Summary
Wij presenteren een eenvoudige en betrouwbare protocol voor het meten van ijzergehalte in plantaardige weefsels met behulp van de colorimetrische Pruisisch blauw-methode.
Abstract
Ijzer, één van de meest belangrijke micronutriënten in levende organismen, is betrokken bij basic processen, zoals ademhaling en fotosynthese. Ijzergehalte is vrij laag in alle organismen, ten bedrage van in planten ongeveer 0.009% van het drooggewicht. Tot op heden, is een van de meest nauwkeurige methoden voor het meten van de concentratie van het ijzer in plantaardige weefsels vlam atomaire absorptie spectroscopie. Echter, deze aanpak is tijdrovend en duur en vereist specifieke apparatuur niet vaak gevonden in de laboratoria van de plant. Dus is een eenvoudiger, maar nauwkeurige methode die kan worden routinematig gebruikt nodig. De colorimetrische Pruisisch blauw-methode wordt regelmatig gebruikt voor kwalitatieve ijzer kleuring in dier- en plantensoorten histologische secties. In deze studie aangepast we de Pruisisch blauw methode voor kwantitatieve metingen van ijzer in tabak verlaat. Wij gevalideerde de nauwkeurigheid van deze methode met behulp van zowel atomaire spectroscopie en Pruisisch blauw kleuring gevonden van een lineaire regressie te meten ijzergehalte in de dezelfde monsters (R2 = 0.988) tussen de twee procedures. We concluderen dat de Pruisisch blauw-methode voor meting van de kwantitatieve ijzer in plantaardige weefsels nauwkeurige, eenvoudige en goedkope. De lineaire regressie hier gepresenteerd kan echter niet dienstig voor andere plantensoorten, als gevolg van mogelijke interacties tussen het monster en reagens. Oprichting van een regressie-curve is dus nodig voor verschillende plantensoorten.
Introduction
Ijzer (Fe) is een belangrijke micronutriënt in alle levende organismen. In planten is het een essentiële micronutriënt1 vanwege zijn betrokkenheid bij fundamentele processen, zoals ademhaling, fotosynthese en chlorofyl biosynthese. Hoge accumulatie van vrij ijzer ionen is schadelijk voor de plantaardige cellen als gevolg van reacties leidt tot het vrijkomen van vrije radicalen veroorzaakt oxidatieve stress. U behoudt ijzer homeostase binnen de plant cel, zijn ionen opgeslagen in de vacuolen en afgezonderd binnen ferritins, eiwit kooien rechtstreeks betrokken is bij iron homeostase2 en de opslagstructuur van de belangrijkste van ijzer in alle levende organismen. Ijzertekort bloedarmoede beïnvloedt tegelijkertijd, een aanzienlijk deel van de menselijke bevolking, wat resulteert in een toenemende behoefte aan plant Fe biofortification. Als gevolg van de unieke eigenschappen van de plant Ferritine biedt voedsel verrijking met Ferritine-strijkijzer een veelbelovende strategie ter bestrijding van dit probleem van ondervoeding3.
Ijzer ionen zijn voornamelijk gevonden in twee oxidatie Staten, namelijk de Ferro (divalente Fe2 + of ijzer (II)) en ijzer(III) (driewaardig Fe3 + of ijzer (III)) vormen. Verschillende andere vormen van ijzer, zoals ijzer clusters4, zijn ook gevonden in de cellen. Fe wordt opgeslagen als ijzeroxide binnen de cel en natuurlijk vormen hematites (Fe2O3) en ferryhidrites ((Fe3 +)2O3•0.5 H2O) onder fysiologische omstandigheden5. De hydroxiden gevormd bij deze reacties wordt vooral de ijzer(III) vorm, hebben zeer lage oplosbaarheid. IJzeren retentie wordt dus beïnvloed door de pH van de oplossing en is grotendeels in een vaste toestand boven pH 5-6.
