Summary
Vi presenterer en enkel og pålitelig protokoll for å måle jerninnhold anlegget vev med metoden for kolorimetrisk prøyssiske blå.
Abstract
Jern, en av de viktigste mikronæringsstoffer i levende organismer, er involvert i grunnleggende prosesser, som åndedrett og fotosyntese. Jerninnhold er ganske lav i alle organismer, pålydende i planter ca 0,009% av tørrvekt. Hittil er en av de mest nøyaktige metodene for måling av jern konsentrasjon i anlegget vev flamme absorpsjon atomic spektroskopi. Men dette er tidkrevende og kostbar og krever bestemt utstyr ikke ofte funnet i anlegget laboratorier. Derfor er en enklere, men presis metode som kan brukes rutinemessig nødvendig. Kolorimetrisk prøyssiske blå metoden brukes jevnlig for kvalitativ jern farging i dyre- og plantelivet histologiske deler. I denne studien tilpasset vi den prøyssiske blå metoden for kvantitative mål av jern i tobakk blader. Vi validert nøyaktigheten av denne metoden bruker både Atom spektroskopi og prøyssiske blå flekker å måle jerninnhold i samme prøvene og fant en lineær regresjon (R2 = 0.988) mellom de to prosedyrene. Vi konkludere med at den prøyssiske blå metoden for kvantitative jern måling i anlegget vev er nøyaktig, enkel og rimelig. Men kan lineær regresjon presenteres her ikke være passende for andre plantearter, på grunn av potensielle interaksjoner mellom prøven og reagens. Etablering av en regresjons-kurven er derfor nødvendig for forskjellige plantearter.
Introduction
Iron (Fe) er en viktig micronutrient i alle levende organismer. I planter er det en viktig micronutrient1 på grunn av sitt engasjement i basic prosesser, for eksempel åndedrett, fotosyntese og klorofyll biosyntesen. Høy opphopning av ledig jern ioner er skadelig til anlegget celler skyldes reaksjoner fører til utgivelsen av frie radikaler forårsake oksidativt stress. For å opprettholde jern homeostase i anlegget celle, ioner lagres i vacuoles og sequestered i ferritins, protein burene direkte involvert i iron homeostase2 og den primære lagringsområdet strukturen i jern i alle levende organismer. Samtidig påvirker jernmangel anemi en betydelig andel av befolkningen, som resulterer i et økende behov for plante Fe biofortification. På grunn av de unike egenskapene til anlegget ferritin tilbyr mat berikelse med ferritin-jern en lovende strategi for å bekjempe dette problemet av underernæring3.
Jern ioner er hovedsakelig finnes i to oksidasjon stater, nemlig den jern (divalent Fe2 + eller jern (II)) og ferric (trivalent Fe3 + eller jern (III)) skjemaer. Flere andre former av jern, som jern klynger4, finnes også i celler. Fe lagres som jernoksid i cellen og naturlig former hematites (Fe2O3) og ferryhidrites ((Fe3 +)2O3•0.5 H2O) under fysiologiske forhold5. Hydroxides i disse reaksjonene, spesielt ferric skjemaet har svært lav oppløselighet. Jern oppbevaring påvirkes derfor av pH av løsningen og er i stor grad et solid state over pH 56.
Vurderer dårlig løslighet og høy reaktivitet Fe, må overtatt blant anlegget vev og organer være forbundet med egnet chelaterande molekyler. Videre må sine redoks tilstander mellom jern og ferric skjemaer1 kontrolleres. I blader, rundt 80% av jern finnes i fotosynteseaktiviteten celler, på grunn av dens viktige roller i elektronet transportsystem, i biosyntesen av cytochromes, klorofyll og andre måltema molekyler, og i dannelsen av Fe-S klynger7. Ved jern overflødig i cellen, er overskuddet translocated i vacuole der metall lagres i ferritin molekyler8.
