Summary
Presentamos un protocolo sencillo y fiable para medir el contenido de hierro en los tejidos de la planta usando el método colorimétrico de azul de Prusia.
Abstract
Hierro, uno de los micronutrientes más importantes en los organismos vivos, está involucrado en procesos básicos, tales como la respiración y la fotosíntesis. Contenido de hierro es más bien bajo en todos los organismos, por importe de cerca de 0.009% de peso seco en plantas. Hasta la fecha, uno de los métodos más exactos para medir la concentración de hierro en los tejidos vegetales es la espectroscopía de absorción atómica por llama. Sin embargo, este enfoque es lento y costoso y requiere un equipo específico no comúnmente en laboratorios de la planta. Por lo tanto, es necesario un método más simple, pero preciso que puede ser utilizado rutinariamente. El método colorimétrico de azul de Prusia se utiliza regularmente para hierro cualitativo tinción en secciones histológicas animales y vegetales. En este estudio, hemos adaptado el azul de Prusia, método para la medición cuantitativa de hierro en el tabaco deja. Validamos la exactitud de este método usando Espectroscopia atómica y azul de Prusia de tinción para medir contenido de hierro en las mismas muestras y encontró una regresión lineal (R2 = 0.988) entre los dos procedimientos. Concluimos que el método de azul de Prusia para la medición cuantitativa de hierro en los tejidos vegetales es precisa, simple y barato. Sin embargo, la regresión lineal presentada aquí puede no ser apropiada para otras especies de plantas, debido a las interacciones potenciales entre la muestra y el reactivo. Establecimiento de una curva de regresión es así necesario para diferentes especies de plantas.
Introduction
Hierro (Fe) es un micronutriente importante en todos los organismos vivos. En las plantas, es un micronutriente esencial1 debido a su implicación en procesos básicos, como la biosíntesis de la clorofila, la fotosíntesis y la respiración. Alta acumulación de iones de hierro libre es dañino para las células debido a las reacciones que conducen a la liberación de radicales libres que causan el estrés oxidativo de la planta. Para mantener la homeostasis del hierro dentro de la célula de la planta, los iones se almacenan en vacuolas y secuestrados en ferritins y jaulas de proteínas directamente involucradas en la homeostasis de hierro2 la estructura principal de almacenamiento de hierro en todos los organismos vivos. Al mismo tiempo, la anemia por deficiencia de hierro afecta a una proporción significativa de la población humana, resultando en una creciente necesidad de planta bioenriquecimiento del contenido de Fe. Debido a las propiedades únicas de ferritina de planta, enriquecimiento de alimentos con hierro de la ferritina ofrece una prometedora estrategia para combatir este problema de la desnutrición3.
Los iones de hierro son principalmente en dos Estados de oxidación, es decir, ferrosos (divalente del Fe2 + o hierro (II)) y férrico (trivalente Fe3 + o hierro (III)) formas. Varias otras formas de hierro, como hierro de grupos4, también se encuentran en las células. Fe se almacena como óxido de hierro dentro de la célula y naturalmente hematites de formas (Fe2O3) y ferryhidrites ((Fe3 +)2O3•0.5 H2O) bajo condiciones fisiológicas5. Los hidróxidos formados en estas reacciones, especialmente la forma férrica, tienen muy baja solubilidad. Retención de hierro por lo tanto se ve afectada por el pH de la solución y es en gran parte en estado sólido por encima de pH 56.
Teniendo en cuenta la pobre solubilidad y reactividad alta de Fe, su transferencia entre órganos y tejidos de la planta debe ser asociado con moléculas quelantes adecuadas. Por otra parte, se deben controlar sus Estados redox entre las formas ferrosa y férrica1 . Dentro de hojas, aproximadamente el 80% del hierro se encuentra en células fotosintéticas, debido a su papel esencial en el sistema de transporte de electrones, en la biosíntesis de los citocromos, clorofila y otras moléculas de hemo y en la formación de Fe-S grupos de7. En el caso de hierro exceso dentro de la célula, el superávit se transloca en la vacuola donde el metal se almacena en moléculas de ferritina8.
