Summary
比色のプルシアン ブルーを用いた植物組織の鉄含有量を測定するための簡潔かつ信頼できるプロトコルを提案します。
Abstract
鉄生体内で最も重要な栄養素の一つは、呼吸や光合成などの基本的なプロセスに関与しています。鉄の含有量は乾燥重量の約 0.009% に相当する植物で、すべての生物で幾分低いです。日付、火炎吸収原子分光学植物組織中の鉄濃度を測定する最も正確な方法の一つです。ただし、この方法は時間がかかり、高価な一般的植物研究所は、特定の機器が必要です。したがって、日常的に使用することができます簡単に、まだ正確な方法が必要です。比色のプルシアン ブルー メソッドは、動物や植物の組織切片の染色質の鉄の定期的に使用されます。本研究では、タバコ中の鉄の定量計測法の葉プルシアン ブルーを適応.原子分光学と同じ試料中の鉄の含有量を測定し、線形回帰を発見する染色プルシアン ブルーの両方を使用してこのメソッドの精度を検証しました (R2 = 0.988) 2 つのプロシージャの間。我々 はプルシアン ブルーの植物組織定量的鉄測定法は正確な単純な安価な結論します。しかし、ここで紹介する線形回帰はサンプルと試薬の潜在的な相互作用のための他の植物種のために適切かもしれない。回帰曲線の確立は別の植物種にしたがって必要です。
Introduction
鉄 (Fe) は、すべての生物に重要な微量栄養素です。植物の呼吸、光合成とクロロフィル生合成などの基本的なプロセスに関与のため必須微量栄養素1についてです。無料鉄多価イオンの高集積植物細胞酸化ストレスを引き起こすフリーラジカルのリリースにつながる反応のために有害です。植物細胞内鉄の恒常性を維持するために、イオンは液胞に格納され、フェリチン、鉄の恒常性2に直接関与するタンパク質ケージおよびすべての生きている有機体の鉄の主要な記憶域構造内で隔離。同時には、鉄欠乏性貧血は、植物鉄 biofortification の増加が必要で、その結果、人間の人口のかなりの割合を影響します。植物フェリチンのユニークな性質上、フェリチン鉄食品濃縮栄養失調3のこの問題を戦うために有望な戦略を提供しています。
鉄イオンは、主に 2 つ酸化状態、すなわち鉄 (2価 Fe2 +または鉄 (II))、鉄 (三価 Fe3 +または鉄 (III)) フォーム。鉄、鉄クラスター4などのいくつかの他の形態はまた細胞であります。Fe はセルと自然フォーム ヘマタイト (Fe2O3) と ferryhidrites 内の酸化鉄として格納されます ((Fe3 +)2O3•0.5 H2O)5生理学的な条件の下で。これらの反応は、特に鉄のフォームに形成された水酸化物非常に低い容解性があります。鉄保持は、pH 56上固体状態で主はその結果、溶液の pH によって影響を受けます。
溶解性が悪い、Fe の高反応性を考慮した植物組織や器官の間での転送が適切なキレート分子と関連付ける必要があります。また、鉄と鉄のフォーム1の間の酸化還元状態を制御する必要があります。葉、内鉄の約 80% は、電子伝達系、チトクローム、葉緑素と他のヘム分子の生合成に重要な役割はそのための光合成細胞で発見され、鉄 S の形成におけるクラスター7。セル内の余分な鉄の場合、黒字はフェリチン分子8金属が保存されている液胞に転流します。
鉄は、いくつかの方法、含む火炎原子吸収分光法9 (FAAS) または比色試金10, 前者は後者よりもはるかに正確な植物組織で測定できます。FAAS は、個々 の要素の電磁放射に基づくサンプルの元素組成を決定することができる精度の高い手法です。FAAS に変換します金属イオン原子状態のサンプルでは、炎加熱による特定イオンの基底状態に戻るときに特定の波長のイオン励起と放射に 。別のイオンからの排出量は、分光器で区切られ、吸収センサー11によって検出されました。したがって、FAAS は直接鉄濃度を定量化する提供しています。しかし、生体組織中の鉄を可視化するための他の手法が利用できます。誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS)12は、鉄などの微量要素を測定するための非常に正確な技術、機器、FAAS と ICP-MS の両方の不足が共通問題。その一方で、チオシアン酸測色13による鉄の測定は、精度を欠いている、サンプル間の小さな変化を検出する失敗します。プルシアン ブルー染色14,15,16,17は鉄フェロシアン化カリウム (K4Fe(CN)6) 生産、鉄イオンとの反応に基づく間接法、青い色の強い、動物や植物の組織の組織学的セクションで質的な鉄の検出に使用されます。
金属 (ゼロ原子価) 鉄は、リソスフェアのまれです。環境中の鉄の支配的な非複合イオンの形態は、ほとんど無酸素環境で比較的より豊富である鉄と鉄有酸素サイトの色合いが強い、周囲の酸素の量によって決まります。鉄酸化の原因となるエージェントはしばしば無酸素、酸性環境18で異なるが、この後者の形式、非常に酸性環境で支配的なも。4% で鉄を溶解するとき HCl (pH 0) 好気性環境で、希薄化後の鉄の主要な部分として存在する、鉄 (Fe3 +)19,20を形成します。