Jern kan måles i anlegget vev av flere metoder, inkludert flamme atomic absorpsjon spektroskopi9 (FAAS) eller kolorimetrisk analyser10, det tidligere er langt mer presis enn sistnevnte. FAAS er en svært nøyaktige teknikk som gjør det mulig å bestemme elementær sammensetningen av et eksempel på grunnlag av elektromagnetiske utslipp av enkeltelementer. FAAS konverterer metall ioner å Atom stater av flamme-oppvarming av prøven, fører til ion eksitasjon og utslipp av en bestemt bølgelengde når en gitt ion tilbake til tilstanden bakken. Utslippene fra de ulike ionene er atskilt med en monokromator og oppdaget av en absorpsjon sensor11. FAAS bidrar dermed til direkte kvantifisere konsentrasjoner av jern. Andre teknikker for å visualisere jern i biologisk vev er imidlertid tilgjengelige. Induktivt kombinert plasma-masse spektroskopi (ICP-MS)12 er en veldig presis teknikk for måling av jern og andre sporstoffer, men mangel på utstyr, både FAAS og ICP-MS, er et vanlig problem. På den annen side, jern måling av thiocyanate colorimetry13 mangler presisjon og svikter å merker små variasjoner mellom eksempler. Prøyssiske blå flekker14,15,16,17 er en indirekte metode basert på reaksjonen av kalium ferric ferrocyanide (K4Fe(CN)6) med Fe kasjoner, produsere en sterk blå farge, og brukes for kvalitativ jern gjenkjenning histologiske deler av dyre- og plantelivet vev.
Metallisk (null-valent) jern er sjeldne i jordskorpen. Dominerende ikke-kompleksbundet ionisk form av jern i miljøet er stort sett diktert av mengden av oksygen i omgivelsene, med jern jern er relativt mer rikelig i anoksisk miljøer og ferric jern predominating i aerobic områder. Denne siste formen er også dominerende i svært sure miljøer, selv om den forårsaker agenter av jern jern oksidasjon ofte avvike anoksisk og sure18. Når jern er solubilized i 4% HCl (pH 0) i aerobic miljø, av utvannet jern finnes som den ferric danner (Fe3 +)19,20.
Reaksjonene mellom Fe ioner og K4Fe(CN)6 er som følger:
Fe3 +: FeCl3 + K4Fe(CN)6 = KFe(III)Fe(II)(CN)6° + 3KCl
Fe2 +: 4 FeCl2 + 2 K4Fe(CN)6 = Fe4(Fe(CN)6)2 + 8 KCl
Studien spurte vi om prøyssiske blå flekker kan være nyttig for å måle jern nivåer i løsningen.
I utgangspunktet bekreftet vi sammenhengen mellom konsentrasjonen av Fe i vandig løsning og prøyssiske blå flekker. Fe (som FeCl2, FeCl3 eller en 1:1 blanding av to) konsentrasjonen i vandige løsninger ble målt etter atomic spektroskopi og absorbansen (OD) etter prøyssiske blå. Figur 1 viser lineær regresjon kurvene for målinger ved hver metode. Vi konkluderte med at den prøyssiske blå metoden kan brukes for kvantitativ analyse av jern konsentrasjon i løsningen.
Figur 1: lineære regresjoner mellom Fe konsentrasjon målt ved FAAS og lys absorbansen (OD, 715 nm) innhentet av Prussian blå metoden. Den blå firkanter og linjen representerer Fe2 + løsningen, røde firkanter og linjen representerer Fe3 + løsningen og de svarte firkantene og linje representerer en 1:1 mellom Fe2 + og Fe3 +. Følgende regresjoner anskaffet: [Fe2 +] = 3 + 123 x OD, r = 0.996, R2 = 0.989; [Fe3 +] = 1 + 292 x OD, r = 0.999, R2 = 0.997; og [Fe2 / 3 +] = 11 + 146 x OD, r = 0.983, R2 = 0.956. Fe2 + donor var FeCl2 Fe3 + donor var FeCl3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å tilpasse kolorimetrisk prøyssiske blå metoden for kvantitative jern analyse av anlegget vev, ble jerninnhold på tobakk blad asken målt ved flamme absorpsjon atomic spektroskopi og prøyssiske blå flekker. Det var god sammenheng mellom resultatene av de to teknikkene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plante materiale og vekst betingelser
- Frø en tobakk (sorten Samsun) frø per 5 cm x 5 cm pott fylt med standard potten medium. Plass pottene på skuffer. Dyrke planter i et vekst rom under lang dag forhold (16/8 h lys/mørke) ved en konstant temperatur på 23 ° C. Vanne med vann inntil vannet faller ut fra potten.