Gezien de slechte oplosbaarheid en hoge reactiviteit van Fe, moet haar overdracht tussen plantaardige weefsels en organen gepaard gaan met geschikte chelaatvormers moleculen. Bovendien moeten haar redox-Staten tussen de ferro- en ijzer(III) vormen1 worden gecontroleerd. Binnen bladeren, ongeveer 80% van het ijzer is gevonden in de fotosynthetische cellen, vanwege haar essentiële rol in het elektronentransport systeem, in de biosynthese van de cytochromes, chlorofyl en andere Heem moleculen, en bij de vorming van Fe-S clusters7. In het geval van ijzer overtollige binnen de cel, wordt het overschot in de vacuole waar het metaal wordt opgeslagen in de Ferritine moleculen8translocated.
Ijzer kan worden gemeten in plantaardige weefsels door verschillende methoden, inclusief vlam atomaire absorptie spectroscopie9 (FAAS) of colorimetrische testen10, de voormalige wordt veel nauwkeuriger dan de laatste. FAAS is een zeer nauwkeurige techniek waarmee een te bepalen van de elementaire samenstelling van een monster op grond van de elektromagnetische emissie van de afzonderlijke elementen. FAAS omgezet in metaalionen atomaire Staten door vlam-verwarming van het monster, wat leidt tot ion excitatie en emissie van een specifieke golflengte wanneer een bepaalde ion naar de grondtoestand terugkeert. De emissies van de verschillende ionen zijn gescheiden door een monochromator en gedetecteerd door een absorptie sensor11. FAAS dient dus te kwantificeren direct concentraties ijzer. Andere technieken voor het visualiseren van ijzer in biologische weefsels zijn echter beschikbaar. Inductief gekoppeld plasma-mass spectroscopie (ICP-MS)12 is een zeer exacte techniek voor het meten van ijzer en andere sporenelementen, maar het gebrek aan apparatuur, zowel voor FAAS en ICP-MS, is een veelvoorkomend probleem. Aan de andere kant, meting van de ijzer door kaliumthiocyanaat colorimetrie13 ontbreekt precisie en kleine verschillen tussen monsters herkent. Pruisisch blauw kleuring van14,15,16,17 is een indirecte methode op basis van de reactie van ijzer(III) kaliumferrocyanide (K4van Fe(CN)6) met Fe kationen, produceren een sterke blauwe kleur, en wordt gebruikt voor de detectie van de kwalitatieve ijzer in histologische secties van dierlijke en plantaardige weefsels.
Metalen (nul-valent) ijzer is zeldzaam in de lithosfeer. De dominante niet-complexvorm Ionische vorm van ijzer in het milieu is het meestal ingegeven door de hoeveelheid zuurstof in de omgeving, met Ferro ijzer wordt relatief meer overvloedig in zuurstofvrije omgevingen en ijzer(III) ijzer overheersen in aërobe sites. Deze laatste vorm is ook dominant in een zeer zure omgeving, hoewel het oorzakelijke agens van oxidatie van ijzer ijzer vaak in zuurstofvrije en zure omgeving18 verschillen. Wanneer ijzer is ontbindend in 4% HCl (pH = 0) in een aërobe omgeving, het grootste deel van het verdunde ijzer bestaat zoals de ijzer(III) (Fe3 +)19,20 vormen.
De reacties tussen Fe ionen en K4Fe(CN)6 zijn als volgt:
Fe3 +: FeCl3 + K4Fe(CN)6 KFe(III)Fe(II)(CN)6¯ + 3KCl =
Fe2 +: 4 FeCl2 + 2 K4Fe(CN)6 = Fe4(Fe(CN)6)2 + 8 KCl
In de huidige studie vroegen we of Pruisisch blauw kleuring kunnen nuttig zijn voor het meten van de niveaus van het ijzer in oplossing.