Hierro puede medirse en los tejidos vegetales por varios métodos, incluyendo llama absorción atómica Espectroscopia9 (FAAS) o análisis colorimétrico10, el primero es mucho más precisa que la segunda. FAAS es una técnica muy precisa que permite determinar la composición elemental de una muestra sobre la base de la emisión electromagnética de los elementos individuales. FAAS convierte los iones del metal en Estados atómicos de llama-calentamiento de la muestra, llevando a ion excitación y emisión de una longitud de onda específica cuando un ion dado regresa a su estado de tierra. Las emisiones de los diferentes iones se separan por un monocromador y detectadas por un sensor de absorción11. FAAS así sirve cuantificar directamente las concentraciones de hierro. Sin embargo, otras técnicas para la visualización de hierro en los tejidos biológicos están disponibles. Espectroscopia de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS)12 es una técnica muy precisa para medir el hierro y otros oligoelementos, pero la falta de equipamiento, tanto para la FAAS y ICP-MS, es un problema común. Por otro lado, medición de hierro con tiocianato colorimetría13 carece de precisión y no detectar pequeñas variaciones entre las muestras. Azul prusiano tinción14,15,16,17 es un método indirecto basado en la reacción de ferrocianuro férrico de potasio (K4Fe(CN)6) con cationes de Fe, produciendo un color azul fuerte y se utiliza para la detección cualitativa de hierro en secciones histológicas de los tejidos animales y vegetales.
Hierro metálico (cero-Valente) es rara en la litosfera. La forma iónica no complejado dominante de hierro en el medio ambiente sobre todo obedece a la cantidad de oxígeno en los alrededores, con hierro ferroso, siendo relativamente más abundantes en ambientes anóxicos y hierro férrico predomina en sitios de aeróbicos. Esta última forma también es dominante en ambientes extremadamente ácidos, aunque los agentes causantes de la oxidación de hierro ferroso diferencian a menudo en un ambiente anóxico y ácido18. Cuando el hierro es solubilizado en el 4% HCl (pH 0) en un ambiente aeróbico, la mayor parte del hierro diluido existe ya que el férrico (Fe3 +)19,20.
Las reacciones entre los iones de Fe y K4Fe(CN)6 son las siguientes:
Fe3 +: FECLAS3 + K4Fe(CN)6 = KFe(III)Fe(II)(CN)6̄ + 3KCl
Fe2 +: 4 FECLAS2 + 2 K4Fe(CN)6 =4(Fe(CN)6) Fe2 + 8 KCl
En el presente estudio, preguntamos si la coloración azul prusiano puede ser útil para medir los niveles de hierro en solución.
Inicialmente, verificó la correlación entre la concentración de Fe en la solución acuosa y la coloración azul prusiano. La concentración de Fe (como FECLAS2, FECLAS3 o una mezcla 1:1 de los dos) en soluciones acuosas se midió absorbancia (OD) y espectroscopia atómica después de la adición de azul de Prusia. La figura 1 muestra las curvas de regresión lineal de las mediciones obtenidas por cada método. Llegamos a la conclusión que el método de azul prusiano puede utilizarse para el análisis cuantitativo de la concentración de hierro en solución.
Figura 1: regresiones lineales entre la concentración de Fe medición por FAAS y ligera absorbancia (OD, 715 nm) obtenidos por el método de azul prusiano. Los cuadrados azules y línea representan la solución de Fe2 + , la línea y cuadrados rojos representan la solución de Fe3 + y los cuadrados negros y línea representan una mezcla de 1:1 entre el Fe2 + y Fe3 +. Se obtuvieron las siguientes regresiones: [Fe2 +] = 3 + 123 x OD, r = 0.996, R2 = 0.989; [Fe3 +] = 1 + 292 x OD, r = 0.999, R2 = 0.997; y [Fe2 + / 3 +] = 11 + 146 x OD, r = 0.983, R2 = 0.956. El Fe2 + donante era FECLAS2 y el Fe3 + donante era FECLAS3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para adaptar el método colorimétrico del azul prusiano para el análisis cuantitativo del hierro de los tejidos de la planta, se midió el contenido de hierro de las cenizas de hoja de tabaco por espectroscopía de absorción atómica por llama y coloración azul prusiano. Hubo buena correlación entre los resultados de las dos técnicas.
