Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Bütün-Confocal mikroskobu yetişkin kulak cilt için mount: nöro-vasküler dallanma morfogenez ve bağışıklık hücre dağıtım modeli sistemi

doi: 10.3791/57406 Published: March 29, 2018

Summary

Burada, dallanma morfogenez ve periferik sinirler ve kan damarları yanı sıra bağışıklık hücre dağıtım desenlendirme görselleştirmek sağlayan tüm yetişkin fare kulak deride bir yüksek çözünürlüklü bütün Dağı görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır.

Abstract

Burada, kapsamlı üç boyutlu nöro-vasküler dallanma morfogenez ve desenlendirme yanı sıra bağışıklık hücre dağıtım hücresel düzeyde eğitim için teknik görüntüleme bir bütün-mount yetişkin kulak deri bir iletişim kuralı mevcut. Periferik sinir ve damar anatomik yapıları yetişkin dokularda analizini bazı anlayışlar fonksiyonel nöro-vasküler kablolama ve patolojik durumlarda yara iyileşmesi gibi nöro-vasküler dejenerasyon anlayışı sunuyor. Son derece bilgilendirici modeli sistemi çalışmalarımız diseksiyon için kolay erişilebilir yetişkin kulak cilt üzerinde odaklanmıştır. Bizim basit ve tekrarlanabilir Protokolü (duyusal aksonlar, sempatik akson ve Schwann hücreleri) periferik sinirler, kan damarları (endotel hücreleri ve vasküler düz kas hücreleri gibi tüm cilt hücresel bileşenlerindeki doğru bir tasviri sağlar ) ve inflamatuar hücre. Bizce bu protokolü periferik sinirler ve kan damarları morfolojik anormallikleri yanı sıra farklı patolojik şartlar altında yetişkin kulak deride enflamasyon araştırmak için önünü açacak.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cilt üç katmandan oluşur: epidermis, dermis ve hypodermis. Bu kök hücre bakım, farklılaşma ve morfogenetik geliştirme gibi yeniden oluşturma işlemi, tumorigenesis ve inflamasyon yetişkin eğitim için bir model sistem olarak kullanılmıştır. Cilt zengin skarların ve periferik sinir sistemi ve damar sistemi gelişimi iyi koordine öyle ki innervated.

Biz daha önce olduğu gibi periferik sinirler ve kan damarları onların hücresel bileşenleri1,2,3, de dahil olmak üzere eğitim için birden çok etiket yapma ile bir bütün-mount embriyonik cilt görüntüleme tekniği göstermiştir 4: duyusal aksonlar, sempatik aksonlar, Schwann sinir hücrelerinde, endotel hücreleri, perisitlerden ve kan damarlarının damar düz kas hücrelerinde (VSMCs). Angiogenez sırasında birincil kapiller ağ yoğun vasküler remodeling uğrar ve hiyerarşik bir vasküler dallanma ağına geliştirir. Gelişmekte olan DermIS/hypodermis, arterler çevresel duyusal sinirler ve damarlar ile birlikte şube ardından arterler için bitişik form. Hiyerarşik damar ağı iyice VSMCs ile kapalı sonra sempatik sinirler boyunca genişletmek ve geniş çaplı kan damarları1,5,6innervate. Gelişmekte olan sinir ve damar sistemleri arasındaki yakın ilişki içinde önemini rağmen yetişkin çeşitli patolojik durumlarda nöro-vasküler ağlarda ne yönelik olarak önemli bir soru oldu. Üç boyutlu bir yüksek çözünürlüklü görüntü Patogenez, anatomik olarak tanınabilir dallanma morfogenez ve desenlendirme ile birlikte takdir etmek gereklidir.

Nöronal ve vasküler morfogenez yetişkin fare deride yaygın doku bölümü boyama tarafından analiz edilir. Diğer çalışmalar bütün Dağı görüntüleme deri periferik sinirler ve kan damarları, ek olarak saç folikülleri, yağ bezleri ve arrector pili kas7,8,9görselleştirmek için kullandık. Ancak, Yetişkin cilt kalınlığı deri tüm derinliği üzerinde analiz etmek zor yaptı.