Aanvankelijk, gecontroleerd we de correlatie tussen de concentratie van Fe in waterige oplossing en Pruisisch blauw kleuring. De Fe (als FeCl2, FeCl3 of een mengsel van 1:1 van de twee) concentratie in waterige oplossingen werd zowel door atomaire spectroscopie extinctie (OD) gemeten na toevoeging van Pruisisch blauw. Figuur 1 toont de curven van de lineaire regressie voor metingen verkregen door elke methode. Wij geconcludeerd dat de Pruisisch blauw methode kan worden gebruikt voor de kwantitatieve analyse van ijzer-concentratie in de oplossing.
Figuur 1: lineaire regressies tussen Fe concentratie gemeten door FAAS en lichtabsorptie (OD, 715 nm) verkregen door de Pruisische blauwe methode. De blauwe vierkantjes en de lijn vertegenwoordigen de Fe2 + oplossing, de rode vierkantjes en de lijn vertegenwoordigen de Fe3 + oplossing en de zwarte vierkantjes en lijn vertegenwoordigen een 1:1-mengsel tussen Fe2 + en Fe3 +. De volgende regressies werden verkregen: [Fe2 +] = 3 + 123 x OD, r = 0.996, R2 = 0.989; [Fe3 +] = 1 + 292 x OD, r = 0.999, R2 = 0.997; en [Fe2 +/ 3 +] = 11 + 146 x OD, r = 0.983, R2 = 0.956. De Fe2 + donor was FeCl2 en de Fe3 + donor was FeCl3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aan te passen de colorimetrische Pruisisch blauw methode voor kwantitatieve ijzer analyse van plantaardige weefsels, werd het ijzergehalte van tabak blad as gemeten door vlam atomaire absorptie spectroscopie en Pruisisch blauw kleuring. Er werd een goede correlatie tussen de resultaten van door de twee technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plant materiaal en groei-omstandigheden
- Zaad één tabak (cultivar Samsun) zaad per 5 cm x 5 cm pot gevuld met standaard pot medium. Plaats de potten op laden. De planten groeien in een groei ruimte onder de voorwaarden van de lange dag (16/8 h licht/donker) bij een constante temperatuur van 23 ° C. Irrigeren met leidingwater tot water afvoerleidingen van de pot.
- Na 50±5 dagen, Fe behandelingen in de irrigatie, volgens de concentraties die geschikt zijn voor het experiment te beginnen. Bijvoorbeeld, gebruikten we een aantal uiteenlopende concentraties van het ijzer van 0 tot 6 mM, aangevuld met een oplosbare Fe complexvormer (Fe EDDHA). Bevloeiing van de planten met de passende oplossing om de twee dagen (Voorkom uitdroging) voor 6-8 dagen.
2. voorbereiding van de bladeren van de meting van de ijzer
Opmerkingen: Alle materialen worden gebruikt moet ijzer-gratis te verminderen het risico van besmetting van de ijzeren. Reinig de mortier en een stamper tweemaal met 4% HCl-oplossing en drogen met filtreerpapier telkens vóór gebruik. Als enig materiaal wordt hergebruikt, schoon tweemaal met 4% HCl-oplossing en drogen met filtreerpapier.
- Los de blaadjes uit de stengel met de hand, met behulp van handschoenen (gebruik geen metalen apparatuur). Ongeveer 10 g van bladeren (verse gewicht) gebruiken voor elk monster. Schoon op elk blad met dubbel gedestilleerd water (DDW) met behulp van een spuitfles. Deze stap is belangrijk om Fe verontreiniging te voorkomen.
- De bladeren op een papieren handdoek droog en leg ze in een papieren zak. De papieren zakken overbrengen in een oven bij een constante temperatuur van 80 ° C voor 2-3 dagen.
- Droog, verpletteren de bladeren tot poeder met behulp van een mortier en een stamper en een transfer naar steriele 15 mL plastic buizen.
3. branden de bladeren naar Ash
Opmerkingen: Het gebruik van een lage pH (dicht bij 0) oplossing van HCl is bedoeld om ijzer oplosbaarheid. De steenwol wordt gebruikt om te voorkomen dat de gassen ontsnappen de flacon tijdens het branden.
