Summary
Vi presenterar en enkel och pålitlig protokoll för att mäta järnhalten i växt vävnader med metoden kolorimetriska berlinerblått.
Abstract
Järn, en av de viktigaste mikronäringsämnen i levande organismer, är involverad i grundläggande processer, såsom andning och fotosyntesen. Järnhalten är ganska låg i alla organismer, uppgående i växter till cirka 0,009% av torrvikt. Hittills är en av de mest exakta metoderna för att mäta järnkoncentrationen i växt vävnader lågan absorption atomspektroskopi. Men denna metod är tidskrävande och dyra och kräver särskild utrustning inte vanligt förekommande i växten laboratorier. Därför behövs en enklare, men korrekt metod som kan användas rutinmässigt. Metoden kolorimetriska berlinerblått används regelbundet för kvalitativa järn färgning i djur- och växtarter histologiska sektioner. I denna studie anpassade vi den Prussian Blue metod för kvantitativa mätningar av järn i tobak lämnar. Vi validerat riktigheten av denna metod som använder både atomspektroskopi och berlinerblått färgning för att mäta järnhalten i samma prover och hittade en linjär regression (R2 = 0.988) mellan de två förfarandena. Vi dra slutsatsen att metoden berlinerblått för kvantitativa järn mätning i växt vävnader är exakt, enkel och billig. Den linjära regressionen som presenteras här kan dock inte lämpliga för andra växtarter, på grund av eventuella interaktioner mellan provet och reagens. Inrättandet av en regressionskurvan behövs således för olika växtarter.
Introduction
Järn (Fe) är en viktig mikronäringsämnen i alla levande organismer. I växter är det en viktig mikronäringsämnen1 på grund av dess deltagande i grundläggande processer, såsom andning, fotosyntes och klorofyll biosyntes. Hög ansamling av fritt järn joner är skadligt att plantera celler på grund av reaktioner som leder till utsläpp av fria radikaler som orsakar oxidativ stress. För att upprätthålla järn homeostas inom cellen växt, joner lagras i vakuoler och binds inom ferritins, protein burar direkt involverade i järn homeostas2 och den huvudsakliga lagringsstrukturen för järn i alla levande organismer. Samtidigt påverkar järnbristanemi en betydande andel av befolkningen, vilket resulterar i ett ökande behov av anläggningen Fe biofortification. Tack vare de unika egenskaperna hos växten ferritin erbjuder mat berikning med ferritin-järn en lovande strategi för att bekämpa problemet med undernäring3.
Järnjonerna är främst i två oxidationstal, nämligen den järnhaltiga (tvåvärda Fe2 + eller järn (II)) och järnklorid (trivalent Fe3 + eller järn (III)) former. Flera andra former av järn, såsom järn kluster4, finns också i celler. FE lagras som järnoxid inom cellen och naturligt bildar hematites (Fe2O3) och ferryhidrites ((Fe3 +)2O3•0.5 H2O) under fysiologiska villkor5. De hydroxider bildades dessa reaktioner, särskilt den ferric formen, har mycket låg löslighet. Järn lagring är följaktligen påverkas av pH-värdet i lösningen och till stor del är en solid state över pH 56.
Med tanke på den dålig löslighet och höga reaktivitet FE, måste dess överföring bland växt vävnader och organ vara associerad med lämplig kelaterande molekyler. Dessutom måste dess redox staterna mellan järn och järn (III) formulär1 kontrolleras. Inom blad, ca 80% av järn finns i fotosyntetiska celler, på grund av dess viktiga roller i elektronen transportsystemet, i biosyntesen av subfamiljen, klorofyll och andra heme molekyler, och i bildandet av Fe-S kluster7. När det gäller järn överskott inom cellen, är överskottet flyttad till den vakuol där metallen lagras i ferritin molekyler8.