- Etter 50±5 dager, start Fe behandlinger i vanning, etter konsentrasjonene egnet for eksperimentet. For eksempel brukte vi en rekke konsentrasjoner av jern fra 0 til 6 mM, supplert med en løselig Fe chelator (Fe EDDHA). Vanne plantene med den riktige løsningen annenhver dag (for å unngå dehydration) for 6-8 dager.
2. forbereder bladene jern måling
Merknader: Alle materialer brukes må jern-fri for å redusere risikoen for jern forurensning. Rengjør morter to ganger med 4% HCl løsning og tørk med filter papir før bruk. Hvis materiale brukes på nytt, rengjør den to ganger med 4% HCl løsning og tørr med filter papir.
- Koble bladene fra stammen for hånd, med hansker (ikke bruk metall utstyr). Bruk ca 10 g av blader (frisk vekt) for hvert utvalg. Rengjør hvert blad med dobbel destillert vann (DDW) bruker en sprayflaske. Dette trinnet er viktig å unngå Fe forurensning.
- Tørk bladene på papirhåndkle og sette dem i en papirpose. Overføre papirposer til en ovn ved en konstant temperatur på 80 ° C for 2-3 dager.
- Når tørr, knuse bladene til pulver med en morter og pistil og overføring til sterilt 15 mL plast rør.
3. brennende bladene til aske
Merknader: Bruk av en lav pH (nær 0) løsning av HCl er ment å øke Løseligheten av jern. Rock ull brukes til å hindre at gassene rømmer ampullen under brenningen.
- Veie nye, forseglet 20 mL scintillation ampuller uten sin lokket. Merk verdien eller angi verdien null ved hjelp av knappen tare. Legg knust tørkede blader (eksempel) til ampullen.
- Veie samplingsfrekvens og beholder og noter verdien. Lukk ampullen med rock ull.
- Veie 3 ekstra ampuller uten å legge prøver og Merk verdiene. Disse ampuller brukes som kontroller for å vurdere hvor mye rock ull som kunne ført til en økning i eksempel vekt.
- Plasser prøven og kontroll hetteglass i en ovn og starte brenner ved hjelp av følgende temperatur: romtemperatur, rask økning 425 ° C, og, endelig, 425° C i 4 timer. På denne tiden vil de tørre bladene har slått til aske.
- Avkjøl prøver ned til rundt 100 ° C, men ikke under denne temperaturen for de følgende to trinnene å unngå fuktighet, som kan påvirke den endelige vekten av prøven. Bruke tunge hansker, fjerne prøvene fra ovnen med pinsett, holde ampullen exteriorly.
- Legg hetteglass på flatt underlag, fjerne rock ull og Lukk hetteglass med sine opprinnelige lokk.
- Veie 3 kontroll hetteglassene (se 3.3) og beregne deres gjennomsnittlig vektøkning. Hvis vektøkning er lik eller over 1% av aske vekten (se trinn 4.2), bruker denne verdien som et overslag av måling.
4. forberede asken jern måling
Merknader: Den endelige jern konsentrasjonen i første eksemplet beregnes som vekten av asken delt lagt volumet av HCl.
- Forberede en 1 M HCl løsning (4% HCl) ved å legge til 12,5 mL av en 37% HCl lagerløsning 87,5 mL av DDW (i en plast eller glass bolle).
- Veie et 15 mL plastrør og noter verdien eller angi verdien null ved hjelp av knappen tare. Overføre asken til røret, veier, og noter verdien. Dette er ash vekten.
