Summary
Здесь мы представляем протокол для описания разработки и проверки одной молекулы массив цифровых ИФА анализа, который позволяет ультра-чувствительных обнаружение всех подтипов ИФН α в образцах.
Abstract
Основной целью настоящего Протокола является описание разработки и проверки интерферон (ИФН)-α одной молекулы массив цифровых твердофазный Assay иммуносорбента (ELISA) анализа. Эта система позволяет количественная оценка человеческого ИФН α белка с беспрецедентной чувствительностью и нет перекрестной реактивности для других видов ИФН.
Первый ключевой шаг протокола является выбор пары антитела, следуют спряжение захвата антитела парамагнитных бусин и biotinylation обнаружения антител. После этого шага можно изменять различные параметры, такие как Пробирной конфигурации, детектор концентрации антител и состав буфера до достижения оптимальной чувствительности. Наконец специфика и воспроизводимости метода оцениваются для обеспечения уверенности в результатах. Здесь мы разработали assay массив одной молекуле ИФН α с пределом обнаружения 0,69 fg/мл, используя высокоспецифичные аутоантител, изолированы от пациентов с biallelic мутации белка аутоиммунных регулятор (Эр), вызывая аутоиммунных polyendocrinopathy синдром типа 1/аутоиммунных polyendocrinopathy кандидоз эктодермы дистрофия (APS1/APECED). Важно отметить, что эти антитела включено обнаружение всех 13 подтипам ИФН α.
Эта новая методология позволяет обнаружения и количественного определения белка ИФН α в человека биологических пробах в концентрациях, attomolar в первый раз. Такой инструмент будет весьма полезным в мониторинге уровня этого цитокина в здоровье и болезни государства, большинство особенно инфекции, аутоиммунные заболевания и autoinflammation.
Introduction
Тип я IFNs представляют собой семейство цитокинов, которые играют центральную роль в оркеструя противовирусное иммунных реакций. Они были впервые обнаружены Айзекс и Линденманн 60 лет назад,1,2 и это теперь известно что это гетерогенной семья полипептиды состоит из 14 различных подклассов (13 подтипам ИФН α и 1 IFN-β). Тип я IFNs важны для очистки вирусных инфекций, но также были вовлечены в патологии различных заболеваний человека государств, включая аутоиммунные расстройства системной красной волчанкой (СКВ), несовершеннолетних дерматомиозит (JDM), и тип Я interferonopathies в котором учредительный типа я ИФН индуцированной сигнализации приводит к патологии3,4,5,6,7.
Изучение типа ИФН белка уровнях в биологических образцах был сложным с ее первоначальной идентификации как «вмешательство вещество»1,2. В настоящее время сэндвич твердофазный Assay иммуносорбента (ELISA) является наиболее широко используемый метод для обнаружения ИФН α белка. Несмотря на то что конкретные, простой и быстрый, типа я ИФН ELISAs представляют важные ограничения, такие как Предельная чувствительность. Кроме того измерение всех подтипов ИФН α требует использования нескольких анализов с их собственный потенциал обнаружения и чувствительность. Хотя есть коммерческие ELISAs, которые обнаруживают различные подтипы ИФН-α, их чувствительность ограничен (1.95 пг/мл, 12,5 пг/мл и 12,5 пг/мл, соответственно) который часто является недостаточным для выявления белок Интерферон α в биологических образцах. Чтобы преодолеть это ограничение, несколько прокси биологических анализов были разработаны для количественного определения типа ИФН путем измерений индуцированных генных выражение или функциональную активность8,9,10,11, 12 , 13 , 14. Тем не менее, эти анализы не предоставляют прямого измерения ИФН α белка.
В этом исследовании одной молекулы массив цифровых ELISA технология была использована для разработки assay для обнаружения одного ИФН α белковых молекул. Цифровая ELISA использует же основной химии как обычные ELISA, однако, реакция происходит в массивах, состоящий из 50000 индивидуальных 46 размера femtoliter скважин15,16. Один белковых молекул захвачен антителами парамагнитных бусины и помечены биотинилированным обнаружения антител, а затем связывание фермента конъюгата, стрептавидина β-галактозидазы (SBG). Впоследствии бисер приостановлены с fluorogenic ферментов субстрат, resorufin-β-D-галактопиранозид (РГП), в одной молекула массивы. Уменьшая объем реакции 2 миллиарда раз17, высокая концентрация местных флуоресцентного сигнала достигается и одной молекулы рассчитывает стать возможным, поскольку каждая молекула генерирует сигнал, который теперь могут быть надежно измерены18. По существу массивы одной молекулы способны подсчета единого immunocomplexes и определяя среднее количество ферментов на шарик (AEB). Подсчет microwells, в котором обнаружен сигнал позволяет количественная оценка/цифровизации белковых молекул, как существует прямая корреляция между концентрацией белка и соотношение между immunocomplexed бисер и общее количество бусин, присутствующих в femtoliter размера камеры.