Järn kan mätas i växt vävnader genom flera metoder, inklusive flame atomic absorption spektroskopi9 (Fahlström) eller kolorimetriska analyser10, den förra är långt mer exakta än de senare. FAAS är en mycket noggrann teknik som gör det möjligt att bestämma elementärt sammansättningen av ett prov på grundval av elektromagnetiska utsläpp av de enskilda elementen. FAAS konverterar metalljoner till atomic stater genom lågan-uppvärmning av provet, leder till ion excitation och utsläppen av en viss våglängd när en viss Jon återgår till dess grundtillståndet. Utsläppen från de olika jonerna separeras genom en monokromator och upptäcks av en absorption sensor11. FAAS serverar således att direkt beräkna halter järn. Andra tekniker för att visualisera järn i biologiska vävnader finns dock tillgängliga. Induktivt kopplad plasma-massa spektroskopi (ICP-MS)12 är en mycket exakt teknik för mätning av järn och andra spårämnen men bristen på utrustning, både Falk och ICP-MS, är ett vanligt problem. Däremot, järn mätning av kaliumtiocyanat kolorimetri13 saknar precision och misslyckas att upptäcka små variationer mellan prover. Prussian blue färgning14,15,16,17 är en indirekt metod baserad på reaktionen av järnklorid kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6) med Fe katjoner, producerar en stark blå färg, och används för kvalitativa järn upptäckt i histologiska delar av djur- och växtarter vävnader.
Metalliska (noll-valent) järn är sällsynta i litosfären. Dominerande icke-komplex jonisk form av järn i miljön styrs främst av mängden syre i omgivningen, med järn järn vara relativt rikligare i syrefria miljöer och järnklorid järn dominerar i aerob platser. Denna senare form är också dominerande i extremt sura miljöer, även om vilka smittämnen av järn järn oxidation skiljer sig ofta i anoxiska och sura omgivning18. När järn är solubilized i 4% HCl (pH 0) i aerob miljö, större delen av den utspädda järnet finns som den ferric bildar (Fe3 +)19,20.
Reaktionerna mellan Fe joner och K4Fe(CN)6 är följande:
FE3 +: FeCl3 + K4Fe(CN)6 = KFe(III)Fe(II)(CN)6¯ + 3KCl
FE2 +: 4 FeCl2 + 2 K4Fe(CN)6 = Fe4(Fe(CN)6)2 + 8 KCl
I den aktuella studien frågade vi om Prussian blue färgning kan vara användbar för att mäta järnnivåer i lösning.
Inledningsvis verifierat vi sambandet mellan koncentrationen av Fe i vattenlösning och Prussian blue färgning. Fe (som FeCl2, FeCl3 eller en 1:1 blandning av två) koncentrationen i vattenlösningar mättes såväl av atomspektroskopi absorbans (OD) efter tillsats av berlinerblått. Figur 1 visar linjär regression kurvorna för mätningar som erhålls med varje metod. Vi slutsatsen att den Prussian blue metoden kan användas för kvantitativ analys av järnkoncentrationen i lösning.
Figur 1: Linjära regressioner mellan Fe koncentration mäts av FÄRM och ljusabsorbans (OD, 715 nm) erhålls genom metoden Prussian blue. De blå fyrkanter och linje representerar Fe2 + lösningen, de röda fyrkanter och linjen representerar den Fe3 + lösningen och de svarta rutorna och linje representerar en 1:1 blandning mellan Fe2 + och Fe3 +. De följande regressioner erhölls: [Fe2 +] = 3 + 123 x OD, r = 0.996, R2 = 0.989; [Fe3 +] = 1 + 292 x OD, r = 0,999, R2 = 0.997; och [Fe2 +/ 3 +] = 11 + 146 x OD, r = 0.983, R2 = 0.956. Fe2 + givaren var FeCl2 och Fe3 + givaren var FeCl3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att anpassa den kolorimetriska Prussian blue metoden för kvantitativ järn analys av växt vävnader, mättes halten av järn av tobak leaf aska av lågan absorption atomspektroskopi och Prussian blue färgning. Det fanns bra samband mellan resultaten av de två teknikerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. växtskyddsmedel Material och tillväxtförutsättningar
- Utsäde en tobak (cultivar Samsun) utsäde per 5 x 5 cm kruka fylld med vanlig kruka mellan. Placera krukorna på brickor. Odla växterna i ett tillväxt rum villkor lång dag (16/8 h ljus/mörk) vid en konstant temperatur av 23 ° C. Vattna med kranvatten tills vatten avlopp från potten.
- Efter 50±5 dagar, börja Fe behandlingar i bevattning, enligt koncentrationerna som är lämpliga för experimentet. Till exempel använde vi en rad järnkoncentrationen från 0 till 6 mM, kompletterad med ett lösligt Fe kelator (Fe EDDHA). Vattna växterna med lämplig lösning varje två dagar (för att undvika dehydrering) för 6-8 dagar.
2. förbereda bladen för järn mätning
Anteckningar: Allt material som används måste vara järnfri för att minska risken för järn förorening. Rengöra mortel två gånger med 4% HCl-lösning och torkas med filterpapper varje gång före användning. Om något material återanvänds, rengör två gånger med 4% HCl-lösning och torkas med filterpapper.
- Lossa bladen från stjälken för hand, använda handskar (inte Använd någon metall utrustning). Använd ca 10 g av blad (färsk vikt) för varje prov. Ren varje blad med dubbel destillerat vatten (DDW) med hjälp av en sprayflaska. Detta är viktigt att undvika Fe kontaminering.
- Torka bladen på en pappershandduk och Lägg dem i en papperspåse. Överföra papperspåsar till en ugn vid en konstant temperatur på 80 ° C i 2-3 dagar.
- När torr, krossa bladen till pulver med en mortel och mortelstöt och överföring till steril 15 mL plaströr.
3. bränna bladen till aska
Anteckningar: Användning av ett lågt pH (nära 0) lösning av HCl är tänkt att öka lösligheten av järn. Stenull används som hindrar att gaserna flyr injektionsflaskan under bränning.
- Väg en ny, förseglade 20 mL injektionsflaska av scintillation utan lock. Anteckna värdet eller värdet till noll med tareringsknappen. Tillsätt de krossade torkade bladen (prov) till injektionsflaskan.
- Väg provet och behållaren och anteckna värdet. Stäng flaskan med stenull.
- Väga 3 ytterligare injektionsflaskor utan att lägga till prover och observera deras värden. Dessa flaskor ska användas som kontroller för att utvärdera mängden stenull som kunde ha lett till någon ökning av provets vikt.
- Placera provet och kontroll injektionsflaskorna i en ugn och starta bränning med följande temperatur: rumstemperatur, snabb ökning till 425 ° C, och, slutligen, 425° C i 4 timmar. Vid denna tid, kommer de torra löv har vänt till aska.
- Låt prov svalna ner till ca 100 ° C men inte under denna temperatur för följande två steg för att undvika fukt, vilket kan påverka den slutliga vikten av provet. Med hjälp av tung handskar bort proverna från ugnen med pincett, håller injektionsflaskan utvärtes.
- Placera injektionsflaskan på en plan yta, ta rock ull och Stäng injektionsflaskorna med sina ursprungliga lock.
- Väga 3 kontroll injektionsflaskorna (se 3.3) och beräkna deras genomsnittliga viktökning. Om viktökning är lika eller högre till 1% av aska vikt (se steg 4,2), använda detta värde som en uppskattning av Mätfelet.
4. förbereda askan för järn mätning
Anteckningar: Den slutliga järnkoncentrationen i första provet beräknas som vikten av askan dividerat med den extra mängden HCl.
- Förbereda en 1 M HCl-lösning (4% HCl) genom att lägga till 12,5 mL stamlösning 37% HCl till 87,5 mL DDW (i en plast eller glas kolv).
- Väger en 15 mL plaströr och anteckna värdet eller värdet till noll med tareringsknappen. Överföra askan till röret, väga, och anteckna värdet. Detta är aska vikt.
- Tillsätt 5 mL av 1 M HCl till askan. Filtrera askan genom 22 µm filter och Lägg till ytterligare 5 mL 1 M HCl genom samma filter.
- Den slutliga volymen bör vara 10 mL. Observera att en del av lösningen kommer att försvinna i filtret.
Obs: Proverna är nu redo för Fe mätning FAAS eller via metoden berlinerblått. - Gör en kalibreringskurva med Fe koncentration mäts av Atom spektrometri och av den Prussian blue metoden (se figur 4) för varje växtarter. Därefter kan Fe mätas av metoden Prussian blue ensam.
5. mäta Fe koncentration av Falk
- Ta bort 4 mL från varje prov för mätning av FÄRM.
- Dela resultat från FAAS mätning av väga av askan. Dela det resulterande värdet av 0,01 (eftersom askan var solubilized i 10 mL). Det resulterande värdet är järn koncentration per gram aska (ppm).
6. Förbered den Prussian blå färgning lösning
- Förbereda en 4% Prussian blue lösning genom att tillsätta 4 g K4Fe(CN)6 till 100 mL DDW och vortex (andra volymer eller koncentrationer kan användas för olika krav). Det bör noteras att i denna studie en mindre koncentrerad Prussian blue lösning än tidigare rapporterade (20%)14 användes.
- Förvara lösningen i mörker vid 4 ° C fram till användning. Lösningen är stabil i 6 månader om den förvaras vid sådana förhållanden.
7. generera en kalibreringskurva för metoden berlinerblått använder FAAS resultat
Obs: Beräkna järnkoncentrationen av i askan med hjälp av följande formel
Ekvation 1
C: koncentration, V: provvolymen, W: aska vikt (g).
- Blanda 0.50 mL Prussian blue lösning och 0.50 mL 1 M HCl. Detta kommer att fungera som blindlösningen.
- Blanda 0,5 mL av provet (aska i 4% HCl, som beskrivs i avsnitt 3) och 0,5 mL Prussian blue lösning (steg 6.1) av pipettering. Vänta i minst 1 minut men inte mer än 5 minuter. Efter 5 minuter, kommer att sedimentering i proven inträffa.
- Överför blandningen till en kyvetten och mäta OD på 715 nm med en spektrofotometer. Anteckna värdet.
- Dela det OD-värdet (steg 7,3) av provet aska tyngd (steg 3,2). Resultatet representerar OD per gram aska.
- Rita den linjära regressionen mellan de halter av järn erhållits från FAAS mätningarna (Y-axeln) och OD-värdena (X-axeln). Använda resultaten i steg 5.2 och 7,4. Beräkna regressionsformeln, Y = en + bX, där Y representerar järn koncentration, en representerar absorbansen skär, b representerar absorbansen lutningen och X representerar OD.
8. använda berlinerblått metoden för att fastställa järnnivåerna i andra prover från samma växttyp
Anteckningar: Eftersom en kalibreringskurva har redan fastställts för denna typ av anläggning, järnkoncentrationen i alla nya prover från samma växttyp kan direkt beräknas med hjälp av linjär regression formel.
- Utför stegen i avsnitten 3 och 4, följt av steg 7.1-7.4.
- Beräkna järnkoncentrationen av i lösningen med hjälp av formeln som erhållits från den linjära regressionen (steg 7,5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När detta protokoll genomförs korrekt, bör man få utmärkta korrelationen mellan resultaten av de Prussian blue och atomic spektroskopi metoderna. Därför kan metoden Prussian blue enkelt användas för att erhålla en exakt mätning av järnkoncentrationen i växtprover, som återspeglas i det följande experimentet.
Tobaksplantor var odlas som beskrivs i protokollet och bevattnas med vatten som innehåller olika järnkoncentrationen (0, 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 mM) under 7 dagar. Växterna var sedan skördas, rengjorda och torkade i 3 dagar vid 80 ° C. Nästa steg (dvs. från steg 2.3) i protokollet följdes som beskrivs. Eftersom kontroll injektionsflaskorna visade en variation på mindre än 1% från ash vikt, lades inte detta värde till ytterligare beräkningar.
Järnkoncentrationen mättes av FÄRM. Tabell 1 visar representativa resultaten av dessa mätningar. Data som erhållits från 21 prover (7 koncentrationer i 3 replikerar) användes för att generera en kalibreringskurva.
| Behandling (mM järn i bevattning) | Anläggningen | Järnkoncentrationen i HCl-lösning (ppm) |
| 0 | A | 7.1 |
| 1 | B | 16,6 |
| 2 | C | 23,4 |
| 3 | D | 31,2 |
| 4 | F | 47,4 |
| 5 | G | 50,7 |
| 6 | H | 41,6 |
Tabell 1: Järnkoncentrationen i aska lösningar av tobak bladen från växter som bevattnas med vatten som innehåller olika järnnivåer.
Järnkoncentrationen i askan av de ovan nämnda 21 proverna beräknades med hjälp av värden som erhålls av Falk (se not i steg 7). Resultaten visade att järnkoncentrationen i bevattningsvatten kraftigt påverkat leaf järnhalt (figur 2).
Figur 2: effekt av järn i bevattning på järnkoncentrationen i tobak lämnar. Staplarna representerar standardavvikelser (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I ett förberedande experiment (visas inte), absorbans spektra av lösningar som innehåller olika koncentrationer av Fe2 + och Fe3 + mättes och de bästa toppen erhölls på 715 nm. Alla spektra av de 21 proverna testades också med metoden Prussian blue. Det var tydligt att absorbansen vid 715 nm var också optimal våglängd här liksom (figur 3). Följaktligen användes denna våglängd i alla experiment.
En linjära regressionskurvan var ritas mellan järn koncentrationsvärden erhålls genom Falk och de absorptionsvärden (OD) som erhållits med Prussian blue metod för proverna representerade i figur 3 (figur 4). Följande regressionen erhölls: [Fe] = 0,32 + 25,3 x OD, r = 0.994 och R2= 0.988.
Figur 3: absorbansen våglängd spektra av tobak aska blandas med Prussian blue lösning som beskrivs i protokollet. Våglängd spektra delades av koncentrationen av aska. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Linjära regressioner Fe koncentration i tobak aska mäts av FÄRM och ljusabsorbans (OD, 715 nm) erhålls genom metoden berlinerblått. Följande regressionen erhölls: [Fe] = 0,32 + 25,3 x OD, r = 0.994, R2= 0.988. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den erhållna linjär regressionen kan nu användas för nya prover från samma växttyp, som anges i steg 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Järn mätning i växt vävnader är mycket viktigt för att utvärdera effekterna av bevattning eller andra miljöförhållanden. Vi beskrivit här, en enkel och noggrann kolorimetrisk metod för Fe innehåll mätning i tobaksblad, som lätt kan anpassas till andra växtarter och vävnader.
Optimera förutsättningarna för den kolorimetriska metoden, använde vi ett lågt pH medium (pH < 1,0) för att tillåta järn löslighet. Bränningen utfördes att frige alla former av järn och att säkerställa att inga föroreningar som förekommer i proverna skulle ändra resultaten. När det gäller järn föroreningar, man bör ha i åtanke att 6,7% av jordskorpan består av järnoxid arter (FeOn)21 och att deras koncentrationer kan nå 0,009% av växt torr vikt22. Man därför, bör överväga risken för kontaminering, sedan damm, som kan innehålla så mycket som 3-7% järn (beroende på region)23, kan kraftigt påverka resultaten. Det är också absolut nödvändigt att noggrant kontrollera halten av järn av all utrustning som används i experimentet och vidta alla nödvändiga försiktighetsåtgärder för att undvika kontaminering. Det rekommenderas att rengöra all utrustning som hade varit i kontakt med luft eller som återanvänds i experimentet med 4% HCl-lösning. Användning av eventuella metalliska verktyg, såsom sax eller skedar, bör undvikas helt, istället ersätts av glas eller plast versioner. Kritiska steg för att undvika järn föroreningar belystes i steg 3.1 och 4.1, t.ex.