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Protocol
1. Material y condiciones de crecimiento de la planta
- Semillas de tabaco uno (cultivar Samsun) de semilla por maceta de 5 cm x 5 cm llenan con medio pote estándar. Coloque las macetas sobre bandejas. Crecer las plantas en un cuarto de crecimiento bajo condiciones de día largo (16/8 h luz/oscuridad) a una temperatura constante de 23 ° C. Regar con agua del grifo hasta los desagües de agua de la olla.
- Después de días de 50±5, iniciar tratamientos de Fe en el riego, según las concentraciones adecuadas para el experimento. Por ejemplo, utilizamos una gama de concentraciones de hierro de 0 a 6 mM, complementado por un quelante de Fe soluble (Fe EDDHA). Regar las plantas con la solución adecuada cada dos días (para evitar la deshidratación) para 6-8 días.
2. preparación de las hojas para la medición de hierro
Notas: Todos los materiales a utilizarse deben estar libre de hierro con el fin de reducir el riesgo de contaminación de hierro. Limpiar el mortero y Maja dos veces con solución de HCl 4% y secar con papel de filtro cada vez que lo use. Si se reutiliza cualquier material, limpiar dos veces con solución de HCl 4% y secar con papel de filtro.
- Separar las hojas del tallo a mano, usando guantes (no usar cualquier equipo de metal). Utilice aproximadamente 10 g de hojas (peso fresco) para cada muestra. Limpiar cada hoja con agua bidestilada (DDW) utilizando una botella rociadora. Este paso es importante para evitar la contaminación de la Fe.
- Secar las hojas en una toalla de papel y ponerlos en una bolsa de papel. Transferir las bolsas de papel a un horno a una temperatura constante de 80 ° C durante 2-3 días.
- Cuando esté seco, aplasta las hojas a polvo con un mortero y Maja y transferencia a tubos de plástico estériles de 15 mL.
3. quema las hojas de ceniza
Notas: El uso de una solución de HCl de pH bajo (cerca de 0) está destinado a aumentar la solubilidad del hierro. La lana de roca se utiliza para evitar que los gases escapen el frasco durante la quema.
- Pesa un vial de centelleo 20 mL nuevo, sellado sin su tapa. Tenga en cuenta el valor o establecer el valor a cero usando el botón tare. Añadir las hojas secas machacadas (muestra) al vial.
- Pesar la muestra y recipiente y observe el valor. Cerrar la cubeta con lana de roca.
- Pesan 3 frascos adicionales sin el adición de muestras y anota sus valores. Estos frascos se utilizará como controles para evaluar la cantidad de lana de roca que podría haber llevado a un aumento en peso de la muestra.
- Colocar los frascos de muestra y control en un horno y comenzar a quemar los siguientes pasos de temperatura: temperatura ambiente, rápido aumento a 425 ° C y, finalmente, 425° C por 4 horas. Por este tiempo, las hojas secas habrá convertido a cenizas.
- Deje que se enfríe hasta unos 100 ° C las muestras pero no por debajo de esta temperatura para los dos pasos siguientes evitar la humedad, que podrían afectar el peso final de la muestra. Uso de guantes para trabajo pesados, quitar las muestras del horno con pinzas, sosteniendo el frasco externamente.
- Ponga los frascos sobre una superficie plana, sacar la lana de roca y cerrar los frascos con sus tapas originales.
- Pesar los frascos de 3 control (véase 3.3) y calcular su ganancia de peso promedio. Si aumento de peso es igual o superior al 1% del peso de cenizas (ver paso 4.2), utilice este valor como una estimación del error de medición.
4. preparación de las cenizas para medición de hierro
Notas: La concentración final de hierro en la muestra inicial se calcula como el peso de las cenizas dividido por el volumen añadido de ácido clorhídrico.