Bu da çalışmanın, biz bu zorlukları aşmak için yetişkin kulak deri bir roman yüksek çözünürlüklü bütün Dağı görüntüleme geliştirdik. Kulak cilt üzerinde tüm derinliği diseksiyon ve sonraki bütün Dağı görüntüleme cilt için kolayca erişilebilir. Böylece, bu üç boyutlu mimari cilt kapsamlı miktar ölçümleri ile periferik sinir ve damar sistemlerinin karşılaştırmak için uygulanan bir basit ve son derece tekrarlanabilir yolu. Büyük çaplı kan damarları ile çevresel duyusal ve sempatik sinirler hizalamasını yetişkin cilt korunur gösterdi. Bu protokol dallanma morfogenez ve periferik sinirler ve kan damarları, aynı zamanda iltihabı gibi değişik koşullarda yetişkin fare modellerinde hücresel düzeyde bağışıklık hücre dağıtım desenlendirme görselleştirmek için hedeftir ve rejenerasyon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu bölümdeki tüm deneylerin Ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (NHLBI) hayvan bakım ve kullanım Komitesi onayını altında yapıldı.

1. yetişkin Fare kulağı deri koleksiyonu

  1. Kapalı bir oda içinde karbondioksit (CO2) maruz yetişkin fareler ötenazi ve ötenazi tarafından servikal çıkığı onaylayın.
    Not: Deneme ötenazi yöntemi için Ulusal Enstitüsü Sağlık (NIH) kılavuz takip eder.
  2. Kulak tabanından incelemek ve bir 35 x 10 mm2 ' de 2 mL, Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) içeren Petri kabına yerleştirin. Kısa bir süre kıllar makasla kesme.
  3. Soyma posterior cilt ve anterior deriden uzak dikkatli bir şekilde müdahalede bulunan kıkırdak.
    Not: Kıkırdak ön cilde ekler.
  4. Aktarım arka ve ön cilde ayrı ayrı bir 24 iyi plakası buz gibi taze % 4 (PFA) fosfat tamponlu tuz iyi (PBS) içinde paraformaldehyde içeren 1 mL. %4 arka ve ön deride dümdüz PFA.
  5. Arka ve ön Cilt 1 h için 4 ° C'de kıkırdak ile düzeltmek.
  6. Arka ve ön Cilt 3 kere 5 min için PBS bir karıştırıcı oda sıcaklığında hafif karıştırma ile 1 mL yıkayın.
  7. Arka ve ön cilt kıkırdak ile bir 35 x 10 mm2 Petri kabına altına aktarın. Katlandığında ve yağ ve bağ dokusu olduğu temel bölge, kes. Ön deri ince kavisli forseps kullanarak kıkırdak akasındaki.
  8. Dikkatli bir şekilde kıllar, yağ doku ve bağ dokusu iyi eğri cımbız kullanarak arka deri içinden çıkarın. PBS ile ıslak cilt tutmak.

2. bütün Dağı immunohistokimyasal Fare kulağı deri boyama

Not: Aşağıdaki bölümlerde tüm deneylerin NIH laboratuvar güvenlik kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