Юнг и др. провел исследование обширной оценки кросс платформенный, с использованием девяти различных технологий и четыре цитокина иммуноанализа с целью сравнения пробирного точность, чувствительность и корреляции данных через различные платформы19. Один из основных выводов этого исследования было, что одной молекулы массивы и одной молекулы, считая иммуноанализа представил высокая чувствительность для обнаружения цитокинов в сыворотке крови человека в диапазоне суб пг/мл, концентрация. Одной молекулы массив цифровых цитокина assays ELISA были использованы для изучения роли ФНО α и IL-6 в крона болезнь20, ИФН α в interferonopathy и 7аутоиммунное пациентам, и различные post-translationally изменение формы C-X-C мотив хемокиновых 10 (CXCL10) в хронический гепатит и здоровых доноров, получающих ситаглиптина21,22. Другие приложения включают в себя измерение родопсина у больных с диабетической ретинопатии23; исследование патологий мозга путем измерения сыворотки/плазмы neurofilament свет24 и амилоид β 1-42 пептид25в контексте рассеянного склероза и болезни Альцгеймера, соответственно. Одной молекулы массив анализов может использоваться также для улучшения возбудителя обнаружения таких характеристик ВИЧ вирусных водохранилище26, а также для обнаружения ДНК27 и микро РНК28. Основным преимуществом технологии одной молекулы массив является высокая универсальность, как assay против любого аналита интерес может быть разработан, при наличии пара специфическое антитело. Кроме того доморощенного наборы assay коммерчески доступных, позволяя развития новых анализов, протокол которого подробно описана в измененной форме ниже.
Здесь подробное описание шагов разработки и проверки для assay массив одной молекулы, результаты представлены в повышенной чувствительностью для обнаружения белок Интерферон α. Антитела для одной молекулы массив анализов должны быть весьма конкретными, избегая перекрестной реактивности с родственных белков (специфика видов, считается, если соответствующие). В идеале должны быть выбраны антитела с KD меньше, чем 10-9 M; высокое сродство обеспечивает прочное связывание с производством выше сигнала. Кинетика антитело антиген-связывая также являются важными и быстро Kна и медленным Kот будет пользу Ассамблеи комплекс антиген антитело. Начиная с антителом пару, которая имеет хорошую производительность в классической ИФА, с пределом обнаружения (LOD) 1-100 пг/мл, увеличивает шансы получения пробирного массив высокочувствительный одной молекулы. Чанг и коллеги выполнены детальные кинетические исследования биомолекулярного взаимодействия, происходящие в каждый шаг, предлагая набор уравнений, чтобы предсказать Аналитическая чувствительность18. Они показали, что одной молекулы массива цифровой ELISA, как представляется, быть эффективным в широком диапазоне сродства антител (KD ~ 10−11 - 10−9 М), а также что сигнал поколения больше зависит на стоимость таких антител.
Чтобы использовать высокое сродство антитела, мы воспользовались антител изолированы от больных с синдромом аутоиммунных polyendocrinopathy типа 1/аутоиммунных polyendocrinopathy кандидоз эктодермы дистрофия (APS1/APECED)29. По причинам, которые пока еще не поняты значительное большинство лиц, Эр недостаточным разработать основной набор высокого алчность антител против всех ИФН α подтипы29, и мы выбрали два клона антитела анти ИФН α дополнительные привязки работоспособностью для разных подтипов ИФН α, по оценкам IC50 значений. Сочетание этих уникальных высокоспецифичных антител с одной молекулы массив технологии позволили прямой количественной оценке ИФН α в концентрации attomolar (fg/мл). Такие сверхчувствительная Обнаружение белка ИФН α будет способствовать более глубокому пониманию природы, регулирование и биологического воздействия ИФН индуцированной ответа в настройках различных заболеваний.
Protocol
1. Выбор антител
- Перед началом протокол обзор всех ключевых шагов (Таблица 1) и выберите оптимальный антител.
Примечание: Для этого протокола были отобраны высокое сродство антитела анти ИФН α - IC50 которого описаны в таблице 2 . Преференциально выберите пару, которая хорошо работает с обычными ELISA.
2. спряжение захвата антитела к парамагнитных бусы и тестирование различных концентраций
Примечание: Всегда держите шарик спряжение буфера (BCB) и шарик мыть буфера (BWB) на льду во время процесса конъюгации антитела.
-
Захват антитела буфера обмена
- Возьмите первоначального количества антител анти ИФН α A проверить 3 различных шарик спряжения соотношения (0,038 мг/мл, 0,075 мг/мл и 0,3 мг/мл).