鉄イオンと K4Fe(CN)6の反応は次のとおりです。
Fe3 +: した FeCl3 + K4Fe(CN)6 KFe(III)Fe(II)(CN)6̄ + 3KCl =
Fe2 +: 2 K4Fe(CN)6 + 4 のした FeCl2 = 鉄4(Fe(CN)6)2 + 8 KCl
本研究で我々 はプルシアン ブルー染色することができますソリューションの鉄のレベルを測定するために役立つかどうか尋ねた。
当初は、水溶液中の Fe の濃度とプルシアン ブルー染色の相関関係を検証しました。水溶液中で (した FeCl2、した FeCl3または 2 つの 1:1 混合物) として Fe 濃度は、プルシアン ブルーの付加の後で原子分光法と吸光度 (OD) の両方を測定しました。図 1は、それぞれの方法によって得られる測定の線形回帰曲線を示しています。溶液中の鉄濃度の定量分析のためプルシアン ブルーのメソッドを使用できますと結論づけた。
図 1: FAAS と光の吸光度によって測定される Fe 濃度の線形回帰 (OD、715 nm) プルシアン ブルーによる得られた。青い正方形とラインは Fe2 +ソリューションを表す、赤い四角形と線 Fe3 +ソリューションおよび黒い正方形を表しライン Fe2 +と Fe3 +の間の 1:1 混合物。次の回帰が得られた: [Fe2 +] = 3 + 123 x 外径 r 0.996、R2 = = 0.989;[Fe3 +] = 1 + 292 x 外径 r = 0.999、R2 = 0.997;[Fe2 +/3 +] = 11 + 146 x 外径 r = 0.983、R2 = 0.956。Fe2 +ドナーした FeCl2 Fe3 +ドナーした FeCl3であった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
比色プルシアン ブルー植物組織の鉄の定量分析法を適応し、火炎吸収原子分光学とプルシアン ブルー染色によりタバコ葉灰の鉄含有量を測定しました。2 つの手法から結果の相関があった。
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Protocol
1. 植物材料と成長条件
- 5 cm × 5 cm ポット当たり種子 1 つタバコ (品種サムスン) は標準的なポットの中に満ちています。トレイにポットを置きます。23 ° C の一定温度で長い一日 (16/8 h/暗) 条件の下で成長部屋の植物を育てるポットから排水まで水道水で灌漑します。
- 50±5 日後、実験用に最適の濃度によると、灌漑で Fe 治療を開始します。たとえば、0 から 6 mm、可溶性鉄キレート剤 (Fe EDDHA) によって補われる鉄濃度の範囲を使いました。水を引く適切なソリューションが付いている植物 2 日毎 (脱水症状を避けるため) に 6-8 日の。
2. 鉄測定葉の準備
メモ: 使用するすべての材料がある必要があります鉄無料の鉄汚染.の危険性を減らすために4% 塩酸溶液で 2 回すりこぎをきれいにし乾燥ろ紙を使用する前にするたびに。任意の材料を再使用する場合二度 4% 塩酸溶液とそれをきれいにしろ紙を乾燥します。
- 手袋 (任意の金属の装置を使用して) を使用して、手で茎から葉をデタッチします。各サンプルの葉 (生体重) 約 10 g を使用します。スプレー ボトルを使用して二重蒸留水 (DDW) 各葉をきれいに。この手順は、鉄の汚染を防止することが重要です。
- ペーパー タオルの上葉を乾燥し、紙の袋に入れてください。80 ° C の一定温度でオーブンに 2 〜 3 日の紙バッグを転送します。
- 乾燥時、モルタルと乳棒と滅菌 15 mL プラスチック チューブに転送を用いた粉体に葉を粉砕します。
3. 燃焼灰の葉
ノート: HCl (0) に近い低 pH 溶液の使用は、鉄の溶解度を増すものです。岩綿は、ガスが燃焼中にバイアルを脱出することを防ぐために使用されます。
- その蓋なしの新しい、密封された 20 mL シンチレーション バイアルの重量を量る。値に注意してくださいまたはゼロ、風袋のボタンを使用して値を設定します。バイアルに砕いた乾燥葉 (サンプル) を追加します。
- サンプルとコンテナーの重量を量るし、値に注意してください。ロックウールでバイアルを閉じます。
- サンプルを追加することがなく 3 追加バイアルの重さし、その値に注意してください。これらのバイアルは、試料重量の増加につながっている可能性がありますロック ウールの量を評価するコントロールとして使用されます。