  1. Engelleme arabellek hazırlayın. Filtre % 10 ısı inaktive keçi serum (HIGS) PBS içinde % 0,2 triton ile X-100 (TX-100) engelleme arabellek seyreltilmiş veya % 10 eşek serum (DS) PBS içinde % 0,2 ile 0,45 µm filtre birimini kullanarak TX-100 engelleme arabellek seyreltilmiş.
  2. Arka aktarmak ve ön bir 24 cilde de içeren 1 mL % 10 HIGS engelleme arabellek veya iyi başına % 10 DS engelleme arabellek plakası. Cilt üzerinde bir karıştırıcı oda sıcaklığında hafif karıştırma ile 30 dk için kuluçkaya.
  3. Birincil antikor çözüm engelleme arabellekte (Malzemeler tablo) birincil antikorlar sulandrarak hazırlamak (ya da %10 HIGS veya % 10 DS).
    Not: Bütün mout immunohistokimyasal analizi (Tuj1, tavşan poliklonal IgG veya fare monocloncal Igg2a, 2 µg/mL son konsantrasyonu, 1:500 seyreltme), pan-nöronal marker nöron özgü sınıf III β-tübülin antikorlar ile yetişkin kulak deri Pan-endotel hücre işaretçisi trombosit endotel hücre adezyon molekül 1 (PECAM-1, hamster monoklonal IgG, 3.3 µg/mL son konsantrasyonu, 1:300 seyreltme), miyelin kılıf marker miyelin temel protein (MBP, tavşan poliklonal IgG, 1: 200 seyreltme, son konsantrasyonu 5 µg/mL) ve inflamatuar myeloid hücre işaretçisi CD11b (fare monoklonal Igg2b, 1:50 20 µg/mL son konsantrasyonu, seyreltme) şekil 1 ve Şekil 2' gösterildi. Deriyi Cy3 Birleşik antikor vasküler düz kas hücre işaretçisi α düz kas aktin (αSMA) ile birlikte ikincil antikorlar (2,6) ile inkübe. Kendimiz test birincil antikorlar Malzemeler tabloiçinde listelenen. Birden çok birincil antikorlar farklı türlerden elde edilen aynı anda karışabilir.
  4. Arka ve ön cilt 150 µL birincil antikorlar çözüm içeren yeni iyi transfer. Nazik bir karıştırıcı 4 ° c üzerinde gecede karıştırma ile cilt kuluçkaya.
  5. Ertesi gün, arka ve ön cilt 24 iyi plaka yeni kuyu transfer veya birincil antikorlar içeren engelleme arabellek Aspire edin. 1 mL de %2 HIGS seyreltilmiş DS PBS içinde % 0,2 TX-100 yıkama arabellek ile seyreltilmiş PBS % 2 veya % 0,2 TX-100 yıkama arabellek ile ekleyin. Her oda sıcaklığında bir mikser nazik karıştırma ile 15dk yıkama tamponunun 3 değişiklikler ile deri yıkayın.
  6. İkincil antikor çözüm (Tablo reçetesi) hazırlayın. İkincil antikorlar engelleme arabellekte seyreltik (ya da %10 HIGS veya % 10 DS) ve 0,22 µm polivinilidin difluoride (PVDF) membran şırınga filtre ikincil antikorlar içeren engelleme arabellek bağlı 1 mL şırınga için filtre.
    Not: Alexa 488 veya 633 Birleşik keçi Anti-tavşan IgG (H + L) veya Tuj1, Alexa 647 Birleşik keçi Anti-hamster IgG (H + L) PECAM-1, Alexa 488 Birleşik keçi Anti-tavşan IgG (H + L) MBP için için için Igg2a fare ve sıçan IgG (H + L) CD11b için Alexa 594 Birleşik kullanılmıştır 8 µg/mL son konsantrasyonu, 1:250 seyreltme ile. Deriyi Cy3 Birleşik αSMA antikor (2-3 µg/mL son konsantrasyonu, 1:500 seyreltme) ikincil Bu antikorlar ile birlikte ile inkübe.
  7. Belgili tanımlık eriyik vasıl 13.000 x g engelleme arabelleğinden ikincil antikorların toplanan parçacıklar kaldırmak 10 dakika santrifüj kapasitesi.
    Not: aynı anda farklı floresan konjuge ikincil antikorlar farklı türlerden elde edilen karışık olabilir.
  8. Arka ve ön cilt de 150 µL ikincil antikorlar çözüm içeren için transfer. 24 iyi plaka ışık önlemek ve cilt için 1s ile bir mikser, oda sıcaklığında hafif karıştırma kuluçkaya alüminyum folyo şal.
  9. Arka ve ön cilt 24 iyi plaka yeni kuyu transfer veya ikincil antikor çözüm damlalıklı tarafından tamamen Aspire edin. 1 mL % 2 HIGS çamaşır arabellek veya % 2 DS çamaşır arabellek ekleyin.
  10. Alüminyum folyo içinde 24 iyi plaka sarın ve her oda sıcaklığında bir mikser nazik karıştırma ile 15dk yıkama arabellek 3 değişiklikler ile yıkayın.

3. montaj kulak cilt slayt üzerinde

  1. Deri bir 35 x 10 mm2 Petri kabına dibinde yerleştirin. Dikkatli bir şekilde kıllar, yağ dokuları, bağ dokusu, toz ve elyaf geniş fotoğraf beyazlatma en aza indirmek için düşük aydınlatma ile stereomicroscope altında ince kavisli forseps kullanarak deri içinden çıkarın. PBS ile ıslak cilt tutmak.
  2. Cilt forseps kullanarak bir yapıştırıcı mikroskop slayt aktarın. Arka ve ön deri iç ile yer slayt üzerinde karşı karşıya. Deri forseps kullanarak düzleştirin.
  3. Photobleaching önlemek ve floresan sinyallerini korumak için sıvı Anti-fade montaj orta deride bağlayın. Hiçbir hava kabarcıklarının deri çevresinde veya üzerinde olduğundan emin olun.
  4. Coverslip deri örnekleri üzerinde dikkatle kapak ve bağlı cilt örnek slaytlar karanlık gecede montaj medya sağlam olsun izin vermek için oda sıcaklığında saklayın. Oje içeren coverslip mühür ve uzun süreli depolama için 4 ° C'de saklayın.