Примечание: Низкая антитела покрытие концентрации может быть полезным, если assay представляет высокий фоновый сигнал. Первоначальный антитела количество следует составляют примерно 30% потерь во время процесса буфера обмена. Согласно инструкции производителя для того, чтобы уменьшить начальный фон, концентрации 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл и 0,3 мг/мл были протестированы и, хотя эти точные значения часто не были получены вследствие вышеупомянутых переменных потерь в буфере процесс обмена. - Добавьте необходимое количество антител в столбец Фильтр вместе с БКБ, до 500 мкл.
- Центрифуга для столбцов в > 10 000 x g 5 мин и отмены потока через.
- Промойте колонку дважды добавляя объем 450 мкл BCB, последующим центрифугированием в > 10 000 x g 5 мин и отбросить через поток.
- Установите фильтр столбец, содержащий антитела в чистой microcentrifuge трубку вниз - открытой частью столбца перед внутри новой трубки - и центрифуги на 800 x г за 1 мин.
Примечание: Этот шаг позволит коллекции очищенных антител. Для этого шага требуется без добавления буфера. - Вымойте мембраны с 50 мкл BCB и центрифуги на 800 x г за 1 мин как 2.1.5.
- Измерьте концентрации антитела, используя спектрофотометр низкой громкости.
- Добавление BCB для достижения желаемого антитела концентрацию и внимание окончательный объем.
Примечание: Объем 200 мкл будет использоваться для описания остальной части протокола, этот объем, именуются 2 тома (2В). Все следующие объемы реагентов будет соответствующим образом адаптировать. - Вортекс и держать на льду.
- Возьмите первоначального количества антител анти ИФН α A проверить 3 различных шарик спряжения соотношения (0,038 мг/мл, 0,075 мг/мл и 0,3 мг/мл).
-
Подготовка парамагнитных шарик
- Бусины8 передача 2.8 x 10 (100 мкл = 1V) в трубку отцентрифугировать.
Примечание: Объем бусины зависит окончательный объем полученных в 2.1.8. - Импульсный счетчик и положить в магнитный сепаратор за 1 мин, отказаться от растворителя и удалить из магнита.
- Добавить 2V BWB и вихревые для 5 s.
- Повторите 2.2.2 и 2.2.3 два раза с BWB и еще два раза с БКБ.
- 1В бисера добавить 190 мкл BCB, вихрь 5 s, пульс спина и хранить промывают бусы на льду.
- Бусины8 передача 2.8 x 10 (100 мкл = 1V) в трубку отцентрифугировать.
-
Шарик активации
- Добавьте 1 мл холодного BCB 10-мг флакон 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Карбодиимиды гидрохлорид (EDC) и вихревой до тех пор, пока решение однородной.
- Для 1В бисера мкл 10 холодной разбавленной EDC промывают бусы, вихрь, и держать в шейкере на 1000 об/мин за 30 мин при комнатной температуре.
Примечание: Подготовка EDC и дополнение к бисеру должно быть сделано как быстро, как можно из-за нестабильности EDC в водных растворах. Кроме того как EDC Высокореактивная, важно иметь однородной бусины подвеска перед добавлением EDC во избежание разнородные бусины активации. После добавления EDC бусины должны храниться в суспензии.
-
Шарик спряжение антитела
- Вортекс и пульс спина активированные бусины. Теперь положите бисер в магнитный сепаратор для 1 мин, отказаться от БКБ супернатанта и извлеките трубку от магнита.
- Вымойте бусины с 2V БКБ. Вортекс, импульсный счетчик и положить в магнитный сепаратор за 1 мин. Затем отменить BCB буфера и удалить бусы из магнита.
- Быстро Добавьте холодной, буфер обмена 200 мкл (2В) антител в активированных бусины.
- Вортекс и держать 2 h в шейкер при комнатной температуре.
-
Шарик блокировки и окончательной очистки
- Пульс спин антителами бусины подвеска, положить в магнитный сепаратор за 1 мин, супернатанта передать новой трубки и измерить концентрацию с низким объемом спектрофотометр.
Примечание: Этот шаг даст информацию о ли насыщенных бисер - любые значения выше нуля будет указано шарик насыщенность - как обнаружение растворимые антител невозможно подшить к бисеру будет поддаваться измерению. - Удаление конъюгированных бусы из магнита, добавить 2V BWB, вихрь 5 s, пульс спина и положить в магнитный сепаратор за 1 мин.
- Передача супернатант новой трубки и измерять концентрацию, используя спектрофотометр низкой громкости.
Примечание: Этот шаг представит информацию о ли антитела стабильно фиксируются в бисер. Концентрация обнаруживаемых антител в этом супернатант укажет отряд антитела из бисера, который происходит регулярно. Этот assay часто работает, даже когда очень небольшое количество антител захвата остаются прикрепленными к бисер. - Удаление конъюгированных бусы из магнита, добавить 2V BWB, вихрь 5 s, пульс спина и положить в магнитный сепаратор за 1 мин.
- Удаление конъюгированных бусы из магнита, добавить 2V шарик блокирование буфера, вихревые для 5 s и инкубировать в шейкер для 30 мин при комнатной температуре.
- Мыть антителами и заблокированных бисер 3 x с 2V, один раз с BWS и 2 x с шарик разбавителя буфера (отменить все supernatants).
- Магазин с покрытием и заблокированных бусы на 4° C до использования с 2V шарик разбавителя буфера.
Примечание: Перед использованием, бусины должны мыть раз детектор/образец разбавителя с помощью объемом 250 x шарик тома/20, с помощью магнитного сепаратора.
- Пульс спин антителами бусины подвеска, положить в магнитный сепаратор за 1 мин, супернатанта передать новой трубки и измерить концентрацию с низким объемом спектрофотометр.
3. Обнаружение антител Biotinylation
-
Обнаружение антител буфера обмена
- Возьмите 260 мкг двух клонов Ab анти ИФН α.
Примечание: Это принимает во внимание потери 30% во время буфера обмена и позволяет тестирование соотношения двух различных биотина/антитела. - Действовать как 2.1, используя буфер реакции Biotinylation (руб) вместо БКБ.
- Измерения объема и концентрации антител и отрегулировать громкость чтобы получить окончательное концентрации 1 мг/мл.
Примечание: Это предложил начальной концентрации, но он может быть оптимизирована, если проба не достичь требуемых чувствительность.
- Возьмите 260 мкг двух клонов Ab анти ИФН α.
-
Обнаружение антител Biotinylation
- Принесите N-оксисукцинимидного полиэтилен glycol4-биотин (ГСЗ-PEG4-биотин) до комнатной температуры и Ресуспензируйте с в общей сложности 400 мкл дистиллированной воды для достижения 3.4 mM концентрации.
- Определить коэффициент биотина: антитела для тестирования и смешивать обнаружения антител и разбавленных биотина соответственно (60: 1 коэффициент равен 100 мкл обнаружения антител и 4,5 мкл биотина).
Примечание: Чтобы начать, проверьте коэффициенты сжатие 30: 1 и 60: 1. - Вихревой антитела биотин микс, пульс спин и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.
Примечание: Не нужно встряхнуть.
-
Очищение антитела биотинилированным обнаружения
- Передать новый фильтр биотинилированным антитела и действовать как 2.1, 3 выполнении Стиральная с BRB (400, 450 и 450 мкл) и окончательное коллекции.
- Измерения объема и концентрации очищенный, биотинилированным обнаружения антител и хранить при 4 ° C до использования.
4. assay оптимизация
Примечание: Использование программного обеспечения анализатор массив одной молекулы в доморощенного конфигурации30.
Одной молекулы массив анализатор машина контролируется программное обеспечение, которое позволяет запускать пробирного стандартизации, для выполнения образца количественной, чтобы изменить внешние параметры (шарик, детектор, SBG, РГП концентрации; пример разведений...) и внутреннего Параметры (количество шагов инкубации раз...) для достижения оптимального анализа условий и может также использоваться для вычисления результатов (фон, Лод, количества). Для установки анализатора одной молекулы массива и для расчета объемов реагентов, необходимых для каждого раунда оптимизации ознакомьтесь с инструкциями производителя. Выполнение первых раундов оптимизации с помощью 2-шаг конфигурации.
- Тестировать комбинации захвата конъюгированных антител бусины и биотинилированным обнаружения антител в обеих конфигурациях.
- Тестировать комбинации трех различных анти ИФН α A захват концентрации антител с двух различных анти ИФН α коэффициент B biotinylation как обнаружения и захвата антител и вице-наоборот (рис. 1), выбор надлежащих условий в анализатор программного обеспечения.
- Выберите наиболее чувствительных комбинацию, то есть условия, которые предлагают низкие LOD, и использовать его для дальнейших шагов
Примечание: На рисунке 1 показано как 0.3 мг/мл анти ИФН α бусина концентрации антитела и биотина: антитела соотношение сжатие 30: 1 с B антитела анти ИФН α привели к высокой чувствительности, что подтверждается Лод 11.6 fg/мл. (См. Дополнительная таблица 1). Эта комбинация будет использоваться для всех будущих шагов. Обратите внимание, что большой чувствительностью достичь с этой конкретной assay перед любой раундов оптимизации.
Рисунок 1: выбор ориентации антитела, захватить концентрация антитела на бусы и соотношение biotinylation. Были протестированы две различные конфигурации, с использованием анти ИФН α A как захват антитела и анти ИФН α B как обнаружение антител (A) и вице-обратно (B). IFNα - 2c был использован как антиген. Для обеих конфигураций также испытывались различные захвата концентрации антитела, а также соотношения биотина: антитела (B:A). Пунктирная линия показывает Лод лучшие условия; анти ИФН α 0.3 мг/мл, как захват и анти ИФН α B биотина: детектор антитела в соотношении 30 (уд = 11,6 мг/мл, соответствующий значению AEB 0.017265). 2-шаг конфигурации был использован. Биотин: антитела (B:A). пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Сравните 2 против 3-шаг конфигурации.
Примечание: В конфигурации 3-шаг, есть три различных инкубации шаги, один с захвата антитела, один с обнаружения антител и окончательный третий один для маркировки SBG фермента. Однако, в конфигурации с 2-х ступенчатый, захват и обнаружения антител одновременно инкубируют с аналита интерес.- Запустите анализатор массив одной молекулы с захвата и детектор концентрация антител и соотношения от 4.1.2, выбрав 2 и 3-шаг конфигурации, предварительно настроен в анализатор, следующие производителя инструкции по30.
- Выберите конфигурацию, которая позволяет для высокой чувствительности и сохраните его для будущих шагов
Примечание: Как показано на рисунке 2 и Дополнительная таблица 2, 2-шаг конфигурации дал несколько выше чувствительность и соотношение сигнал/фон для каждого испытания концентрации. Таким образом конфигурация 2-шаг был сохранен будущих шагов.
Сравнение 3-шаг конфигурации и рисунок 2:2. 2 и 3-шаг конфигурации были оценены с использованием 0.3 мг/мл анти ИФН-α антитела как захват и анти ИФН α B как обнаружение антител в соотношении 30 биотин: антитела. IFNα - 2c был использован как антиген. В 3-х ступенчатая условие обстановке, есть три различных инкубации шаги, один с захвата антитела, один с обнаружения антител и окончательный третий один для маркировки SBG фермента. Однако, в конфигурации с 2-х ступенчатый, захват и обнаружения антител одновременно инкубируют с аналита интерес. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Детектор антитела и SBG концентрации оптимизация
- Тест три разные концентрации антител (0,1, 0,3 и 0,6 мкг/мл) детектор вместе с трех различных концентраций SBG (50, 150 и 250 м) как описано выше30.
- Выберите концентрации, которые дает высокая чувствительность и сохранить их для будущих шагов.
Примечание: На рисунке 3 показано что детектор 0,3 мкг/мл и SBG 150 вечера были условия, которые показали оптимального Лод. Эти условия также дал низких фоновых уровнях и средние амплитуды, поведение, которое производит хорошее стандартное отклонение (SD) значения (Дополнительная таблица 3). Типичные концентрации колеблется в пределах 0,1 - 1 мкг/мл для обнаружения антител и 50-200 вечера для SBG, хотя более высокие концентрации (например до 300 м) последнего могут потребоваться. Важно избежать условий, которые будут отображать стола выше чем 0.02 АЕБ. Повышение концентрации детектор моноклональных антител (МАБ) или SBG повысит сигнал ответа и фона. Однако если приращения в сигнал обходит изменения в фоновом режиме, улучшит Лод. Может возникнуть ситуация, в которой уменьшение в фоновом режиме позволяет лучше дискриминации между низким калибраторы.
Рисунок 3: оптимизация концентрации детектор и SBG. Три различных концентраций биотинилированным детектор антитела (0,1, 0,3 и 0,6 мкг/мл) вместе с трех различных концентраций SBG (50, 150 и 250 м) были оценены. Пунктирная линия показывает Лод лучшие условия; детектор антитела на 0,3 мг/мл и SBG 150 вечера (уд = 0,09 мг/мл, соответствующий значению AEB 0.017184). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Дополнительная оптимизация шаги
- Если требуется чувствительность достигнуто не было, проверьте различные инкубации раз для различных шагов, используя предварительно настроенные параметры в анализатор программного обеспечения.
- Если проба не достаточно чувствительность, Оптимизируйте количество бисера в assay, используя предварительно настроенные параметры в анализатор программного обеспечения.
Примечание: После начала испытаний биологических проб, объем образца является дополнительным параметром восприимчивы к оптимизации. Убедитесь, что образцы обрабатываются в порядке охраны здоровья и безопасности.
5. анализ специфики и воспроизводимость
- Испытания ИФН α пробирного специфичности, путем проверки пробы с различные подтипы ИФН α и других родственных белков (рис. 4a и 4b).