- Weeg af een nieuwe, verzegelde 20 mL Scintillatie flesje zonder het deksel. Opmerking de waarde of de waarde instelt op nul met behulp van de knop tarra. Voeg de gemalen gedroogde bladeren (sample) aan de flacon.
- Wegen van het monster en de container en noteer de waarde. Sluit de flacon met steenwol.
- 3 extra flesjes wegen zonder toevoeging van monsters en Let op hun waarden. Deze flesjes zal worden gebruikt als besturingselementen om te evalueren van de hoeveelheid steenwol die kunnen hebben geleid tot een toename van het gewicht van het monster.
- Plaats de flesjes monster en controle in een oven en beginnen branden met behulp van de volgende stappen van de temperatuur: kamertemperatuur, snelle stijging tot 425 ° C, en, ten slotte, 425° C gedurende 4 uur. Tegen die tijd zal hebben de droge bladeren aan as gedraaid.
- Laat het afkoelen van de monsters tot ongeveer 100 ° C maar niet onder deze temperatuur voor de volgende twee stappen om te voorkomen dat vocht, kon beïnvloeden het uiteindelijke gewicht van het monster. Met behulp van zware handschoenen, verwijder de monsters uit de oven met pincet, houden de flacon exteriorly.
- Plaats van de flesjes op een vlakke ondergrond, de steenwol verwijderen en sluit de flesjes met hun oorspronkelijke deksels.
- Weeg de 3 controle flesjes (zie 3.3) en berekenen van hun gemiddelde gewichtstoename. Als gewichtstoename gelijk is of hoger aan 1% van het gewicht van de as (zie stap 4.2), gebruikt deze waarde als een schatting van de meetfout.
4. voorbereiding van de as voor meting van de ijzer
Opmerkingen: De laatste ijzer-concentratie in het oorspronkelijke monster wordt berekend als het gewicht van de as, gedeeld door de toegevoegde volume HCl.
- Bereid een 1 M HCl-oplossing (4% HCl) door toevoeging van 12,5 mL van een stamoplossing van 37% HCl tot 87.5 mL van DDW (in een maatkolf van plastic of glas).
- Wegen van een plastic tube van 15 mL en noteer de waarde of de waarde instelt op nul met behulp van de knop tarra. Overdracht van de as aan de buis, wegen, en noteer de waarde. Dit is het gewicht van de as.
- Voeg 5 mL van de 1 M HCl aan de as. Filtreer de as door een 22 µm filter en voeg een extra 5 mL 1 M HCl via hetzelfde filter.
- Het eindvolume moet 10 mL. Merk op dat deel van de oplossing gaan in het filter verloren zal.
Opmerking: De monsters zijn nu klaar voor Fe meting FAAS of door de Pruisisch blauw-methode. - Maak een ijklijn met de Fe-concentratie door atomaire spectrometrie en de Pruisisch blauw methode gemeten (Zie Figuur 4) voor elke plantensoorten. Fe concentratie kan vervolgens worden gemeten door de Pruisische blauwe methode alleen.
5. meting van de concentratie van de Fe door FAAS
- 4 mL van elk monster voor meting door FAAS verwijderen.
- Verdeel de resultaten van de meting van FAAS door het gewicht van de as. Deelt u de resulterende waarde door 0.01 (omdat de as werden ontbindend 10 ml). De resulterende waarde is de ijzer-concentratie per gram ash (ppm).
6. voorbereiding van de Pruisisch blauw kleurstofoplossing
- Bereiden een 4% Pruisisch blauw oplossing door toevoeging van 4 g K4Fe(CN)6 tot 100 mL DDW en vortex (andere volumes en/of concentraties kunnen worden gebruikt voor verschillende eisen). Opgemerkt moet worden dat in deze studie, een minder geconcentreerd Pruisisch blauw oplossing dan eerder gemeld (20%)14 werd gebruikt.
- Bewaar deze oplossing in het donker bij 4 ° C tot gebruik. De oplossing is stabiel voor 6 maanden wanneer opgeslagen in dergelijke omstandigheden.
7. het genereren van een kalibratiekromme voor de Pruisisch blauw-methode met behulp van FAAS resultaten
Let op: De ijzer-concentratie in de as met de volgende formule berekenen
Vergelijking 1
C: de concentratie, V: monstervolume, b: ash gewicht (g).
- Meng 0,50 mL Pruisisch blauw oplossing en 0,50 mL 1 M HCl. Dit zal dienen als de blanco-oplossing.
- Meng 0,5 mL van het monster (as in 4% HCl, zoals beschreven in sectie 3) en 0,5 mL van Pruisisch blauw-oplossing (stap 6.1) door pipetteren. Wacht ten minste 1 minuut maar niet meer dan 5 minuten. Na 5 minuten, zal sedimentatie in de monsters optreden.
- De mix overbrengen in een cuvet en meten van de OD op 715 nm met behulp van een spectrofotometer. Opmerking de waarde.
- De OD-waarde (stap 7.3) delen door het gewicht van de as (stap 3.2) van het monster. Het resultaat is OD per gram ash.
- Uitzetten van de lineaire regressie tussen de concentraties ijzer verkregen uit de FAAS-metingen (Y-as) en de OD-waarden (X-as). Gebruik de resultaten verkregen in stap 5.2 en 7.4. Berekenen van de regressie-formule, Y = een + bX, waarbij Y staat voor ijzer-concentratie, een vertegenwoordigt de extinctie snijden, b vertegenwoordigt de extinctie helling en X de OD.
8. met behulp van de Pruisisch blauw-methode voor de bepaling van ijzer niveaus in andere monsters van hetzelfde Type Plant
Opmerkingen: Aangezien een kalibratiekromme reeds is vastgesteld voor dit soort plant, ijzeren concentratie in elke nieuwe monsters van hetzelfde type plant kan worden direct berekend met behulp van de lineaire regressie-formule.
- Voer de stappen uit in de punten 3 en 4, gevolgd door stappen 7.1 tot 7.4.
- Bereken de ijzer-concentratie in de oplossing met behulp van de formule verkregen van de lineaire regressie (stap 7.5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer dit protocol correct wordt uitgevoerd, moet een uitstekende correlatie tussen de resultaten van de Pruisisch blauw en atomaire spectroscopie methoden krijgen. Daarom kan de Pruisisch blauw methode gemakkelijk worden gebruikt om een nauwkeurige meting van de ijzer-concentratie in de monsters van de plant, zoals blijkt uit het volgende experiment.
Tabaksplanten waren gegroeid zoals beschreven in het protocol en geïrrigeerd zijn met water met verschillende ijzer concentraties (0, 1, 2, 3, 4, 5 of 6 mM) gedurende zeven dagen. De planten werden vervolgens geoogst, gereinigd en gedroogd voor 3 dagen bij 80 ° C. De volgende stappen (bijvoorbeeld van stap 2.3) van het protocol werden gevolgd zoals beschreven. Aangezien de controle flesjes een variatie van minder dan 1% van het gewicht van de as toonde, is deze waarde niet toegevoegd aan verdere berekeningen.
Ijzer-concentratie werd gemeten door FAAS. Tabel 1 toont representatieve resultaten van deze metingen. Gegevens die zijn verkregen uit 21 monsters (7 concentraties in 3 repliceert) werden gebruikt voor het genereren van een kalibratiekromme.
| Behandeling (mM ijzer in irrigatie) | Plant | Ijzer-concentratie in de HCl-oplossing (ppm) |
| 0 | A | 7.1 |
| 1 | B | 16,6 |
| 2 | C | 23.4 |
| 3 | D | 31.2 |
| 4 | F | 47.4 |
| 5 | G | 50,7 |
| 6 | H | 41,6 |
Tabel 1: Ijzer-concentratie in de ash-oplossingen van tabak vertrekt vanuit gewassen die geïrrigeerd zijn met water met een verschillende ijzer gehalte.
De ijzer-concentratie in de as van de hierboven genoemde 21 monsters werd berekend aan de hand van de waarden die zijn verkregen door FAAS (zie opmerking in stap 7). De resultaten toonden aan dat ijzer-concentratie in het irrigatiewater sterk beïnvloed blad ijzergehalte (Figuur 2).
Figuur 2: Effect van ijzer in de irrigatie op ijzer concentratie in tabak kopen verlaat. Staven standaarddeviaties (n = 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
In een apart experiment (niet afgebeeld), de spectra van de absorbantie van de oplossingen met verschillende concentraties van Fe2 + en Fe3 + werden gemeten en de beste piek werd verkregen op 715 nm. Alle spectra van de 21 monsters werden ook getest met de Pruisisch blauw methode. Het was duidelijk dat absorptie bij 715 nm was ook de optimale golflengte hier ook (Figuur 3). Deze golflengte werd daarom gebruikt in alle experimenten.
Een lineaire regressie curve was uitgezet tussen ijzer concentratie waarden verkregen door FAAS en absorptie (OD) verkregen met behulp van de Pruisisch blauw methode voor de monsters vertegenwoordigd in Figuur 3 (Figuur 4). De volgende regressie is verkregen: [Fe] = 0.32 + 25.3 x OD, r = 0.994 en R2= 0.988.
Figuur 3: absorptie golflengte spectra van de assen van de tabak gemengd met Pruisisch blauw oplossing zoals beschreven in het protocol. De golflengte spectra werden verdeeld door de concentratie van ash. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: lineaire regressies van Fe concentratie in tabak as gemeten door FAAS en lichtabsorptie (OD, 715 nm) verkregen door de methode Pruisisch blauw. De volgende regressie is verkregen: [Fe] = 0.32 + 25.3 x OD, r = 0.994, R2= 0.988. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De verkregen lineaire regressie kan nu worden gebruikt voor nieuwe monsters van hetzelfde type plant, zoals in stap 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Meting van de ijzer in plantaardige weefsels is zeer belangrijk voor de evaluatie van de effecten van irrigatie of andere omgevingsfactoren. We beschreven hier, een gemakkelijke en nauwkeurige colorimetrische methode voor Fe inhoud metingen in tabaksbladeren, die gemakkelijk aangepast aan andere plantensoorten en weefsels worden kan.
In het optimaliseren van voorwaarden voor de colorimetrische methode, gebruikten we een lage pH-medium (pH < 1.0) dat ijzer oplosbaarheid. Het brandproces werd uitgevoerd om alle vormen van ijzer vrij te geven en om ervoor te zorgen dat geen in de monsters aanwezige contaminanten de resultaten zou wijzigen. Met betrekking tot ijzer besmetting, men in gedachten dat 6,7% van de aardkorst bestaat uit ijzeroxide soorten (FeOn)21 moet houden en dat hun concentraties 0.009 plant droge gewicht22gewichtspercenten kunnen bereiken. Dus zou moeten men overwegen het risico van besmetting, sinds stof, die bevatten kan maar liefst 3-7% ijzer (afhankelijk van de regio)23, kan sterk van invloed op de resultaten. Het is ook noodzakelijk zorgvuldig controleren het ijzergehalte van alle apparatuur die wordt gebruikt in het experiment en nemen alle nodige voorzorgsmaatregelen om besmetting te voorkomen. Het is aanbevolen om het schoonmaken van alle apparatuur die in contact met de lucht was geweest of is die wordt hergebruikt in de experiment met 4% HCl-oplossing. Het gebruik van een metalen hulpmiddelen, zoals schaar of lepels, moet absoluut worden vermeden, in plaats daarvan wordt vervangen door glas of plastic versies. Kritische stappen om ijzer verontreiniging te voorkomen naar voren zijn gebracht in stap 3.1 en 4.1, bijvoorbeeld.
Bij gebreke te verkrijgen van een signaal van een monster kan optreden als gevolg van problemen die zich voordoen bij de verschillende stappen in het protocol. In dit geval is het aanbevolen om het controleren van de reagentia tegen oplossingen met een bekende ijzer-concentratie. Als de problemen aanhouden, kan verse Pruisisch blauw reagens moet worden voorbereid. Moet de standaard, blijkt echter een signaal, dit geeft aan dat dat de ijzer-concentratie in de steekproef onder de drempel van detectie en dat het monster meer geconcentreerd moet worden. Grote variaties van replicaat-organismen kunnen voortkomen uit ijzer besmetting en vergt het gebruik van nieuwe monsters.
Kalibratiekrommen moeten worden gegenereerd om de zes maanden, of elke keer een nieuwe batch van Pruisisch blauw reagens wordt gebruikt. De eerste kalibratiekromme moet worden opnieuw gevalideerd door ijzergehalte in ten minste 6 monsters te meten en om te bevestigen dat de lineaire regressie nog steeds juist is. In de kalibratiekrommen is het essentieel om waarden dicht bij + 1 of -1 voor r (de correlatiecoëfficiënt) en dicht bij 1 voor R2 (de determinatiecoëfficiënt)24,25,26te verkrijgen. Terwijl een perfecte lijn een R2 waarde 1 hebben zou, zijn de meeste R2 waarden over 0.95 voor kalibratiekrommen aanvaardbaar.
Beperkingen van het protocol ook het feit dat verschillende plantaardige weefsels en soorten verschillende correlatie krommen met behulp van de beschreven procedures voor ijzer concentratie bepaling kan tonen. Het is daarom raadzaam voor het uitvoeren van een pilot test om ervoor te zorgen dat de correlatie curve juist voor een gegeven experiment is. Als u wilt gebruiken de curve voor de verkregen resultaten, de zojuist gemeten OD-waarde moet worden vervangen in de formule Y = een + bX. In het onderhavige geval, werd de volgende formule gebruikt: [Fe] = 0.32 + 25.3 x OD.
Een andere beperking vloeit voort uit de noodzaak van een vrij grote hoeveelheid plantaardige weefsels. Dit kan tot op zekere hoogte worden omzeild door aanpassing van het volume van de HCl gebruikt om op te lossen van de as (zie stap 5.3) teneinde een passende signaal. De hier beschreven methode is echter ook een goede optie als kostbare apparatuur, zoals die gebruikt voor ICP-MS, of klaar toegang tot FAAS niet beschikbaar is en/of talloze voorbeelden van de dezelfde plantensoorten moeten worden geanalyseerd.
Extra toepassingsmogelijkheden van de Pruisisch blauw-methode als een ijzer-detectiesysteem omvatten kwantitatieve ijzer detectie in eender welk organisch materiaal dat kan worden gebracht naar ash, alsook in anorganische materie, zoals bodems.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Israël ministerie van wetenschap, technologie en Spaceand door een subsidie van de Chief Scientist van het Israëlische ministerie van landbouw (#16-16-0003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Hexacyanoferrate(II) | Fisher Chemical | 14459-95-1 | Reagent for the Pussian Blue |
| Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 μm | Millec | SLGP033RS | Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution |
| Scintillation Vials | Fisherbrand | 03-337-4 | Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure. |
| Disposable Syringe 10 ml | Medi-Plus | 1931 | Syringe used during the filtration |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 231-595-7 | Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials |
| Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN | Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab | Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407. | Tobacco cultivar used in this protocol |
| Glass Wool (Rock Wool) | Sigma-Aldrich | 659997-17-3 | Used in the procedure of burning samples in the furnace. |
References
- Kobayashi, T., Nishizawa, N. K. Iron uptake, translocation, and regulation in higher plants. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 131-152 (2012).
- Bradley, J. M., Le Brun, N. E., Moore, G. R. Ferritins: Furnishing proteins with iron. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 21 (1), 13-28 (2012).
- Zielińska-Dawidziak, M. Plant ferritin - a source of iron to prevent its deficiency. Nutrients. 7 (2), 1184-1201 (2015).
- Johnson, D. C., Dean, D. R., Smith, A. D., Johnson, M. K. Structure, function, and formation of biological iron-sulfur clusters. Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 247-281 (2015).