- Legge til 5 mL 1 M HCl asken. Filtrere asken gjennom filtere 22 µm og legge en ekstra 5 mL 1 M HCl gjennom samme filter.
- Det siste bindet skal 10 mL. Merk at en del av løsningen vil gå tapt i filteret.
Merk: Prøvene er nå klar for Fe måling ved FAAS eller metoden prøyssiske blå. - Lag en kalibreringskurven med Fe konsentrasjonen målt ved å Atom massespektrometri og prøyssiske blå metoden (se Figur 4) for hver plantearter. Deretter kan Fe konsentrasjon måles ved metoden prøyssiske blå alene.
5. måle Fe konsentrasjon av FAAS
- Fjern 4 mL fra hvert utvalg for måling av FAAS.
- Dele resultatene fra FAAS måling av vekten av asken. Dele resultatverdien 0,01 (fordi asken ble solubilized i 10 mL). Resultatverdien er jern konsentrasjon per gram aske (ppm).
6. forbereder den prøyssiske blå flekker løsning
- Forberede en 4% prøyssiske blå løsning ved å legge til 4 g K4Fe(CN)6 til 100 mL DDW og vortex (andre volumer og/eller konsentrasjoner kan brukes for ulike krav). Det bør bemerkes at i denne studien, en mindre konsentrert prøyssiske blå løsning enn tidligere rapportert (20%)14 ble brukt.
- Hold løsningen i mørket på 4 ° C før bruk. Løsningen er stabil for 6 måneder når lagret på slike forhold.
7. generere en kalibreringskurven for den prøyssiske blå hjelp FAAS resultatene
Merk: Beregn jern konsentrasjonen i aske bruker følgende formel
Formel 1
C: konsentrasjon, V: prøve volum, W: aske vekt (g).
- Bland 0,50 mL av Prussian blå løsning og 0,50 mL 1 M HCl. Dette vil tjene som Tom løsning.
- Bland 0,5 mL av prøven (aske i 4% HCl, som beskrevet i del 3) og prøyssiske blå stoppløsningen (trinn 6.1) av pipettering 0,5 mL. Vent minst 1 minutt men ikke mer enn 5 minutter. Etter 5 minutter, vil sedimentering i prøvene skje.
- Overføre blandingen til søppel og måle OD på 715 nm bruker et spektrofotometer. Note verdien.
- Dele OD verdien (trinn 7.3) av aske vekten (trinn 3.2) av prøven. Resultatet representerer OD per gram aske.
- Plot lineær regresjon mellom konsentrasjonene av jern FAAS målinger (Y-aksen) og OD verdiene (X-aksen). Bruke resultatene i trinn 5.2 og 7.4. Beregne regresjon formel, Y = en + bX, der Y representerer jern konsentrasjon, en representerer absorbansen krysser, b representerer absorbansen skråningen og X representerer OD.
8. Bruk metoden prøyssiske blå for å bestemme jern nivåer i andre prøver fra samme plante Type
Merknader: Siden en kalibreringskurven er allerede opprettet for denne typen anlegg jern konsentrasjon i noen nye eksempler fra samme plante type kan direkte beregnes ved hjelp av lineær regresjon formel.
- Fremgangsmåten i delene 3 og 4, etterfulgt av trinn 7.1 til 7.4.
- Beregn jern konsentrasjon i løsning ved hjelp av formelen fra den lineære regresjonen (trinn 7.5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når denne protokollen utføres riktig, bør man få utmerket sammenheng mellom resultatene av Prussian blå og Atom spektroskopi metoder. Derfor kan metoden prøyssiske blå lett brukes til å få en nøyaktig måling av jern konsentrasjon i anlegget prøver, som gjenspeiles i følgende eksperimentet.