Рисунок 4: специфичность и чувствительность оптимизированный assay массив одной молекулы IFNα. (A) IFN-β IFN-λ1, ИФН λ2, ИФН ω и ИФН γ рекомбинантных белков были протестированы, а также (B) 16 подтип ИФН α, в том числе три типа ИФН α2 (ИФН α2a, ИФН α2b и ИФН α2c). Адаптировано из Rodero и др. 2017. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Оценки воспроизводимости оптимизированный assay, выполняя три независимых реплицировать эксперименты и оценки изменчивости между анализами (рис. 5).
- Вычислить Лод assay
Примечание: Лод была рассчитана с использованием среднего трех заготовок + 3 стандартных отклонений (SD), таким образом получение значения 0.23 fg/мл. Как фактор разведения стандартного образца составляет 1:3, включение коэффициент разрежения дает Лод 0,69 fg/мл.
Рисунок 5: воспроизводимость анализа массива оптимизированный Пан ИФН α одной молекулы. Три независимых запусков были проведены с использованием двух разных много бисера. Для второй партии были проведены две независимые эксперименты. Каждое измерение была приобретена в дубликаты. Пунктирная линия представляет LOD, определяется среднее пустой средняя фермента в шарик + SD всех трасс. ИФН α17 был использован в качестве ссылки, принимая во внимание, что производные калибровочной кривой является представителем всех других подтип ИФН α, как показано на рисунке 4В. Диаграмма показывает среднее значение и SD (планки погрешностей). Пунктирные линии показывают Лод для различных запусков; Запуск 1: 0,073 fg/мл АЕБ = 0.006238, запустить 2: 0,113 fg/мл АЕБ = 0.007119, запустить 3: 0,043 fg/мл АЕБ = 0.05518). Адаптировано из Rodero и др. 2017. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
6. белка конкуренции Assay
- Выполните конкуренции assay протеина (описанные в легенде рис. 6 ) для дальнейшей демонстрации специфика assay.
Примечание: Образцы плазмы от больных СКВ (n = 5) были использованы.- Когда вирусы подозреваются в биологическом образце, подготовьте инактивации буфера путем добавления 200 мкл non-ioinic ПАВ (0,5% nonidet P40 замену) 40 мл разбавителя детектор/образец и вихрь энергично.
- Центрифуга биологические образцы, содержащие аналита интерес на 10000 g 15 мин при температуре 4 ° C для удаления сотовой мусора.
- Mix 185 мкл детектор/разбавителем или инактивации буфер образца с 100 мкл биологической пробы (фактор 3 окончательного растворения) и 15 мкл антител анти ИФН α A (первоначальный концентрации 1 мг/мл, конечная концентрация 50 мкг/мл) или буфера. Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.
- Запуск образцов с и без антител анти ИФН α в анализатор массив одной молекулы, как описано выше.
Примечание: В случае насыщение сигнала, образцы должны быть дополнительно разрежается. Кроме того 300 мкл является объем, необходимый для повторяющихся анализа.
Рисунок 6: assay протеина конкуренции. Соревнования были эксперименты с использованием образцов из пяти разных больных СКВ. Биологические образцы были центрифугируют в 10.000 g 15 мин при 4 ° C. Они были разбавлены 1/3 с разбавителя детектор/образец, содержащий NP40 для вирусной инактивации. 15µl антитела анти ИФН α A (первоначальный концентрации 1 мг/мл, конечная концентрация 50 мкг/мл) или буфера были добавлены к общим объемом 300 мкл. инкубации была выполнена при комнатной температуре за 30 мин контрольной группы отображается в сером и образцы относились с анти ИФН α A антитела являются показаны чёрным. График показывает среднее значение и SD (планки погрешностей). Пунктирная линия обозначает Лод (АЕБ = 0.024774, 0.8037 fg/мл). Адаптировано из Rodero et al. 2017 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Representative Results
Таким образом массив пробирного Пан ИФН α одной молекулы с пределом обнаружения 0,69 fg/мл, с использованием 2-шаг конфигурации с бисером захвата покрытием с 0.3 мг/мл анти ИФН-α антитела и анти ИФН α B обнаружения антител биотинилированным в соотношении биотина: антитела 30 был разработан. Используется для обнаружения антител биотинилированным и SBG концентрации были 0,3 мкг/мл и 150 часов, соответственно. Это весьма специфический assay способен обнаруживать все 13 подтипам ИФН α и крест не реагируют с другим типом IFNs. Таким образом хотя это не возможно для идентификации и количественной оценки каждого индивидуального вида ИФН α, все из них могут быть обнаружены и измеряется вместе давая Общая концентрация значение для ИФН α, которая состоит из 13 различных подклассов.