- Preparar una solución de HCl de 1 M (4% HCl) mediante la adición de 12,5 mL de una solución madre de ácido clorhídrico de 37% a 87,5 mL de DDW (en un frasco de plástico o vidrio).
- Pesa un tubo de plástico de 15 mL y anote el valor o ajuste a cero usando el botón tare. Transferir las cenizas al tubo, pesan y anote el valor. Este es el peso de la ceniza.
- Añadir 5 mL de 1 M de HCl a las cenizas. Las cenizas del filtro a través de un filtro de 22 μm y añadir un adicional 5 mL de 1 M de HCl a través del mismo filtro.
- El volumen final debe ser 10 mL. Tenga en cuenta que se perderá parte de la solución en el filtro.
Nota: Las muestras están ahora listas para medición de Fe por FAAS o por el método de azul de Prusia. - Hacer una curva de calibración con la concentración de Fe midió por Espectrometría Atómica y por el método de azul prusiano (ver figura 4) para cada especie de planta. Posteriormente, la concentración de Fe puede medirse por el método Prusiano azul solo.
5. medir la concentración de Fe por FAAS
- Extraiga 4 mL de cada muestra para la medición por FAAS.
- Dividir los resultados obtenidos de la medición de la FAAS por el peso de las cenizas. Dividir el valor resultante por 0.01 (porque las cenizas fueron solubilizadas en 10 mL). El valor resultante es la concentración de hierro por gramo de ceniza (ppm).
6. preparación de la solución de tinción del azul de Prusia
- Preparar un 4% solución azul prusiano al agregar 4 g de K4Fe(CN)6 a 100 mL DDW y vortex (otros volúmenes o concentraciones pueden utilizarse para diversas demandas). Cabe señalar que en este estudio, menos azul prusiano solución concentraron que se utilizó previamente divulgados (20%)14 .
- Mantener la solución en la oscuridad a 4 ° C hasta su uso. La solución es estable por 6 meses almacenado en estas condiciones.
7. generar una curva de calibración para el método de azul de Prusia con FAAS resultados
Nota: Calcular la concentración de hierro en las cenizas con la siguiente fórmula
Ecuación 1
C: concentración, V: volumen, W: peso de cenizas (g) de muestra.
- Mezclar 0,50 mL de solución de azul prusiano y 0,50 mL de 1 M de HCl. Esto servirá como la solución en blanco.
- Mezclar 0,5 mL de muestra (cenizas en el 4% HCl, como se describe en la sección 3) y 0,5 mL de solución de azul prusiano (paso 6.1) mediante pipeteo. Espere al menos 1 minuto pero no más de 5 minutos. Después de 5 minutos, se producirá la sedimentación en las muestras.
- Transferir la mezcla a una cubeta y medir la do a 715 nm usando un espectrofotómetro. Anote el valor.
- Dividir el valor de OD (paso 7.3) por el peso de la ceniza (paso 3.2) de la muestra. El resultado representa do por gramo de ceniza.
- Trama de la regresión lineal entre las concentraciones de hierro obtenidos de las mediciones de la FAAS (eje Y) y los valores de OD (eje X). Utilizar los resultados obtenidos en los pasos 5.2 y 7.4. Calcular la fórmula de regresión, Y = a + bX, donde Y representa la concentración de hierro, una representa la absorbancia se cruzan, b representa la pendiente de la absorbancia y X representa el OD.
8. el método de azul de Prusia para la determinación de los niveles de hierro en otras muestras del mismo tipo de planta
Notas: Desde una curva de calibración se ha establecido ya para este tipo de planta, la concentración de hierro en las muestras nuevas del mismo tipo de planta puede ser directamente calculada utilizando la fórmula de regresión lineal.
- Siga los pasos en las secciones 3 y 4, seguida por pasos de 7.1 a 7.4.
- Calcular la concentración de hierro en solución utilizando la fórmula obtenida de la regresión lineal (paso 7.5).