4. confocal mikroskobu

  1. Fluorophores için uygun lazerler ayarlayın. Confocal mikroskop üç lazer kaynakları (Argon 488 nm, DPSS 561 nm ve Helene 633 nm) ile bu deneyde kullanılır.
  2. Aynı anda önlemek ve herhangi bir çakışma azaltmak için üç kez lekeli örnekleri heyecanlandıran sıralı tarama aracını kullanın.
    Not: Sıralı bir şekilde sıralı tarama modunu kullanarak görüntüleri alınacaktır.
  3. 10 X amaç altında görüntü. Bütün kulak cilt yakalamak için döşeme tarama aracını kullanın. Z-yığın ayarla ve z-pozisyon kulak cilt tüm kalınlığı kapsadığından emin olun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yetişkin fare arka kulak cilt (şekil 1A) ve ön kulak cilt (şekil 1B) olduğunu αSMA (kırmızı), Tuj1 (yeşil), antikorlar ile immunostained ve PECAM-1 (mavi). Posterior cilt immunostained nöro-bağışıklık dağıtım CD11b (kırmızı) ve MBP (yeşil), Tuj1 (mavi) ile birlikte (şekil 2A) antikorları kullanarak çalışma yapıldı. CD11b dağılımı+ inflamatuar hücreler, makrofajlar da dahil olmak üzere bir tek hücresel çözünürlükte (şekil 2B) algılandı.

Figure 1
Şekil 1: hizalama ofperipheral sinirler ve kan damarları yetişkin kulak derideki. Bütün monteli arka ve ön kulak cilt αSMA (kırmızı), Tuj1 (yeşil), antikorlar ile üçlü ayirt confocal mikroskobu ve PECAM-1 (mavi) gösterilir. (A) VSMC kaplı büyük çaplı kan damarları hizalamak periferik sinirler posterior kulak deri ile. (B) daha küçük çaplı damarlar VSMCs ile kaplı hizalamak ön kulak cilt daha küçük çaplı periferik sinir demetleri ile. Ölçek çubuğu = 1 mm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Myelination periferik sinirler ve CD11b+ myeloid hücre dağıtım yetişkin kulak derideki. Bütün Dağı üçlü ayirt confocal mikroskobu arka kulak cilt CD11b (kırmızı) ve MBP (yeşil), Tuj1 (mavi), birlikte antikorlar ile gösterilir. (A)orta büyük çapı periferik sinirler myelinated. (B) yakın çekim görüntü (A). CD11b+ inflamatuar hücrelerin arka kulak deride eşit olarak dağıtmak. Ölçek çubuğu 1 mm (A), 100 µm (B) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu iletişim kuralı nöro-vasküler yapılar ve bağışıklık hücre dağıtım analizi için yetişkin kulak derinin bütün-mount immunonohistochemical görüntüleme açıklar. İnanıyoruz Bu yöntem dallanma morfogenez ve periferik sinirler ve kan damarları desenlendirme, hem de bağışıklık hücreleri ve saç gibi cilt bileşenlerinin üç boyutlu dağıtım çalışmaya araştırmacılar için çok sayıda deneysel avantajları folikülleri. Görüntüleme sonuçlarını görüntüleme yazılımları kullanarak daha fazla nicel analiz için sayısal.

Uygun hazırlık kulak deri bu protokolü başarısı için önemlidir. İlk olarak, kulak cilt dikkatle yakında fare ötenazi sonra disseke. Kulak cilt arka kısmı kıkırdak uzak soyulmuş. O zaman, kıkırdak ön deri boyama önce soyulmuş. İkinci olarak, bağ dokusu, yağ doku ve saç yavaşça ve iyice montaj önce kaldırılması gerekir. Periferik sinirler cilt yüzeyinde varlığı nedeniyle dikkatli kaldırma sinirler zarar görmesini önlemek için gereklidir. Üçüncü olarak, kulak cilt kulak cilt bazı kalın dokulardan kaldırılması ile açılmalı. Son olarak, kulak deri hava kabarcığı düz monte edilmiş olmalıdır.

Bu iletişim kuralı bir sınırlama kulak kulak öğesini cilt kulak etiketi bir delik veya bir yara izi neden olur gibi analiz için uygun değildir. Bu nedenle, analiz etmek için birden fazla fareler diye fare kuyruk üzerinde etiketleme gibi kulak etiketi dışında farklı yöntemlerle tanımlanması gereklidir.

Her ne kadar bir önceki raporlar bir bölge ilgi ile yüksek çözünürlüklü10yansıması olduğunu gösterdi tüm kulak deri döşeme tarama aracı ile confocal mikroskobu tarafından taranabilir. İlginçtir, Bütün Dağı görüntüleme tüm kulak derinin farklı dallanma morfogenez ve periferik sinirler ve kan damarları arasında arka ve ön deri (şekil 1) desenlendirme ortaya koymaktadır: geniş çaplı posterior tenli sinir demetleri (20-50 µm) yenilenmiş geniş çaplı kan damarları αSMA+ VSMCs (20-60 µm) ile kaplı ile uyumlu ön sırasında cildi daha küçük çaplı sinir demetleri (< 20 µm) daha küçük çaplı ama yenilenmiş kan damarları ile uyumlu αSMA+ VSMCs ile kaplı (< 20 µm).