Чтобы исследовать потенциальные диагностические значение Этот недавно разработанный assay, ИФН α белка в плазме крови и сыворотки от здоровых лиц были измеряется и сравнивается с образцами от пациентов, страдающих от СКВ и JDM. Как показано на рисунке 7, высокий уровень белка ИФН α были обнаружены в обеих когортах болезни по сравнению с здорового контроля. Пунктирная линия показывает Лод обычными коммерчески доступных ELISA, иллюстрирующие, как этот подход не будет обнаруживать белок Интерферон α в этих групп пациентов, несмотря на известные ассоциации этого цитокина с этими фенотипов. Кроме того ИФН α может быть количественно над 5 журналы величины, иллюстрирующих широкий динамический диапазон assay, с обнаружению уровней между 1-10 fg/мл подтверждающие весьма деликатный характер assay.
Рисунок 7: количественная оценка ИФН α белка в плазме крови и сыворотки от пациента когорт. Этот рисунок был изменен с Rodero и др. 2017. плазмы, от здоровых элементов (n = 20) и пациентов, страдающих от СКВ (n = 72) и JDM (n = 43) были протестированы с Пан IFNα одной молекулы массив assay. Анализ проводился с помощью односторонней теста ANOVA (Крускала-Уоллиса) и Данн множественные сравнения тестирование между группами. Медиана изображен. Пунктирная линия показывает Лод ELISA ссылку по анти ИФН α (1.95 пг/мл = 1950 fg/мл). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Шаг | Соображений | Ссылка |
| 1. антитела пара выбор | Цель различных эпитопов | Таблица 2 |
| Высокое сродство | ||
| Быстро Kна / медленно Kвыкл | ||
| 2. антитела пара ориентации | Выбор условий с низким предел обнаружения | Рисунок 1 |
| 3. захват концентрация антител | ||
| 4. биотина: детектор антитела соотношение | ||
| 5. 2-3-шаг настройки | Выберите условие с высоким соотношением сигнал: фон | Рисунок 2 |
| 6. детектор концентрация антител | Выбор условий с низким предел обнаружения | Рисунок 3 |
| 7. SBG концентрация | ||
| 8. Специфика | Оценить перекрестной реактивности | Рисунок 4 |
| 9. чувствительность | Оценить признание подтипы (если применимо) | |
| 10. воспроизводимость | Оценка изменчивости пробирного | Рисунок 5 |
Таблица 1: резюме шаги для разработки и оптимизации одной молекулы массив пробирного. В следующей таблице перечислены различные шаги, необходимые для разработки и оптимизации анализа массива одной молекулы, от первоначального выбора пары антитела до оценки воспроизводимости.
| Антиген | 8H 1 (A) | 12H 5 (B) | Sifalimumab | Rontalizumab |
| IFNΑ1 | 28.3 | 51,3 | 460 | 22.63 |
| IFNΑ2 | 2563 | 10.7 | 9.02 | 2.15 |
| IFNΑ4 | 5.11 | 2,99 | 35.35 | 325.3 |
| IFNΑ5 | 2.01 | 19.6 | 93.29 | 2.49 |
| IFNΑ6 | 64,7 | 3.03 | 4.97 | - |
| IFNΑ7 | 0.9 | 0,63 | 233.1 | - |
| IFNΑ8 | 302 | 0,83 | 691 | 10.86 |
| IFNΑ10 | 2.54 | 0.71 | 43,2 | - |
| IFNΑ14 | 3224 | 2.1 | 14.52 | 0.9 |
| IFNΑ16 | 1.83 | 32.99 | 59.18 | 28.65 |
| IFNΑ17 | 2.21 | 0,77 | 890.9 | 23,86 |
| IFNΑ21 | 2.78 | 12.87 | 1769 | 5.8 |
Таблица 2: выбор антитела Pan альфа. IC50 (нг/мл) определяется с помощью элемента интерферона стимулирует реакции (ISRE)-Люцифераза нейтрализации assay. Таблица показывает значения IC50 mAbs, используемых в одной молекулы массив assay для всех подтипов ИФН α. 10 000 ГЭС 293 MSR клетки были посеяны в белая половина площадь 96-луночных пластины и реверс transfected с 50 нг смешиванием ISRE-Светлячок Люцифераза репортер и Renilla Люцифераза конструкций с помощью трансфекции реагентов в соответствии с инструкциями производителя. Выражая Люцифераза конструкции служил как элемент внутренней нормализации. Клетки инкубировали на ночь в сокращение сыворотке среднего дополнена 0,1 мм заменимые аминокислоты, пируват натрия 1 мм, 0,5% плода бычьим сывороточным при 37 ° C, 5% CO2 в атмосфере увлажненные. После ночи инкубации клетки были стимулируется за 24 ч с среднего, содержащие смеси рекомбинантного человеческого ИФН α с или без анти ИФН α mAbs или управления IgG, которые были преинкубации за 1 ч при 37 ° C. После 24 ч стимуляции двойной Люцифераза репортер анализов были исполнены в соответствии с инструкциями производителя. «-» Не определен. Sifalimumab является полностью человеком, иммуноглобулина G1 κ моноклональное антитело, которое связывается и нейтрализует большинство подтипов ИФН α; Rontalizumab это гуманизированные моноклональные антитела против ИФН α. Адаптировано из Meyer et al. 2016 и Rodero и др. 2017.