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Representative Results
Cuando este protocolo se lleva a cabo correctamente, se debe conseguir excelente correlación entre los resultados obtenidos por los métodos de espectroscopia atómica y azul prusiano. Por lo tanto, el método azul prusiano puede utilizar fácilmente para obtener una medición precisa de la concentración de hierro en muestras de la planta, como se refleja en el siguiente experimento.
Plantas de tabaco cultivadas como se describe en el protocolo y regadas con agua que contenga concentraciones de hierro diferentes (0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 mM) más de 7 días. Entonces las plantas fueron cosechadas, limpiadas y secadas durante 3 días a 80 ° C. Los siguientes pasos (es decir, del paso 2.3) del protocolo fueron seguidos como se describe. Ya que los frascos de control mostraron una variación de menos del 1% del peso de la ceniza, este valor no fue agregado a otros cálculos.
Concentración de hierro fue medido por FAAS. La tabla 1 muestra resultados representativos de estas medidas. Se utilizaron datos obtenidos de 21 muestras (7 concentraciones en 3 repeticiones) para generar una curva de calibración.
| Tratamiento (hierro mM en riego) | Planta | Concentración de hierro en solución de ácido clorhídrico (ppm) |
| 0 | A | 7.1 |
| 1 | B | 16.6 |
| 2 | C | 23.4 |
| 3 | D | 31.2 |
| 4 | F | 47.4 |
| 5 | G | 50.7 |
| 6 | H | 41.6 |
Tabla 1: Concentración de hierro en las soluciones de ceniza de tabaco hojas de plantas regadas con agua que contenga niveles diferentes de hierro.
La concentración de hierro en las cenizas de las muestras mencionadas 21 se calculó con los valores obtenidos por FAAS (ver nota en el paso 7). Los resultados mostraron que la concentración de hierro en el agua de riego afecta mucho contenido de hierro de hoja (figura 2).
Figura 2: efecto del hierro en el riego en la concentración de hierro en tabaco deja. Las barras representan la desviación estándar (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En un experimento preliminar (no mostrado), se midieron los espectros de absorbancia de las soluciones que contienen diferentes concentraciones de Fe2 + y Fe3 + y se obtuvo el pico mejor a 715 nm. Todos los espectros de las 21 muestras también probaron con el método de azul prusiano. Estaba claro que la absorbancia a 715 nm fue también la longitud de onda óptima aquí también (figura 3). Por consiguiente, en todos los experimentos se utilizó esta longitud de onda.
Fue trazada una curva de regresión lineal entre los valores de concentración de hierro obtenidos por FAAS y los valores de absorbancia (OD) obtenidos mediante el método azul prusiano de las muestras representadas en la figura 3 (figura 4). Se obtuvo la siguiente regresión: [Fe] = 0,32 + 25,3 x OD, r = 0.994 y R2= 0.988.
Figura 3: espectros de longitud de onda de absorbancia de las cenizas de tabaco mezclan con solución azul prusiano como se describe en el protocolo de. Los espectros de longitud de onda se dividen por la concentración de ceniza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: regresiones lineales de la concentración de Fe en ceniza de tabaco medición por FAAS y ligera absorbancia (OD, 715 nm) obtenidos por el método de azul de Prusia. Se obtuvo la siguiente regresión: [Fe] = 0,32 + 25,3 x OD, r = 0.994, R2= 0.988. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La regresión lineal obtenida puede utilizarse ahora para las nuevas muestras del mismo tipo de planta, como se indica en el paso 8.
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Discussion
Medición de hierro en los tejidos vegetales es muy importante para evaluar los efectos de riego u otras condiciones ambientales. Aquí, describimos un método colorimétrico fácil y preciso para la medición de contenido de Fe en hojas de tabaco, que puede ser fácilmente adaptado a otras especies de plantas y de los tejidos.