Atopik dermatit12, sedef13gibi insan dermatolojik hastalıklar mekanizmasının aydınlatmak, şifa14ve diyabetik nöropati15yara ile fare modelleri11 dikkate değer bir dizi vardır. Bu iletişim kuralı obezite diyet kaynaklı fareler kulak cilt için başvuran ve diyabetik nöropati16çalışmaya 2 diyabetik fare yazın. Bu iletişim kuralı Juvenil değişik patolojik koşullarda yetişkin fare cilde uygulanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

K. Gill Laboratuvar Yönetimi için teşekkür ediyoruz ve fare Bakımı ve R. Reed konusunda yardım almak için 50 hayvan tesis ve F. Baldrey yönetim yardım almak için teknik destek, J. Hawkins ve personel Ulusal kurumları, Sağlık (NIH) bina. Onların kulak cilt diseksiyon protokolü, N. Burns Editör Yardım ve üyeleri kök hücre Laboratuvarı ve teknik yardım ve düşünceli tartışma için Neuro-vasküler Biyoloji paylaştığınız için teşekkür ederiz S. Motegi ve M. Udey. T. Yamazaki bilim promosyon (JSP'ler) NIH-KAITOKU için Japonya Derneği tarafından desteklenmiştir. Bu eser Ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (Y.M. için HL005702-11), Intramural araştırma programı tarafından desteklenen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 x Phosphate Buffered Saline KD Medical RGE-3210 PBS, without Ca2+/Mg2+
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025-092 HBSS, with Ca2+/Mg2+
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in PBS
Triton X-100 Sigma X100 Detergent
Normal goat serum Gibco 16210064 Component of blocking/washing buffer
Normal donkey serum Jackson Immuno research 017-000-121 Component of blocking/washing buffer
Curved fine tweezers Dumont RS-5047
Curved tweezers Integra Miltex Vantage V918-782, V918-784
Filter Unit 0.45 mm Thermo Scientific 157-0045 For filtration
1 mL syringe Coviden 8881501400 For filtration
Syringe filter Unit 0.22 mm Millex-GV SLGVR04NL For filtration
ProLong Gold Thermo Scientific P36934 Anti-fade mounting medium
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing
Dissecting microscope Leica MZ95
Confocal microscope Leica TCS SP5
Photoshop CC 2017 Adobe Graphics editor software
Illustrator CC 2017 Adobe Graphics editor software
Image J NIH Image processing software
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody Millipore MAB1398Z Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody BD Pharmingen 553369 Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-αSMA antibody conjugated with cy-3 Sigma C6198 Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500
Anti-EphB1 antibody Santa Cruz sc-9319 Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100
Anti-neuron-specific Class III β-tubulin (Tuj1) Abcam AB18207 Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500
Anti-Tuj1 antibody Covance MMS-435P Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500
Anti-MBP antibody Abcam AB40390 Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody Chemicon AB152 Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500
Anti-Peripherin antibody Chemicon AB1530 Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antibody Bio-Rad MCA74G Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50
Anti-CD45 antibody Thermo Fisher Scientific 14-0451-85 Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500
Anti-CD3 antibody Bio-Rad MCA1477T Rat IgG1, immune cell marker, 1:100
Anti-CD45R (B220) antibody Thermo Fisher Scientific 14-0452 Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A11122 Rabbit polyclonal, 1:300
Anti-GFP antibody Abcam Ab13970 Chicken polyclonal, 1:500
Anti-β-gal antibody Cappel 55976 Rabbit polyclonal, 1:5000
Anti-RFP antibody Abcam Ab62341 Rabbit polyclonal, 1:300
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A11034 Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 Jackson Immuno research 127-605-160 Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 Jackson Immuno research 112-585-167 Rat polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 Thermo Fisher Scientific A21136 Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
  3. Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. (2011).
  4. Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
  5. Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
  6. Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
  7. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. e51749 (2014).
  8. Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. (2017).
  9. Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540 (2014).
  10. Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
  11. Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
  12. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
  13. Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
  14. Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
  15. O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
  16. Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).
Bütün-Confocal mikroskobu yetişkin kulak cilt için mount: nöro-vasküler dallanma morfogenez ve bağışıklık hücre dağıtım modeli sistemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).More

Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter