Summary
Vi præsenterer en enkel og pålidelige protokol til måling af jernindhold i plantevæv ved hjælp af metoden kolorimetriske preussiske Blue.
Abstract
Jern, en af de vigtigste mikronæringsstoffer i levende organismer, er involveret i grundlæggende processer, såsom respiration og fotosyntese. Jernindholdet er temmelig lav i alle organismer, beløber sig i planter til omkring 0,009% af tørvægt. Til dato, er en af de mest præcise metoder til måling af koncentrationen af jern i plantevæv flamme absorption atomic spektroskopi. Men denne fremgangsmåde er tidskrævende og dyrt og kræver specifikke udstyr ikke almindeligt forekommende i anlægget laboratorier. Derfor er der behov for en enklere, men nøjagtige metode, som kan anvendes rutinemæssigt. Metoden kolorimetriske preussiske Blue bruges regelmæssigt til kvalitative jern farvning i dyre- og plantearter histologiske sektioner. I denne undersøgelse tilpasset vi den preussiske blå metode for kvantitative målinger af jern i tobak blade. Vi valideret rigtigheden af denne metode, ved hjælp af både atomare spektroskopi og preussiske Blue farvning for at måle jernindhold i de samme prøver og fundet en lineær regression (R2 = 0,988) mellem de to procedurer. Vi konkludere, at den preussiske Blue metode til kvantitativ jern måling i plantevæv er præcise, enkel og billig. Den lineære regression præsenteres her kan imidlertid ikke være hensigtsmæssigt for andre plantearter på grund af potentielle vekselvirkninger mellem prøven og reagenset. Etablering af en regression kurve er således nødvendig for forskellige plantearter.
Introduction
Jern (Fe) er et vigtigt mikronæringsstof i alle levende organismer. I planter er det et essentielt mikronæringsstof1 på grund af sit engagement i grundlæggende processer, såsom respiration, fotosyntese og klorofyl biosyntesen. Høj ophobning af frit jern ioner er skadeligt at plante celler på grund af reaktioner fører til frigivelse af frie radikaler forårsager oxidativ stress. For at fastholde jern homøostase inden for plante celle, ioner gemmes i vacuoles og afsondret inden for ferritins, protein bure direkte involveret i jern homøostase2 og de vigtigste lagerstrukturen af jern i alle levende organismer. På samme tid påvirker jernmangelanæmi en væsentlig del af den menneskelige befolkning, hvilket resulterer i et stigende behov for anlæg Fe biofortification. På grund af de unikke egenskaber af anlægget ferritin tilbyder mad berigelse med ferritin-jern en lovende strategi for at bekæmpe problemet med fejlernæring3.
Jern ioner er hovedsageligt fundet i to oxidation stater, nemlig den jernholdige (divalent Fe2 + eller jern (II)) og jern (trivalent Fe3 + eller jern (III)) former. Flere andre former for jern, såsom jern klynger4, findes også i celler. Fe er gemt som jernoxid i celle og naturligvis former hematites (Fe2O3) og ferryhidrites ((Fe3 +)2O3•0.5 H2O) under fysiologiske forhold5. Hydroxider dannet i disse reaktioner, især jern form, har meget lav opløselighed. Opbevaring af jern påvirkes derfor af pH af løsningen og er i vid udstrækning i en solid state over pH 56.
I betragtning af de fattige opløselighed og høj reaktivitet af Fe, skal overførsel blandt plantevæv og organer være forbundet med egnet chelaterende molekyler. Desuden skal sin redox stater mellem jern og jern skemaer1 kontrolleres. Inden for blade, omkring 80% af jern findes i fotosyntetiserende celler, på grund af dens afgørende roller i elektronen transportsystem, i biosyntesen af cytokromer, der, klorofyl og andre hæm molekyler, og i dannelsen af Fe-S klynger7. For jern overskud i cellen, er overskuddet omplantes til vacuole hvor metallet er gemt i ferritin molekyler8.
Jern kan måles i plantevæv ved flere metoder, herunder flamme atomic absorption spektroskopi9 (Frederiksen) eller kolorimetriske assays10, førstnævnte er langt mere præcis end sidstnævnte. Frederiksen er en meget præcis teknik, der gør det muligt at bestemme den elementære sammensætning af en stikprøve på grundlag af elektromagnetisk emission af de enkelte elementer. Frederiksen konverterer metalioner til atomic stater ved flamme-opvarmning af stikprøven, fører til ion excitations- og af en bestemt bølgelængde, når en given ion vender tilbage til sin grundtilstand. Emissioner fra de forskellige ioner er adskilt af en monochromator og opdaget af en absorption sensor11. Frederiksen dermed tjener til at sætte direkte tal jern koncentrationer. Andre teknikker til at visualisere jern i biologisk væv er dog tilgængelige. Induktivt koblet plasma-masse spektroskopi (ICP-MS)12 er en meget præcis teknik til måling af jern og andre sporstoffer, men manglen på udstyr, både for Frederiksen og ICP-MS, er et fælles problem. På den anden side jern måling af kaliumthiocyanat kolorimetri13 mangler præcision og ikke at afsløre små variationer mellem prøver. Preussiske blå farvning14,15,16,17 er en indirekte metode baseret på reaktion af jern kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6) med Fe kationer, producerer en stærke blå farve, og bruges til registrering af kvalitative jern i histologiske sektioner af dyre- og plantearter væv.
Metalliske (nul-Valente) jern er sjældne i lithosfæren. Dominerende ikke-kompleksbundet ionisk form af jern i miljøet er hovedsagelig dikteret af mængden af ilt i omgivelserne, med jern jern er relativt mere rigelige i iltfattige miljøer og jern jern overvejende i aerob websteder. Denne sidstnævnte form er også dominerende i meget sure miljøer, selvom de agenser af jernholdige jern oxidation ofte afviger i iltfattige og sure omgivelser18. Når jern er oploeses i 4% HCl (pH 0) i en aerob miljø, den største del af den fortyndede jern findes som den jern danner (Fe3 +)19,20.
Reaktioner mellem Fe ioner og K4Fe(CN)6 er som følger:
Fe3 +: FeCl3 + K4Fe(CN)6 = KFe(III)Fe(II)(CN)6¯ + 3KCl
Fe2 +: 4 FeCl2 + 2 K4Fe(CN)6 = Fe4(Fe(CN)6)2 + 8 KCl
I den foreliggende undersøgelse spurgte vi om preussiske blå farvning kan være nyttige til måling af jern niveauer i løsning.
I første omgang har vi bekræftet sammenhængen mellem koncentrationen af Fe i vandig opløsning og preussiske blue farvning. Fe (som FeCl2, FeCl3 eller en 1:1 blanding af to) koncentration i vandige opløsninger blev målt både atomare spektroskopi og absorbans (OD) efter tilsætning af preussiske blue. Figur 1 viser de lineære regression kurver til målinger ved hver metode. Vi konkluderede, at den preussiske blue metode kan anvendes til kvantitativ analyse af jern koncentration i opløsning.
Figur 1: lineær regressionsanalyse mellem Fe koncentration målt ved Frederiksen og lys absorbans (OD, 715 nm) fremstillet ved den preussiske blue metode. De blå firkanter og linje repræsenterer Fe2 + løsningen, røde firkanter og linje repræsenterer Fe3 + løsning og de sorte firkanter og linje repræsenterer en 1:1 blanding mellem Fe2 + og Fe3 +. De følgende regressioner blev indhentet: [Fe2 +] = 3 + 123 x OD, r = 0.996, R2 = 0.989; [Fe3 +] = 1 + 292 x OD, r = 0.999, R2 = 0.997; og [Fe2 / 3 +] = 11 + 146 x OD, r = 0.983, R2 = 0.956. Fe2 + donor var FeCl2 og Fe3 + donor FeCl3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
For at tilpasse de kolorimetriske preussiske blue metode til kvantitativ jern analyse af plantevæv, blev jernindhold af tobak blad aske målt af flamme absorption atomic spektroskopi og preussiske blue farvning. Der var god korrelation mellem resultaterne fra de to teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plante materiale og vækstbetingelser
- Frø en tobak (kultivar Samsun) frø pr. 5 cm x 5 cm gryde fyldt med standard pot medium. Placer potterne på bakker. Dyrke planter i en vækst værelse på lang dag betingelser (16/8 h lys/mørk) ved en konstant temperatur på 23 ° C. Vande med postevand indtil vand afløb fra puljen.
- Efter 50±5 dage, skal du starte Fe behandlinger i vanding, ifølge de fusioner, eksperimentet. For eksempel, anvendte vi en række jern koncentrationer fra 0 til 6 mM, suppleret med en opløselig Fe chelator (Fe EDDHA). Vande planterne med den hensigtsmæssige løsning hver to dage (for at undgå dehydrering) i 6-8 dage.
2. forberedelse bladene af jern måling
Noter: Skal alle materialer skal anvendes jern-fri for at mindske risikoen for jern forurening. Ren morter og støder to gange med 4% HCl løsning og tør med filtrerpapir hver gang før brug. Hvis materiale er genbrugt, Rengør det to gange med 4% HCl løsning og tør med filtrerpapir.
- Fjern blade fra stænglen i hånden, brug af handsker (ikke brug nogen metal udstyr). Brug ca. 10 g blade (frisk vægt) for hver prøve. Clean hvert blad med dobbelt destilleret vand (DDW) ved hjælp af en sprayflaske. Dette trin er vigtigt at undgå Fe forurening.
- Tørre blade på et stykke køkkenrulle og læg dem i en papirspose. Transfer papirposer til en ovn ved en konstant temperatur på 80 ° C i 2-3 dage.
- Når tør, knuse bladene til pulver ved hjælp af en morter og pistil og overførsel til sterile 15 mL plastik rør.
3. brænde blade til aske
Noter: Brugen af en lav pH (tæt på 0) opløsning af HCl er beregnet til at øge jern opløselighed. Rock uld bruges til at forhindre, at gasserne flygter hætteglasset under brændingen.
- Veje en ny, forseglet 20 mL scintillation hætteglas uden låg. Bemærk værdien eller indstille værdien til nul ved hjælp af knappen Tara. Tilføj knust tørrede blade (eksempel) til hætteglasset.
- Vejer prøve- og container og læg mærke til værdien. Luk hætteglas med stenuld.
- Vejer 3 ekstra hætteglas uden at tilføje prøver og Bemærk deres værdier. Disse hætteglas skal bruges som kontrolelementer til at vurdere størrelsen af stenuld, som kunne have ført til en stigning i stikprøven vægt.
- Anbring prøven og kontrol hætteglassene i en ovn og begynde at brænde ved hjælp af følgende temperatur trin: stuetemperatur, hurtig stigning til 425 ° C, og, endelig, 425° C i 4 timer. På dette tidspunkt vil de tørre blade har henvendt sig til aske.
- Lad prøver køle ned til omkring 100 ° C, men ikke under denne temperatur for følgende to trin for at undgå fugt, som kunne påvirke den endelige vægt af prøven. Brug kraftige handsker, fjerne prøverne fra ovnen med pincet, holde hætteglasset exteriorly.
- Placer hætteglassene på en flad overflade, ophæve at stenuld og lukke hætteglas med deres oprindelige låg.
- Vejer 3 kontrol hætteglas (jf. 3.3) og beregne deres gennemsnitlige vægtøgning. Hvis vægtøgning er lig eller over til 1% af den aske vægt (Se trin 4.2), bruger denne værdi som et skøn over målefejl.
4. forberedelse asken af jern måling
Noter: Den endelige jern koncentration i den oprindelige stikprøve beregnes som vægten af asken divideret med den ekstra volumen af HCl.
- Forberede en 1 M HCl løsning (4% HCl) ved at tilføje 12,5 mL af en 37% HCl stamopløsning 87,5 mL af DDW (i en plastik eller glas kolbe).
- Vejer en 15 mL plastik rør og Bemærk værdien eller indstille værdien til nul ved hjælp af knappen Tara. Overføre asken til røret, veje, og læg mærke til værdien. Dette er den aske vægt.
- Tilsættes 5 mL 1 M HCl til asken. Filtrer asken gennem en 22 µm filter og tilføje en ekstra 5 mL 1 M HCL igennem det samme filter.
- Den endelige rumfang skal være 10 mL. Bemærk, at en del af løsningen vil være tabt i filteret.
Bemærk: Prøverne er nu klar til Fe måling enten ved Frederiksen eller den preussiske Blue metode. - Gøre en kalibreringskurve med Fe koncentration målt ved atomic massespektrometri og metoden preussiske blue (Se fig. 4) for hver planteart. Efterfølgende, kan Fe koncentration måles ved den preussiske blue metode alene.
5. måling Fe koncentration af Frederiksen
- Fjern 4 mL fra hver stikprøve til måling af Frederiksen.
- Opdele resultaterne fra Frederiksen måling af vægten af asken. Opdele den resulterende værdi af 0,01 (fordi asken blev oploeses i 10 mL). Den resulterende værdi er jern koncentrationen pr. gram aske (ppm).
6. forberede den preussiske blå farvning løsning
- Forberede en 4% preussiske blue løsning ved at tilføje 4 g K4Fe(CN)6 til 100 mL DDW og vortex (der kan bruges andre diskenheder og/eller koncentrationer til forskellige krav). Det skal bemærkes, at i denne undersøgelse, en mindre koncentreret preussiske blue løsning end tidligere rapporteret (20%)14 blev brugt.
- Holde løsningen i mørke ved 4 ° C indtil brug. Løsningen er stabil i 6 måneder, når den opbevares på sådanne forhold.
7. skabe en kalibreringskurve for den preussiske Blue metode ved hjælp af Frederiksen resultater
Bemærk: Beregn koncentrationen af jern i asken ved hjælp af følgende formel
Ligning 1
C: koncentration, V: sample volumen, W: aske vægt (g).
- Bland 0,50 mL preussiske blue løsning og 0,50 mL 1 M HCL. Dette vil tjene som blindprøveopløsningen.
- 0,5 ml af prøven (asken i 4% HCl, som beskrevet i punkt 3) og 0,5 mL af preussiske blue (trin 6.1) af pipettering. Vent mindst 1 minut, men ikke mere end 5 minutter. Efter 5 minutter, vil bundfældning i prøverne forekomme.
- Overfør blandingen til en kuvette og måle OD på 715 nm med et spektrofotometer. Bemærk værdien.
- Opdele OD-værdi (trin 7.3) af aske vægt (trin 3.2) af prøven. Resultatet repræsenterer OD pr. gram aske.
- Afbilde den lineære regression mellem jern koncentrationer fra Frederiksen målinger (Y-akse), og OD-værdier (X-akse). Brug resultaterne i trin 5.2 og 7,4. Beregne regression formel, Y = en + bX, hvor Y repræsenterer jern koncentration, en repræsenterer absorbansen skærer, b repræsenterer absorbans skråning og X repræsenterer OD.
8. ved hjælp af den preussiske Blue metode til bestemmelse af jern niveauer i andre prøver fra de samme anlægstype
Noter: Da en kalibreringskurve er allerede blevet fastslået for denne type anlæg, jern koncentration i enhver ny prøver fra de samme anlægstype kan direkte beregnes ved hjælp af lineær regression formel.
- Udføre trinnene i afsnit 3 og 4, efterfulgt af trin 7.1 til 7.4.
- Beregne koncentrationen af jern i løsning ved hjælp af den formel, fremstillet af den lineære regression (skridt 7,5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når denne protokol er udført korrekt, bør man få fremragende korrelation mellem resultaterne opnået ved de preussiske blue og atomic spektroskopi metoder. Derfor, metoden preussiske blue kan nemt bruges til at opnå en nøjagtig måling af jern koncentration i planten prøver, som afspejlet i de følgende eksperiment.