Tobakk planter dyrket som beskrevet i protokollen og vannet med vann som inneholder forskjellige jern konsentrasjoner (0, 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 mM) over 7 dager. Plantene ble deretter høstet, rengjort og tørket for 3 dager på 80 ° C. De neste trinnene (dvs. fra trinn 2.3) protokollen ble etterfulgt som beskrevet. Siden kontroll hetteglassene viste en variant av mindre enn 1% fra aske vekten, ble denne verdien ikke lagt til flere beregninger.
Jern konsentrasjon ble målt ved FAAS. Tabell 1 viser representant resultatene av disse målingene. Data fra 21 prøver (7 konsentrasjoner i 3 replikerer) ble brukt til å generere en kalibreringskurven.
| Behandling (mM jern i vanning) | Anlegget | Jern konsentrasjon i HCl løsning (ppm) |
| 0 | A | 7.1 |
| 1 | B | 16.6 |
| 2 | C | 23.4 |
| 3 | D | 31,2 |
| 4 | F | 47,4 |
| 5 | G | 50,7 |
| 6 | H | 41,6 |
Tabell 1: Jern konsentrasjon i aske løsninger av tobakk blader fra planter vannet med vann som inneholder forskjellige jern nivåer.
Jern konsentrasjon i asken av ovennevnte 21 prøvene ble beregnet med verdier skaffet FAAS (se merknad i trinn 7). Resultatene viste at jern konsentrasjon i irrigasjon vann påvirket blad jerninnhold (figur 2).
Figur 2: effekten av jern i vanning på jern konsentrasjon i tobakk blader. Stolper representerer standardavvik (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I en innledende forsøket (vises ikke), absorbansen spektra av løsninger som inneholder ulike konsentrasjoner av Fe2 + og Fe3 + ble målt og beste toppen ble oppnådd ved 715 nm. Alle spektra av 21 prøvene ble også testet med metoden prøyssiske blå. Det var klart at absorbans ved 715 nm var også optimal bølgelengden her også (Figur 3). Derfor ble denne bølgelengde brukt i alle eksperimentene.
En lineære regresjons-kurven ble tegnet inn mellom jern konsentrasjon verdier skaffet FAAS og absorbansen (OD) verdiene innhentet med metoden prøyssiske blå for prøvene i Figur 3 (Figur 4). Følgende regresjon ble innhentet: [Fe] = 0,32 + 25.3 x OD, r = 0.994 og R2= 0.988.
Figur 3: Absorbance bølgelengde spektra av tobakk aske blandet med prøyssiske blå løsning som beskrevet i protokollen. Bølgelengde spectra ble delt av konsentrasjonen av aske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: lineære regresjoner Fe konsentrasjon i tobakk aske målt ved FAAS og lys absorbansen (OD, 715 nm) ved metoden prøyssiske blå. Følgende regresjon ble innhentet: [Fe] = 0,32 + 25.3 x OD, r = 0.994, R2= 0.988. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Innhentet lineær regresjon kan nå brukes for nye prøver fra samme plante type, som nevnt i trinn 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jern måling i anlegget vev er svært viktig for å vurdere effekten av vanning eller andre miljøforhold. Her beskrev vi en enkel og nøyaktig kolorimetrisk metode for Fe innhold måling i tobakksblader som kan være lett tilpasses andre plantearter og vev.
Optimalisere betingelser for metoden kolorimetrisk, brukte vi et medium for lav pH (pH < 1.0) for å tillate jern oppløselighet. Den brennende prosessen ble utført å løslate alle former av jern og for å sikre at ingen forurensninger til stede i prøvene ville endre resultatene. Om jern forurensning, en bør huske på at 6,7% av jordens skorpe består av jernoksid arter (FeOn)21 og at konsentrasjonene kan nå 0,009% av anlegget tørrvekt22. Derfor bør man vurdere risikoen for forurensning, siden støv, som kan inneholde så mye som 3-7% jern (avhengig av regionen)23, kan sterkt påvirke resultatene. Det er også viktig å nøye sjekke jerninnhold på alle utstyr eksperimentet og ta alle nødvendige forholdsregler for å unngå forurensning. Det anbefales å rense alt utstyr som hadde vært i kontakt med luft eller som er blir gjenbrukt i eksperimentet med 4% HCl løsning. Bruk av metalliske verktøy, for eksempel saks eller skjeer, bør være helt unngås, blir i stedet erstattet glass eller plast versjoner. Viktige tiltak for å unngå jern forurensning ble markert i trinn 3.1 og 4.1, for eksempel.