- Guo, H., Barnard, A. S. Naturally occurring iron oxide nanoparticles: morphology, surface chemistry and environmental stability. Journal of Materials Chemistry A. 1 (1), 27-42 (2013).
- Hem, J. D., Cropper, W. H. Chemistry of iron in natural water. Report US Geological Survey. , 1-31 (1962).
- Rout, G. R., Sahoo, S. Role of iron in plant growth and metabolism. Reviews in Agricultural Science. 3, 1-24 (2015).
- Speretto, R. A., Ricachenevsky, F. K., Stein, R. J., de Abreu Waldow, V., Fett, J. P. Iron stress in plants Dealing with deprivation and overload. Plant Stress. 4, 57-69 (2010).
- Tautkus, S., Steponeniene, L., Kazlauskas, R. Determination of iron in natural and mineral waters by flame atomic absorption spectrometry. Journal of the Serbian Chemical Society. 69 (5), 393-402 (2006).
- Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. Journal of Microbiological Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
- PerkinElmer. Atomic Spectroscopy - Guide to Selecting the Appropriate Technique and System. 16, (2011).
- Wachasunder, S. D., Nafade, A. Precision and accuracy control in the determination of heavy metals by atomic absorption spectrometry. Science. 58, 517-528 (2001).
- Woods, J. T., Mellon, M. G. Thiocyanate method for iron. A spectrophotometric study. Industrial & Engineering Chemistry Analytical Edition. 13 (8), 551-554 (1941).
- Perls, M. Nachweis von Eisenoxyd in gewissen Pigmenten. Virchows Archiv Fur Pathologische Anatomie Und Physiologie Und Fur Klinische Medizin. 39 (1), 42-48 (1867).
- Connorton, J. M., Jones, E. R., Rodriguez-Ramiro, I., Fairweather-Tait, S., Uauy, C., Balk, J. Altering expression of a vacuolar iron transporter doubles iron content in white wheat flour. bioRxiv. , 1-25 (2017).
- de la Fuente, V., Rufo, L., Rodríguez, N., Franco, A., Amils, R. Comparison of iron localization in wild plants and hydroponic cultures of Imperata cylindrica (L.) P. Beauv. Plant Soil. 418 (1-2), 25-35 (2017).
- Hsiao, P. Y., Cheng, C. P., Koh, K. W., Chan, M. T. The Arabidopsis defensin gene, AtPDF1.1, mediates defence against Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum via an iron-withholding defence system. Science Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Johnson, D. B., Kanao, T., Hedrich, S. Redox transformations of iron at extremely low pH: Fundamental and applied aspects. Frontiers in Microbiology. 3, 1-13 (2012).
- Stumm, W., Lee, G. F. Oxygenation of ferrous iron. Industrial & Engineering Chemistry. 53 (2), 143-146 (1961).
- Jones, A. M., Griffin, P. J., Collins, R. N., Waite, T. D. Ferrous iron oxidation under acidic conditions - The effect of ferric oxide surfaces. Geochimica et Cosmochimica Acta. 145, 1-12 (2014).
- Hawkesworth, C. J., Kemp, A. I. S. Evolution of the continental crust. Nature. 443 (7113), (2006).
- Thompson, L. M. Soils and soil fertility. Louis, M., Troeh, F. R., Thompson, L. M. , (1973).
- Krueger, B. J., Grassian, V. H., Cowin, J. P., Laskin, A. Heterogeneous chemistry of individual mineral dust particles from different dust source regions: The importance of particle mineralogy. Atmospheric Environment. 38 (36), 6253-6261 (2004).
- Bewick, V., Cheek, L., Ball, J. Statistics review 7: Correlation and regression. Journal of Critical Care. 7 (6), 451-459 (2003).
- Asuero, A. G., Sayago, A., González, A. G. The correlation coefficient: An overview. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 36 (1), 41-59 (2006).
- JoVE Science Education Database. Analytical Chemistry. Calibration Curves. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves (2018).