Tobaksplanter blev dyrket som beskrevet i protokollen og vandes med vand indeholdende forskellige jern koncentrationer (0, 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 mM) i 7 dage. Planterne var derefter høstet, rengjort og tørret i 3 dage ved 80 ° C. De næste skridt (dvs. fra trin 2.3) i protokollen blev efterfulgt som beskrevet. Da kontrol hætteglas viste en variation af mindre end 1% fra ash vægt, blev denne værdi ikke føjet til yderligere beregninger.
Jern koncentrationen blev målt ved Frederiksen. Tabel 1 viser repræsentative resultater af disse målinger. Data fra 21 prøver (7 koncentrationer i 3 replikater) blev brugt til at generere en kalibreringskurve.
| Behandling (mM jern i vanding) | Plante | Jern koncentration i HCl løsning (ppm) |
| 0 | A | 7.1 |
| 1 | B | 16.6 |
| 2 | C | 23,4 |
| 3 | D | 31.2 |
| 4 | F | 47.4 |
| 5 | G | 50,7 |
| 6 | H | 41,6 |
Tabel 1: Jern koncentration i aske løsninger af tobak blade fra planter, der vandes med vand indeholdende forskellige jern niveauer.
Koncentrationen af jern i asken af de ovenfor nævnte 21 prøver blev beregnet ved hjælp af værdier opnået ved Frederiksen (se note taktfast 7). Resultaterne viste, at jern koncentration i vandingsvand stærkt påvirket blad jernindhold (figur 2).
Figur 2: effekt af jern leveres i kunstvanding på jern koncentration i tobak blade. Søjler repræsenterer standardafvigelser (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
I en foreløbig eksperiment (ikke vist), absorbans spektre af opløsninger indeholdende Fe2 + og Fe3 + i forskellige koncentrationer blev målt og den bedste peak blev opnået på 715 nm. Alle spektre af 21 prøverne blev også testet med den preussiske blue metode. Det var klart at absorbans på 715 nm var også den optimale bølgelængde her så godt (figur 3). Derfor blev denne bølgelængde brugt i alle eksperimenter.
En lineær regression kurve blev afbildet mellem jern koncentrationsværdier fremstillet ved Frederiksen og absorbans (OD) værdier opnået med den preussiske blue metode for prøver repræsenteret i figur 3 (figur 4). Den følgende regression blev opnået: [Fe] = 0,32 + 25.3 x OD, r = 0.994 og R2= 0,988.
Figur 3: absorbans bølgelængde spektre af tobak aske blandet med preussiske blue løsning som beskrevet i protokollen. Bølgelængde spectra blev divideret med koncentrationen af aske. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: lineær regressionsanalyse af Fe koncentration i tobak aske målt ved Frederiksen og lys absorbans (OD, 715 nm) fremstillet ved den preussiske Blue metode. Den følgende regression blev opnået: [Fe] = 0,32 + 25.3 x OD, r = 0.994, R2= 0,988. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Den opnåede lineær regression kan nu bruges til nye prøver fra den samme plante type, som angivet i trin 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jern måling i plantevæv er meget vigtige for at vurdere virkningerne af kunstvanding eller andre miljøforhold. Her, beskrev vi en nem og præcis kolorimetriske metode til Fe indhold måling i tobaksblade, der let kan tilpasses til andre plantearter og væv.
I at optimere betingelserne for den kolorimetriske metode, brugte vi en lav pH medium (pH < 1,0) for at tillade jern opløselighed. Brændingen var udført at frigive alle former for jern og sikre, at ingen forurenende stoffer i prøverne ville ændre resultaterne. Med hensyn til jern forurening, man burde holde inde indre at 6,7% af jordskorpen består af jernoxid arter (FeOn)21 og at deres koncentrationer kan nå 0,009% af plante tørvægt22. Derfor bør man overveje risikoen for kontaminering, siden støv, som kan indeholde så meget som 3-7% jern (afhængigt af region)23, kan stærkt påvirke resultaterne. Det er også nødvendigt nøje at kontrollere jernindhold af alt udstyr, der anvendes i forsøget og til at tage alle nødvendige forholdsregler for at undgå kontaminering. Det anbefales at rengøre alle udstyr som havde været i kontakt med luft eller som er ved at blive genbrugt i eksperimentet med 4% HCl løsning. Brug af enhver metallisk værktøj, såsom saks eller skeer, bør undgås helt, i stedet at blive erstattet af glas eller plast versioner. Afgørende skridt til at undgå jern forurening blev fremhævet i trin 3.1 og 4.1, f.eks.