- 炉内サンプルとコントロールのバイアルに置き温度以下を使用して書き込みを開始: 部屋の温度、高速 4 時間増資 425 ° C、および、最終的に、425 ° C。この時点で、乾燥した葉は灰になっているでしょう。
- 約 100 ° C にダウン サンプルを冷ますがない、この温度湿度を避けるために次の 2 つの手順のため、以下は、サンプルの最終的な重量を影響するかもしれない。厚手の手袋を使用して、ピンセット、内方バイアルを保持炉からサンプルを削除します。
- バイアルを平らな面に配置、岩綿を削除し、元の蓋と瓶を閉じます。
- 3 コントロール バイアル (3.3 を参照) の重量を量るし、自分の平均体重を計算します。体重増加が等しい場合または上記灰重量の 1% に (手順 4.2 を参照)、測定誤差の推定値としてこの値を使用します。
4. 鉄測定の灰を準備
メモ: 初期サンプルの最終的な鉄濃度は塩酸の量で割った灰の重量として計算されます。
- 1 M 塩酸溶液を準備 (4 %hcl) (プラスチックまたはガラス フラスコ) の DDW の 87.5 ml 12.5 mL 37% 塩酸原液を追加することによって。
- 15 mL プラスチック チューブの重量を量ると値に注意してくださいまたは、風袋のボタンを使用してゼロ値に設定。遺灰を転送管、計量、そして値をメモします。これは、灰の重量です。
- 灰の中に 1 M 塩酸 5 mL を追加します。22 μ m フィルターをフィルターして灰と同じフィルターを使って 1 M HCl の追加 5 mL を追加します。
- 最終巻は 10 mL をする必要があります。フィルターにソリューションの一部が失われることに注意してください。
注: サンプルは、FAAS またはプルシアン ブルー法による Fe 測定する準備が整いました。 - Fe 濃度で検量線プルシアン ブルーによる原子吸光法によって測定する (図 4を参照) の各植物種。その後、単独でプルシアン ブルー法による Fe 濃度が測定できます。
5. FAAS により Fe 濃度の測定
- FAAS による測定の各サンプルから 4 mL を削除します。
- 灰の重さで FAAS 測定から得られた結果を分割します。(灰は 10 mL で溶いた) ので、0.01 で結果の値を分割します。結果の値はグラム灰 (ppm) ごとの鉄濃度です。
6. プルシアン ブルーの染色液の準備
- 4% を準備 K4Fe(CN)6を 100 mL DDW と渦の 4 g を追加することによってソリューションをプルシアン ブルー (他のボリュームおよび/または濃度使用できます別の要求)。本研究ではより少なく集中することプルシアン ブルーのソリューションよりも以前に報告された (20%)14が使用されたことに注意してください。
- 暗闇の中で使用されるまでの 4 ° C でのソリューションを保持します。ソリューションは、このような条件で保存する場合、6 ヶ月間安定です。
7. FAAS 結果を用いたプルシアン ブルーの較正曲線の生成
注: 次の式を使用して灰の鉄濃度を計算します。
式 1
C: 濃度、v: サンプル ボリューム w: 灰重量 (g) です。
- プルシアン ブルーのソリューション、1 M HCl の 0.50 mL 0.50 mL を混ぜます。これは、空のソリューションとなります。
- サンプルの 0.5 mL を混ぜる (4% 灰 HCl、セクション 3 で説明したよう)、ピペッティングによるプルシアン ブルー溶液 (ステップ 6.1) の 0.5 mL。しかし、最低 1 分間、5 分を待ちます。5 分後のサンプルで沈降が発生します。
- キュベットにミックスを転送し、715 で外径を測定分光光度計を用いた nm。値に注意してください。
- サンプルの灰重量 (ステップ 3.2) OD 値 (ステップ 7.3) を分割します。結果は、グラム灰あたり外径を表します。
- FAAS 測定 (Y 軸) と OD 値から得られる鉄濃度の線形回帰のプロット (X 軸) です。5.2 と 7.4 手順で取得した結果を使用します。回帰式は、Y を計算する =、+ bX、Y が鉄濃度、吸光度が交差する表します、b を表す吸光度斜面を表し X OD。
8. 同じ植物のタイプから他のサンプルの鉄のレベルを決定するためプルシアン ブルー メソッドを使用してください。
メモ: この種の植物に、検量線は既に確立されて、以来同じ植物のタイプから任意の新しいサンプルの鉄濃度直接計算できます線形回帰式を使用します。
- 3 と 4 の手順 7.1 7.4 に続いてのセクションで手順に従います。
- 線形回帰 (ステップ 7.5) から得られた式を使って、溶液中の鉄の濃度を計算します。
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Representative Results