En la optimización de las condiciones para el método colorimétrico, utilizamos un medio de pH bajo (pH < 1.0) para permitir la solubilidad del hierro. El proceso de grabación fue realizado para liberar todas las formas de hierro y para asegurar que no hay contaminantes presentes en las muestras de modificar los resultados. En cuanto a contaminación por hierro, se debe tener en mente que 6,7% de la corteza terrestre se compone de óxido de hierro (FeOn) las especies21 y que sus concentraciones pueden llegar a 0.009% de peso seco de planta22. Por lo tanto, uno debe considerar el riesgo de contaminación, desde el polvo, que puede contener tanto como 3-7% de hierro (según la región)23, pueden afectar enormemente los resultados. También es imprescindible que revise cuidadosamente el contenido de hierro de todos los equipos utilizados en el experimento y a tomar todas las precauciones necesarias para evitar la contaminación. Se recomienda para limpiar todo el equipo que había estado en contacto con el aire o que es ser reutilizado en el experimento con solución de HCl 4%. El uso de herramientas metálicas, tales como tijeras o cucharas, debe evitar totalmente, en su lugar se sustituirán por las versiones de plástico o vidrio. Pasos críticos para evitar la contaminación de hierro se destacaron en los pasos 3.1 y 4.1, por ejemplo.
Pudiendo obtener una señal de una muestra puede ocurrir debido a los problemas que se presentan en diferentes pasos en el protocolo. En este caso, se recomienda comprobar los reactivos contra soluciones con una concentración conocida de hierro. Si los problemas persisten, debe estar preparado fresco reactivo azul prusiano. Debe la norma, sin embargo, muestran una señal, esto indica que la concentración de hierro en la muestra fue por debajo del umbral de detección y que la muestra debe ser más concentrada. Grandes variaciones entre los distintos recipientes podrían provenir de contaminación por hierro y requerirán el uso de las nuevas muestras.
Curvas de calibración deben generarse cada seis meses o cada vez que un nuevo lote del reactivo azul prusiano se utiliza. La curva de calibración inicial debe ser revalidada por medir el contenido de hierro en al menos 6 muestras y confirmar que la regresión es todavía exacta. En las curvas de calibración, es esencial para obtener los valores cerca de + 1 o -1 para r (coeficiente de correlación) y 1 para R2 (coeficiente de determinación)24,25,26. Mientras que una línea perfecta tendría un valor de2 R de 1, valores de2 R más sobre 0.95 son aceptables para las curvas de calibración.
Limitaciones del protocolo incluyen el hecho de que especies y diferentes tejidos pueden mostrar las curvas de correlación diferente utilizando los procedimientos descritos para la determinación de concentración de hierro. Por lo tanto, se recomienda realizar una prueba piloto para asegurar que la curva de correlación es exacta para un experimento dado. Para utilizar la curva de los resultados obtenidos, el valor de OD recién medido debe sustituirse en la fórmula Y = a + bX. En el presente caso, se utilizó la siguiente fórmula: [Fe] = 0,32 + 25,3 x OD.
Otra limitación surge de la necesidad de una cantidad bastante grande de tejido vegetal. Esto puede eludirse en cierta medida, adaptando el volumen de HCl utilizado para disolver las cenizas (ver paso 5.3) para obtener una señal adecuada. Sin embargo, el método descrito aquí es una buena opción si no hay equipo costoso, como el que usan para ICP-MS o acceso inmediato a la FAAS y numerosas muestras de la misma especie de planta deben ser analizadas.
Posibles aplicaciones adicionales del método Prusiano azul como un sistema de detección de hierro incluyen detección cuantitativa de hierro en cualquier material orgánico que puede ser traído a ceniza, así como en materia inorgánica, como suelos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Israel de ciencia, tecnología y espacios por una beca del jefe científico del Ministerio israelí de Agricultura (#16-16-0003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Hexacyanoferrate(II) | Fisher Chemical | 14459-95-1 | Reagent for the Pussian Blue |
| Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 μm | Millec | SLGP033RS | Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution |
| Scintillation Vials | Fisherbrand | 03-337-4 | Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure. |
| Disposable Syringe 10 ml | Medi-Plus | 1931 | Syringe used during the filtration |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 231-595-7 | Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials |
| Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN | Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab | Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407. | Tobacco cultivar used in this protocol |
| Glass Wool (Rock Wool) | Sigma-Aldrich | 659997-17-3 | Used in the procedure of burning samples in the furnace. |
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