Misslyckas med att få en signal från ett prov kan uppstå på grund av problem som uppstår vid olika steg i protokollet. I detta fall är det rekommenderat att kontrollera reagenser mot lösningar med kända järn koncentration. Om problem kvarstår, bör färska Prussian blue reagens förberedas. Bör standarden, men visar en signal, detta indikerar att järnkoncentrationen i provet understeg den påvisbara gränsen och att provet bör vara mer koncentrerad. Stora variationer bland replikat kunde härröra från järn föroreningar och kräver användning av nya prover.
Kalibreringskurvorna behöver genereras varje halvår eller varje gång en ny batch Prussian blue reagens används. Inledande kalibreringskurvan skall omverifieras genom att mäta järnhalten i minst 6 prover och bekräftar att den linjära regressionen är fortfarande korrekt. I kalibreringskurvorna är det viktigt att erhålla värden nära + 1 eller -1 för r (korrelationskoefficienten) samt 1 för R2 (determinationskoefficienten)24,25,26. Samtidigt en perfekt linje skulle ha en R2 värdet 1, är de flesta R2 värden över 0,95 godtagbara för kalibreringskurvor.
Begränsningar i protokollet är det faktum att olika växt vävnader och arter kan visa olika korrelation kurvor med hjälp av beskrivs förfaranden för bestämning av järn koncentration. Därför rekommenderas det att utföra ett pilotprojekt för att säkerställa att korrelation kurvan är korrekt för en given experiment. Använd kurvan för erhållna resultaten genom det nyligen uppmätt OD-värden bör ersättas i formeln Y = en + bX. I förevarande fall användes följande formel: [Fe] = 0,32 + 25,3 x OD.
En annan begränsning uppkommer behov av en ganska stor mängd växtvävnad. Detta kan kringgås i viss utsträckning genom att anpassa HCl volymen används för att lösa upp askan (se steg 5.3) för att erhålla en lämplig signal. Den metod som beskrivs här är dock ett bra alternativ om dyr utrustning, som används för ICP-MS, eller tillgång till FAAS finns inte och/eller många prover av den samma växtart kommer att analyseras.
Möjliga ytterligare tillämpningar av den Prussian blue metoden som ett system för identifiering av järn omfatta kvantitativa järn identifiering i organiskt material som kan föras till aska samt oorganisk materia, såsom jordmån.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd av Israel ministeriet för vetenskap, teknik och Spaceand av ett bidrag från chefen för forskningsenheten vid israeliska ministeriet för jordbruk (#16-16-0003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Hexacyanoferrate(II) | Fisher Chemical | 14459-95-1 | Reagent for the Pussian Blue |
| Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 μm | Millec | SLGP033RS | Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution |
| Scintillation Vials | Fisherbrand | 03-337-4 | Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure. |
| Disposable Syringe 10 ml | Medi-Plus | 1931 | Syringe used during the filtration |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 231-595-7 | Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials |
| Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN | Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab | Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407. | Tobacco cultivar used in this protocol |
| Glass Wool (Rock Wool) | Sigma-Aldrich | 659997-17-3 | Used in the procedure of burning samples in the furnace. |
References
- Kobayashi, T., Nishizawa, N. K. Iron uptake, translocation, and regulation in higher plants. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 131-152 (2012).
- Bradley, J. M., Le Brun, N. E., Moore, G. R. Ferritins: Furnishing proteins with iron. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 21 (1), 13-28 (2012).
- Zielińska-Dawidziak, M. Plant ferritin - a source of iron to prevent its deficiency. Nutrients. 7 (2), 1184-1201 (2015).
- Johnson, D. C., Dean, D. R., Smith, A. D., Johnson, M. K. Structure, function, and formation of biological iron-sulfur clusters. Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 247-281 (2015).