このプロトコルは正しく実施される、1 つはプルシアン ブルーと原子分光法によって得られた結果と良好な相関性を得る必要があります。したがって、次の実験に反映は、植物試料中の鉄濃度の正確な測定を取得するプルシアン ブルーのメソッドを簡単に使用できます。
タバコがプロトコルに記載を栽培され、異なる鉄濃度を含む殺菌水で灌漑 (0、1、2、3、4、5、または 6 の mM) 7 日間。植物、収穫、洗浄、80 ° C で 3 日間の乾燥(すなわち、ステップ 2.3 から) プロトコルの次の手順は、説明されているように続いていた。コントロール バイアルは、灰の重量から 1% 未満の変動を示したので、この値がさらに計算に追加されませんでした。
鉄濃度は、FAAS により測定しました。表 1は、これらの測定の代表的な結果を示しています。(3 7 濃度がレプリケートされます) 21 サンプルから得られたデータは、較正曲線の生成に使用されました。
治療 (灌漑 mM 鉄) | 工場 | HCl 鉄濃度 (ppm) |
0 | A | 7.1 |
1 | B | 16.6 |
2 | C | 23.4 |
3 | D | 31.2 |
4 | F | 47.4 |
5 | G | 50.7 |
6 | H | 41.6 |
表 1: タバコの灰溶液中の鉄濃度の異なる鉄のレベルを含む殺菌水で灌漑の植物から葉します。
上記の 21 サンプルの灰の中に鉄の濃度は、FAAS (手順 7 でメモを参照) によって得られた値を使用して求めた。灌漑用水中の鉄濃度が大きく葉鉄含有量 (図 2) に影響を受けることがわかった。
図 2: 葉たばこの鉄濃度に灌漑でアイロンの影響。バーを表す標準偏差 (n = 3)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Fe2 +と Fe3 +の異なる濃度の溶液の吸光スペクトルを測定した予備実験 (図示せず)、および 715 で最良のピークが得られた nm。また、プルシアン ブルーによる 21 サンプルのすべてのスペクトルがテストされました。715 でその吸光度を明確だった nm は最適な波長でまたここにも (図 3)。したがって、この波長はすべての実験で使用されました。
線形回帰曲線は、FAAS によって得られた鉄濃度値と図 3 (図 4) で表されるサンプルのプルシアン ブルーのメソッドを用いて吸光度 (OD) 値のプロットしました。次の回帰が得られた: [Fe] = 0.32 + 25.3 x 外径、r = 0.994 と R2= 0.988。
図 3: 吸光度波長スペクトル タバコの灰を混ぜてプルシアン ブルー ソリューション プロトコルで説明されているようです。波長スペクトルは、灰の濃度によって分けられました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: FAAS と光の吸光度によって測定されるタバコの灰の Fe 濃度の線形回帰 (OD、715 nm) プルシアン ブルー法によって得られた。次の回帰を求めた: [Fe] = 0.32 + 25.3 x 外径 r = R20.994 0.988 を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
手順 8 で述べたように今同じ植物のタイプから新しいサンプルの得られた線形回帰を使用できます。
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Discussion
植物組織の鉄の測定は、灌漑や他の環境条件の影響を評価するために非常に重要です。ここでは、他の植物種や組織に容易に合わせることができるタバコ葉における Fe コンテンツ測定のための簡単で正確な比色定量法について述べる。
比色法のための条件を最適化する、鉄の溶解性を許可するように低 pH 媒体 (pH < 1.0) を使用しました。書き込み処理を行った鉄のすべてのフォームを解放し、汚染物質のサンプルで現在が結果を変更できません。については鉄汚染、1 つ留意すべき地球の地殻の 6.7% に酸化鉄 (FeOn) の種21が装備されていること、その濃度が植物の乾燥重量220.009% に達することができます。したがって、1 つは、ほこりは、できるだけ多くの 3 〜 7% (地域) によって鉄23、大きく結果に影響を与えることができますので、汚染のリスクを検討してください。また、実験で使用されるすべての装置の鉄含有量を慎重に確認し、汚染を避けるためにすべての必要な予防措置を取ることが不可欠です。空気と接触していたまたは 4% 塩酸水溶液の実験で再利用されていますがすべての装置をきれいにすることをお勧めします。はさみやスプーンなどあらゆる金属ツールを使用して避けるべきである完全、代わりにガラスまたはプラスチック バージョンに置き換えられます。鉄の汚染を避けるための重要なステップがたとえば手順 3.1 と 4.1 で強調表示されます。
