticorps secondaire en pipette complètement. Ajouter 1 mL de tampon de lavage HIGS 2 % ou 2 % tampon de lavage DS.
- Enrouler la plaque 24 puits dans du papier aluminium et laver avec 3 changements de la mémoire tampon de lavage toutes les 15 min avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.
3. montage de la peau de l’oreille de la diapositive
- Placez la peau sur le fond d’un 35 x 10 mm2 boîte de Pétri. Retirez soigneusement les poils, les tissus adipeux, les tissus conjonctifs, poussières et les fibres à l’intérieur de la peau à l’aide de fine pince courbée sous stéréomicroscope avec faible éclairage afin de minimiser la grande photo de blanchiment. Garder la peau humide avec du PBS.
- Transférer la peau à une lame de microscope adhésif avec une pincette. Placez la peau postérieure et antérieure avec l’intérieur vers le haut sur la diapositive. Aplatir la peau à l’aide de pinces.
- Montez la peau dans un milieu liquide anti-fondu montage pour éviter le photoblanchiment et préserver les signaux fluorescents. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est sur ou autour de la peau.
- Couvrir avec une lamelle couvre-objet sur les échantillons de peau soigneusement et entreposer les diapositives échantillon de peau monté dans la nuit sombre à température ambiante pour permettre que le support de montage se ferme. Sceller la lamelle couvre-objet de la diapositive avec vernis à ongles et conserver à 4 ° C pour le stockage à long terme.
4. confocal Microscopy
- Mettre en place des lasers pour fluorophores. Un microscope confocal avec trois sources laser (Argon 488 nm, DPSS 561 nm et HeNe 633 nm) est utilisé dans cette expérience.
- Utilisez l’outil de balayage séquentiel, qui excite en même temps les échantillons colorés à triple, pour éviter et réduire les chevauchements.
NOTE : Images seront prises de manière séquentielle, en utilisant le mode de balayage séquentiel. - Image sous un objectif 10 X. Utilisez l’outil d’analyse de tuile pour capturer la peau toute oreille. La valeur de Z-pile et s’assurer que la position z couvre toute l’épaisseur de la peau de l’oreille.
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Representative Results
Souris adulte oreille postérieure (Figure 1 a) et peaux oreille antérieure (Figure 1 b) ont été immunomarquées avec anticorps anti-αSMA (rouge), Tuj1 (vert) et PECAM-1 (bleu). Peau postérieure a été immunomarquées pour étudier la distribution de neuro-immunitaire à l’aide d’anticorps anti-CD11b (rouge) et MBP (vert), ainsi que Tuj1 (bleu) (Figure 2 a). Distribution de CD11b+ des cellules inflammatoires, y compris les macrophages a été détectée à une seule résolution cellulaire (Figure 2 b).
Figure 1 : alignement ofperipheral nerfs et vaisseaux sanguins dans la peau de l’oreille d’adulte. Entier-Montez la microscopie confocale immunofluorescence triple de peau oreille postérieure et antérieure avec l’anticorps anti-αSMA (rouge), Tuj1 (vert), et PECAM-1 (bleu) s’affiche. (A) recouverts de CMLV grand diamètre des vaisseaux sanguins s’aligner sur des nerfs périphériques dans la peau de l’oreille postérieure. (B) plus petit diamètre des vaisseaux sanguins recouverts de CMLV aligner faisceaux de nerfs périphériques de plus petit diamètre dans la peau de l’oreille antérieur. Echelle = 1 mm s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Myélinisation des nerfs périphériques et CD11b+ distribution de cellules myéloïdes dans la peau de l’oreille d’adulte. Microscopie confocale immunofluorescence triple entiers de peau oreille postérieure avec anticorps anti-CD11b (rouge) et MBP (vert), ainsi que Tuj1 (bleu), s’affiche. (A) des nerfs périphériques moyennes-grandes de diamètre sont myélinisées. Gros plan (B) l’image (a). CD11b+ cellules inflammatoires répartir uniformément dans la peau de l’oreille postérieure. Echelle = 1 mm (A), 100 µm (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole décrit l’imagerie immunonohistochemical entiers de peau d’oreille d’adulte pour l’analyse des structures neuro-vasculaires et de la distribution de cellules immunitaires. Nous croyons que cette méthode a de nombreux avantages expérimentales aux chercheurs d’étudier la ramification de la morphogénèse et la structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que la répartition en trois dimensions des composants de peau y compris les cheveux et les cellules immunitaires follicules. Les résultats de l’imagerie peuvent être quantifiées à l’aide de logiciels d’imagerie pour l’analyse quantitative approfondie.