Undlade at hente et signal fra en prøve kunne opstå på grund af problemer, der opstår på forskellige trin i protokollen. I dette tilfælde anbefales det at tjekke reagenser mod løsninger med en kendt jern koncentration. Hvis problemerne fortsætter, bør være forberedt friske preussiske blue reagens. Skal standarden, men viser et signal, dette viser, at koncentrationen af jern i stikprøven var tærsklen på påvisning og at prøven bør være mere koncentreret. Store variationer mellem replikater kunne stamme fra jern forurening og vil kræve anvendelse af nye prøver.
Kalibreringskurverne skal genereres hver sjette måned eller hver gang et nyt parti af preussiske blue reagens bruges. Den indledende kalibreringskurven skal valideres ved at måle jernindhold i mindst 6 prøver og bekræfter, at den lineære regression er stadig præcis. Kalibreringskurverne er det væsentligt at få værdier tæt på + 1 eller -1 for r (korrelationskoefficienten) og 1 R2 (determinationskoefficienten)24,25,26. Mens en perfekt linje vil have en R2 værdi af 1, er de fleste Rasmussen2 værdier over 0,95 acceptabelt for kalibreringskurver.
Begrænsninger af protokollen omfatter det faktum, at forskellige plantevæv og arter kan vise forskellige korrelation kurver ved hjælp af de beskrevne procedurer til bestemmelse af jern koncentration. Det anbefales derfor, at udføre en pilot test for at sikre, at korrelationen kurve er nøjagtig for en given eksperiment. Hvis du vil bruge kurven for opnåede resultater, den nyligt målte OD-værdi bør erstattes i formlen Y = en + bX. I det foreliggende tilfælde, følgende formel blev anvendt: [Fe] = 0,32 + 25.3 x OD.
En anden begrænsning udspringer af behovet for en temmelig stor mængde af plantevæv. Dette kan omgås til en vis grad af tilpasning HCl volumen bruges til at opløse asken (Se trin 5.3) for at opnå et passende signal. Metoden beskrevet her er dog en god mulighed hvis dyrt udstyr, som anvendes til ICP-MS, eller klar adgang til Frederiksen er ikke tilgængelig og/eller talrige prøver af de samme plantearter er der skal analyseres.
Muligt yderligere anvendelser af den preussiske blue metode som et system til registrering af jern omfatter kvantitative jern påvisning i organisk materiale, der kan bringes til aske og uorganiske materiale, såsom jord.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Israel Ministeriet for videnskab, teknologi og Spaceand af et tilskud fra chefforsker af den israelske landbrugsministerium (#16-16-0003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Hexacyanoferrate(II) | Fisher Chemical | 14459-95-1 | Reagent for the Pussian Blue |
| Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 μm | Millec | SLGP033RS | Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution |
| Scintillation Vials | Fisherbrand | 03-337-4 | Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure. |
| Disposable Syringe 10 ml | Medi-Plus | 1931 | Syringe used during the filtration |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 231-595-7 | Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials |
| Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN | Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab | Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407. | Tobacco cultivar used in this protocol |
| Glass Wool (Rock Wool) | Sigma-Aldrich | 659997-17-3 | Used in the procedure of burning samples in the furnace. |
References
- Kobayashi, T., Nishizawa, N. K. Iron uptake, translocation, and regulation in higher plants. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 131-152 (2012).
- Bradley, J. M., Le Brun, N. E., Moore, G. R. Ferritins: Furnishing proteins with iron. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 21 (1), 13-28 (2012).
- Zielińska-Dawidziak, M. Plant ferritin - a source of iron to prevent its deficiency. Nutrients. 7 (2), 1184-1201 (2015).