サンプルから信号を取得する失敗は、プロトコルの各段階で発生する問題のため発生します。このインスタンスでは、知られている鉄濃度とソリューションに対して試薬をチェックすることをお勧めします。問題が解決しない場合新鮮なプルシアン ブルー試薬を準備する必要があります。標準では、ただし、シグナルを示す必要がありますこのサンプルの鉄濃度が検出しきい値を下回ることを示し、サンプルがより集中する必要があります。複製の間で大きな変動は鉄汚染から生じるし、新しいサンプルの使用が必要になります。
検量線は 6 ヶ月ごと生成が必要またはプルシアン ブルー試薬のバッチが使用されるたびに、新しい。初期校正曲線の少なくとも 6 試料中の鉄の含有量を測定し、線形回帰がまだ正しいことを確認して再検証。検、+1 や-1 r (相関係数) に近い、R2 (決定係数)24,25,26の 1 に近い値を得るために不可欠です。完璧なラインは、1 R2値を持っているだろう、0.95 以上 R2値のほとんどは、較正曲線の許容されます。
プロトコルの制限は、異なる植物細胞および種は鉄の集中の決定のため記載されている手順を使用して異なる相関曲線を表示ことがありますという事実があります。したがって、相関曲線が与えられた実験の正確なことを確認するためにパイロット テストを実行することをお勧めします。Y の数式で、得られた結果の曲線を使用する測定した OD 値が代入する必要があります =、+ bX。今回のケースでは、次の数式が使用された: [Fe] = 0.32 + 25.3 x OD。
別の制限は、植物組織のかなり大きい量の必要性から発生します。これは、適切な信号を取得するために (手順 5.3 参照) 灰を溶解する HCl ボリュームを適応することによりある程度回避できます。それにもかかわらず、ここで説明する方法は良いオプションです ICP-MS、FAAS 準備ができてアクセスの使用などの高価な装置はない利用可能なおよび/または同じ植物種のさまざまなサンプル、分析する場合。
鉄検出システムとしてプルシアン ブルーの方法の可能な追加アプリケーションは、灰をもたらすことができます任意の有機材料だけでなく土壌などの無機物質、定量的鉄検出機能を搭載します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、イスラエル農業 (#16-16-0003) 省の主任研究員からの助成金によってイスラエル省、科学、技術およびスペースによって支えられました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Potassium Hexacyanoferrate(II) | Fisher Chemical | 14459-95-1 | Reagent for the Pussian Blue |
Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 μm | Millec | SLGP033RS | Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution |
Scintillation Vials | Fisherbrand | 03-337-4 | Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure. |
Disposable Syringe 10 ml | Medi-Plus | 1931 | Syringe used during the filtration |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 231-595-7 | Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials |
Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN | Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab | Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407. | Tobacco cultivar used in this protocol |
Glass Wool (Rock Wool) | Sigma-Aldrich | 659997-17-3 | Used in the procedure of burning samples in the furnace. |
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