Une préparation adéquate de la peau de l’oreille est critique pour le succès de ce protocole. Tout d’abord, la peau de l’oreille doit être soigneusement disséquée peu de temps après l’euthanasie de la souris. La partie postérieure de la peau de l’oreille doit être épluchée loin du cartilage. Ensuite, le cartilage doit être décollée de peau antérieure avant la coloration. Deuxièmement, les tissus conjonctifs, les tissus adipeux et poils devraient être retirés doucement et attentivement avant le montage. En raison de l’existence des nerfs périphériques sur la surface de la peau, extraction soigneuse est nécessaire pour éviter d’endommager les nerfs. En troisième lieu, la peau de l’oreille doit être dépliée avec la suppression de certains tissus épais de la peau de l’oreille. Enfin, la peau de l’oreille doit être plat monté sans bulles d’air.
Une des limites du présent protocole sont que la peau de l’oreille marqués à l’oreille n’est pas adéquate pour l’analyse comme marque auriculaire provoque un trou ou une cicatrice. Identification des souris par différentes méthodes autres que les marques auriculaires tels que les étiquettes apposées sur la queue est donc nécessaire, dans le cas où il y a plusieurs souris d’analyser.
La peau toute oreille peut être analysée par microscopie confocale avec un outil d’analyse de tuile, bien qu’un rapports antérieurs ont démontré qu’une région d’intérêt peut être photographiée avec une haute résolution10. Fait intéressant, l’imagerie entier-montent de la peau de l’oreille entière révèle morphogenèse branches distincte et structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins entre la peau postérieure et antérieure (Figure 1) : la peau postérieure a grand diamètre faisceaux (20 – 50 µm) alignée rénovés grand diamètre des vaisseaux sanguins, recouverts de αSMA+ CMLV (20 à 60 µm), tandis que la partie antérieure du nerf peau a faisceaux nerveux de plus petit diamètre (< 20 µm) alignée sur les vaisseaux sanguins plus petit diamètre mais rénovés recouvert de αSMA+ CMLV (< 20 µm).
Il y a un nombre remarquable de souris modèles11 à élucider le mécanisme de maladies dermatologiques telles que la dermatite atopique12et13de la psoriasis, plaies guérison14et15de la neuropathie diabétique. Nous ont appliqué ce protocole à la peau de l’oreille de souris de l’obésité induite par la diète et tapez 2 souris diabétiques afin d’étudier la neuropathie diabétique16. Ce protocole peut être appliqué de juvénile à la peau de souris adulte dans diverses conditions pathologiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions la direction du laboratoire de K. Gill et appui technique, J. Hawkins et le personnel du National Institutes of Health (NIH) construction animalerie 50 pour l’aide avec soin de la souris et R. Reed et F. bartherline pour l’assistance administrative. Merci aussi à Motegi S. et M. Uwimana pour le partage de leur protocole de dissection du peau oreille, N. Burns pour aide rédactionnelle et les membres de la laboratoire de cellules souches et biologie Neuro-vasculaire de l’aide technique et une discussion réfléchie. T. Yamazaki a été appuyée par la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) NIH-KAITOKU. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du National Heart, Lung, and Blood Institute (HL005702-11 à Y.M.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-αSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III β-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-β-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
References
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