- Guo, H., Barnard, A. S. Naturally occurring iron oxide nanoparticles: morphology, surface chemistry and environmental stability. Journal of Materials Chemistry A. 1 (1), 27-42 (2013).
- Hem, J. D., Cropper, W. H. Chemistry of iron in natural water. Report US Geological Survey. , 1-31 (1962).
- Rout, G. R., Sahoo, S. Role of iron in plant growth and metabolism. Reviews in Agricultural Science. 3, 1-24 (2015).
- Speretto, R. A., Ricachenevsky, F. K., Stein, R. J., de Abreu Waldow, V., Fett, J. P. Iron stress in plants Dealing with deprivation and overload. Plant Stress. 4, 57-69 (2010).
- Tautkus, S., Steponeniene, L., Kazlauskas, R. Determination of iron in natural and mineral waters by flame atomic absorption spectrometry. Journal of the Serbian Chemical Society. 69 (5), 393-402 (2006).
- Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. Journal of Microbiological Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
- PerkinElmer. Atomic Spectroscopy - Guide to Selecting the Appropriate Technique and System. 16, (2011).
- Wachasunder, S. D., Nafade, A. Precision and accuracy control in the determination of heavy metals by atomic absorption spectrometry. Science. 58, 517-528 (2001).
- Woods, J. T., Mellon, M. G. Thiocyanate method for iron. A spectrophotometric study. Industrial & Engineering Chemistry Analytical Edition. 13 (8), 551-554 (1941).
- Perls, M. Nachweis von Eisenoxyd in gewissen Pigmenten. Virchows Archiv Fur Pathologische Anatomie Und Physiologie Und Fur Klinische Medizin. 39 (1), 42-48 (1867).
- Connorton, J. M., Jones, E. R., Rodriguez-Ramiro, I., Fairweather-Tait, S., Uauy, C., Balk, J. Altering expression of a vacuolar iron transporter doubles iron content in white wheat flour. bioRxiv. , 1-25 (2017).
- de la Fuente, V., Rufo, L., Rodríguez, N., Franco, A., Amils, R. Comparison of iron localization in wild plants and hydroponic cultures of Imperata cylindrica (L.) P. Beauv. Plant Soil. 418 (1-2), 25-35 (2017).
- Hsiao, P. Y., Cheng, C. P., Koh, K. W., Chan, M. T. The Arabidopsis defensin gene, AtPDF1.1, mediates defence against Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum via an iron-withholding defence system. Science Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Johnson, D. B., Kanao, T., Hedrich, S. Redox transformations of iron at extremely low pH: Fundamental and applied aspects. Frontiers in Microbiology. 3, 1-13 (2012).
- Stumm, W., Lee, G. F. Oxygenation of ferrous iron. Industrial & Engineering Chemistry. 53 (2), 143-146 (1961).
- Jones, A. M., Griffin, P. J., Collins, R. N., Waite, T. D. Ferrous iron oxidation under acidic conditions - The effect of ferric oxide surfaces. Geochimica et Cosmochimica Acta. 145, 1-12 (2014).
- Hawkesworth, C. J., Kemp, A. I. S. Evolution of the continental crust. Nature. 443 (7113), (2006).
- Thompson, L. M. Soils and soil fertility. Louis, M., Troeh, F. R., Thompson, L. M. , (1973).
- Krueger, B. J., Grassian, V. H., Cowin, J. P., Laskin, A. Heterogeneous chemistry of individual mineral dust particles from different dust source regions: The importance of particle mineralogy. Atmospheric Environment. 38 (36), 6253-6261 (2004).
- Bewick, V., Cheek, L., Ball, J. Statistics review 7: Correlation and regression. Journal of Critical Care. 7 (6), 451-459 (2003).
- Asuero, A. G., Sayago, A., González, A. G. The correlation coefficient: An overview. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 36 (1), 41-59 (2006).
- JoVE Science Education Database. Analytical Chemistry. Calibration Curves. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves (2018).