Sviktende å få et signal fra et utvalg kan skyldes problemer som oppstår i forskjellige trinn i protokollen. I dette tilfellet anbefales det å sjekke reagensene mot løsninger med en kjent jern konsentrasjon. Hvis problemet vedvarer, bør frisk prøyssiske blå reagens være forberedt. Bør standard, men viser et signal, dette indikerer at jern konsentrasjon i utvalget var under gjenkjenning grensen og at utvalget skal være mer konsentrert. Store variasjoner blant gjentak kunne stamme fra jern forurensning og krever bruk av nye prøver.
Kalibrering kurver må genereres hvert halvår eller hver gang et nytt parti av Prussian blå reagens brukes. Første kalibreringskurven bør være nytt for å kunne måle jerninnhold i minst 6 prøver og bekrefter at den lineære regresjonen er fortsatt nøyaktig. I kalibrering kurver er det viktig å få verdier nær 1 eller -1 for r (korrelasjonskoeffisienten) og 1 for R2 (determinantens koeffisient)24,25,26. Mens en perfekt linje ville ha en verdi på 1 for R-2 , er de fleste R2 verdier over 0,95 akseptabelt for kalibrering kurver.
Begrensningene av protokollen inkluderer det faktum at en annen plante vev og arter kan vise forskjellige korrelasjon kurver bruke beskrevet prosedyrer for jern konsentrasjon vilje. Det anbefales derfor å utføre en pilottest for å sikre at korrelasjonen kurven for en bestemt eksperiment. For å bruk kurven for fått resultater, nylig målt OD verdien bør erstattes i formelen Y = en + bX. I den foreliggende sak, brukte formelen: [Fe] = 0.32 + 25.3 x OD.
En annen begrensning oppstår behovet for en ganske stor mengde anlegget vev. Dette kan omgås i noen grad av tilpasning HCl volumet som ble brukt til å oppløse asken (se trinn 5.3) for å oppnå et riktig signal. Likevel er metoden beskrevet her et godt alternativ hvis dyrt utstyr, som brukes for ICP-MS eller tilgang til FAAS er ikke tilgjengelig og/eller mange eksempler på samme plantearter skal analyseres.
Mulig tilleggsprogrammer av Prussian blå metoden som en jern detection system inkluderer kvantitative jern oppdagelsen i organisk materiale som kan bringes til aske og uorganisk materiale, som jord.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Israels departementet for vitenskap, teknologi og Spaceand av et stipend fra vitenskapsmann for Israels departementet av landbruket (#16-16-0003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Hexacyanoferrate(II) | Fisher Chemical | 14459-95-1 | Reagent for the Pussian Blue |
| Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 μm | Millec | SLGP033RS | Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution |
| Scintillation Vials | Fisherbrand | 03-337-4 | Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure. |
| Disposable Syringe 10 ml | Medi-Plus | 1931 | Syringe used during the filtration |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 231-595-7 | Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials |
| Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN | Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab | Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407. | Tobacco cultivar used in this protocol |
| Glass Wool (Rock Wool) | Sigma-Aldrich | 659997-17-3 | Used in the procedure of burning samples in the furnace. |
References
- Kobayashi, T., Nishizawa, N. K. Iron uptake, translocation, and regulation in higher plants. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 131-152 (2012).
- Bradley, J. M., Le Brun, N. E., Moore, G. R. Ferritins: Furnishing proteins with iron. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 21 (1), 13-28 (2012).
- Zielińska-Dawidziak, M. Plant ferritin - a source of iron to prevent its deficiency. Nutrients. 7 (2), 1184-1201 (2015).
- Johnson, D. C., Dean, D. R., Smith, A. D., Johnson, M. K. Structure, function, and formation of biological iron-sulfur clusters. Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 247-281 (2015).