- Johnson, D. C., Dean, D. R., Smith, A. D., Johnson, M. K. Structure, function, and formation of biological iron-sulfur clusters. Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 247-281 (2015).
- Guo, H., Barnard, A. S. Naturally occurring iron oxide nanoparticles: morphology, surface chemistry and environmental stability. Journal of Materials Chemistry A. 1 (1), 27-42 (2013).
- Hem, J. D., Cropper, W. H. Chemistry of iron in natural water. Report US Geological Survey. , 1-31 (1962).
- Rout, G. R., Sahoo, S. Role of iron in plant growth and metabolism. Reviews in Agricultural Science. 3, 1-24 (2015).
- Speretto, R. A., Ricachenevsky, F. K., Stein, R. J., de Abreu Waldow, V., Fett, J. P. Iron stress in plants Dealing with deprivation and overload. Plant Stress. 4, 57-69 (2010).
- Tautkus, S., Steponeniene, L., Kazlauskas, R. Determination of iron in natural and mineral waters by flame atomic absorption spectrometry. Journal of the Serbian Chemical Society. 69 (5), 393-402 (2006).
- Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. Journal of Microbiological Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
- PerkinElmer. Atomic Spectroscopy - Guide to Selecting the Appropriate Technique and System. 16, (2011).
- Wachasunder, S. D., Nafade, A. Precision and accuracy control in the determination of heavy metals by atomic absorption spectrometry. Science. 58, 517-528 (2001).
- Woods, J. T., Mellon, M. G. Thiocyanate method for iron. A spectrophotometric study. Industrial & Engineering Chemistry Analytical Edition. 13 (8), 551-554 (1941).
- Perls, M. Nachweis von Eisenoxyd in gewissen Pigmenten. Virchows Archiv Fur Pathologische Anatomie Und Physiologie Und Fur Klinische Medizin. 39 (1), 42-48 (1867).
- Connorton, J. M., Jones, E. R., Rodriguez-Ramiro, I., Fairweather-Tait, S., Uauy, C., Balk, J. Altering expression of a vacuolar iron transporter doubles iron content in white wheat flour. bioRxiv. , 1-25 (2017).
- de la Fuente, V., Rufo, L., Rodríguez, N., Franco, A., Amils, R. Comparison of iron localization in wild plants and hydroponic cultures of Imperata cylindrica (L.) P. Beauv. Plant Soil. 418 (1-2), 25-35 (2017).
- Hsiao, P. Y., Cheng, C. P., Koh, K. W., Chan, M. T. The Arabidopsis defensin gene, AtPDF1.1, mediates defence against Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum via an iron-withholding defence system. Science Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Johnson, D. B., Kanao, T., Hedrich, S. Redox transformations of iron at extremely low pH: Fundamental and applied aspects. Frontiers in Microbiology. 3, 1-13 (2012).
- Stumm, W., Lee, G. F. Oxygenation of ferrous iron. Industrial & Engineering Chemistry. 53 (2), 143-146 (1961).
- Jones, A. M., Griffin, P. J., Collins, R. N., Waite, T. D. Ferrous iron oxidation under acidic conditions - The effect of ferric oxide surfaces. Geochimica et Cosmochimica Acta. 145, 1-12 (2014).
- Hawkesworth, C. J., Kemp, A. I. S. Evolution of the continental crust. Nature. 443 (7113), (2006).
- Thompson, L. M. Soils and soil fertility. Louis, M., Troeh, F. R., Thompson, L. M. , (1973).
- Krueger, B. J., Grassian, V. H., Cowin, J. P., Laskin, A. Heterogeneous chemistry of individual mineral dust particles from different dust source regions: The importance of particle mineralogy. Atmospheric Environment. 38 (36), 6253-6261 (2004).
- Bewick, V., Cheek, L., Ball, J. Statistics review 7: Correlation and regression. Journal of Critical Care. 7 (6), 451-459 (2003).
- Asuero, A. G., Sayago, A., González, A. G. The correlation coefficient: An overview. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 36 (1), 41-59 (2006).
- JoVE Science Education Database. Analytical Chemistry. Calibration Curves. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves (2018).