- Guo, H., Barnard, A. S. Naturally occurring iron oxide nanoparticles: morphology, surface chemistry and environmental stability. Journal of Materials Chemistry A. 1 (1), 27-42 (2013).
- Hem, J. D., Cropper, W. H. Chemistry of iron in natural water. Report US Geological Survey. , 1-31 (1962).
- Rout, G. R., Sahoo, S. Role of iron in plant growth and metabolism. Reviews in Agricultural Science. 3, 1-24 (2015).
- Speretto, R. A., Ricachenevsky, F. K., Stein, R. J., de Abreu Waldow, V., Fett, J. P. Iron stress in plants Dealing with deprivation and overload. Plant Stress. 4, 57-69 (2010).
- Tautkus, S., Steponeniene, L., Kazlauskas, R. Determination of iron in natural and mineral waters by flame atomic absorption spectrometry. Journal of the Serbian Chemical Society. 69 (5), 393-402 (2006).
- Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. Journal of Microbiological Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
- PerkinElmer. Atomic Spectroscopy - Guide to Selecting the Appropriate Technique and System. 16, (2011).
- Wachasunder, S. D., Nafade, A. Precision and accuracy control in the determination of heavy metals by atomic absorption spectrometry. Science. 58, 517-528 (2001).
- Woods, J. T., Mellon, M. G. Thiocyanate method for iron. A spectrophotometric study. Industrial & Engineering Chemistry Analytical Edition. 13 (8), 551-554 (1941).
- Perls, M. Nachweis von Eisenoxyd in gewissen Pigmenten. Virchows Archiv Fur Pathologische Anatomie Und Physiologie Und Fur Klinische Medizin. 39 (1), 42-48 (1867).
- Connorton, J. M., Jones, E. R., Rodriguez-Ramiro, I., Fairweather-Tait, S., Uauy, C., Balk, J. Altering expression of a vacuolar iron transporter doubles iron content in white wheat flour. bioRxiv. , 1-25 (2017).
- de la Fuente, V., Rufo, L., Rodríguez, N., Franco, A., Amils, R. Comparison of iron localization in wild plants and hydroponic cultures of Imperata cylindrica (L.) P. Beauv. Plant Soil. 418 (1-2), 25-35 (2017).
- Hsiao, P. Y., Cheng, C. P., Koh, K. W., Chan, M. T. The Arabidopsis defensin gene, AtPDF1.1, mediates defence against Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum via an iron-withholding defence system. Science Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Johnson, D. B., Kanao, T., Hedrich, S. Redox transformations of iron at extremely low pH: Fundamental and applied aspects. Frontiers in Microbiology. 3, 1-13 (2012).
- Stumm, W., Lee, G. F. Oxygenation of ferrous iron. Industrial & Engineering Chemistry. 53 (2), 143-146 (1961).
- Jones, A. M., Griffin, P. J., Collins, R. N., Waite, T. D. Ferrous iron oxidation under acidic conditions - The effect of ferric oxide surfaces. Geochimica et Cosmochimica Acta. 145, 1-12 (2014).
- Hawkesworth, C. J., Kemp, A. I. S. Evolution of the continental crust. Nature. 443 (7113), (2006).
- Thompson, L. M. Soils and soil fertility. Louis, M., Troeh, F. R., Thompson, L. M. , (1973).
- Krueger, B. J., Grassian, V. H., Cowin, J. P., Laskin, A. Heterogeneous chemistry of individual mineral dust particles from different dust source regions: The importance of particle mineralogy. Atmospheric Environment. 38 (36), 6253-6261 (2004).
- Bewick, V., Cheek, L., Ball, J. Statistics review 7: Correlation and regression. Journal of Critical Care. 7 (6), 451-459 (2003).
- Asuero, A. G., Sayago, A., González, A. G. The correlation coefficient: An overview. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 36 (1), 41-59 (2006).
- JoVE Science Education Database. Analytical Chemistry. Calibration Curves. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves (2018).