Дополнительная таблица 1: выбор ориентации антитела, захватить концентрация антитела на бусы и соотношение biotinylation. Были протестированы две различные конфигурации, с использованием анти ИФН α A как захват антитела и анти ИФН α B как обнаружение антител (A) и вице-обратно (B). IFNα - 2c был использован как антиген. Для обеих конфигураций также испытывались различные захвата концентрации антитела, а также соотношения биотина: антитела (B:A). Насыщенность (сб). Оранжевый: АЕБ значения, которые использовались для расчета LOD; Эти концентрации были рассмотрены пустых значений АЕБ, оставался стабильным. LOD была рассчитана как означает чистый + 3SD. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 2: испытание конфигурации 3-шаг 2 против. 2 и 3 - шаг конфигурации были оценены с помощью IFNα - 2c как антиген. АЕБ также как сигнал/фон пайки (S/B) приведены значения для обоих условий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 3: оптимизация концентрации детектор и SBG. Три различных концентраций биотинилированным детектор антитела (0,1, 0,3 и 0,6 мкг/мл) вместе с трех различных концентраций SBG (50, 150 и 250 м) были оценены. АЕБ значения приведены для девяти проверенных условий. Оранжевый: АЕБ значения, которые использовались для расчета LOD; Эти концентрации были рассмотрены пустых значений АЕБ, оставался стабильным. LOD была рассчитана как означает чистый + 3SD. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 4: специфичность и чувствительность оптимизированный assay массив одной молекулы IFNα. Средняя фермента за бусы значения отображаются, когда IFN-β IFN-λ1, ИФН λ2, ИФН ω и ИФН γ рекомбинантных белков были протестированы (A), вместе с 16 подтип ИФН α (B). «-» Не определен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 5: воспроизводимость оптимизированный assay массив одной молекулы IFNα. Средние значения АЕБ для всех трех независимых работает показаны к концентрации 10.000 fg/мл. «-» Не определен. Насыщенность (сб). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 6: assay протеина конкуренции. Средняя фермента за бусы значения отображаются для всех условий испытания. Измерения проводились в двух экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Здесь мы описали, разработки и проверки цифровой массив ELISA высокую воспроизводимость, сверхчувствительная одной молекулы для прямого количественного определения белка ИФН α в образцах (шаги приведены в таблице 1). Одним из важнейших шагов в развитии assay является выбор антитела пара16, с характеристиками с точки зрения кинетики и epitope привязки является ключом к успешной assay. Важно избежать использования парных моноклональных антител, предназначенных же эпитоп или которые вызывают их пространственной препятствием. Поликлональные антитела могут использоваться как обнаружение антител для преодоления таких ограничений. Если на любом этапе не будет достигнуто желаемого чувствительность, следует рассмотреть дальнейшие возможности оптимизации. Это может включать использование альтернативных антитела пар, изменения в параметры, такие как тип протеина (например BSA < казеина), рН (6.0-8,5), ионной силы, буферной емкости (например, концентрации NaCl и фосфат), перевозчик бусы или присутствии ПАВ. Широкий спектр параметров con оптимизирован при разработке пробирного массив одной молекулы. Однако, в целом, условия, которые дают высокий сигнал: фон коэффициенты и минимальным LODs являются те предпочитали (см. рис. 1, рис. 2и рис. 3).
Что касается специфики, ИФН α assay показал, нет перекрестной реактивности для любых других IFNs испытания (β, γ, λ1, λ2, ω) (рис. 4a) и был способен обнаруживать все подтипы 13 ИФН α (рис. 4В). Однако assay показан ниже сродство для подтипа ИФН α2, (рис. 4b и Дополнительная таблица 4). Интересно, что разные чувствительности для различных классов ИФН α2 (a, b, c) также наблюдались, которые могут быть из-за различных производственных процедур или различных аминокислот, как подтип ИФН α2 были получены из различных коммерческих поставщиков. С этим единственным исключением все виды ИФН α дал очень похожи ответы. Специфика assay далее подтверждается предварительной обработки образцов с анти ИФН α клона, который отменил сигнал (рис. 6 и Дополнительная таблица 6).
Одним из главных преимуществ этой технологии является, что любой аналита интерес может быть целевой16. Кроме того могут быть проверены различные биологические образцы, такие как сыворотка, плазма, спинномозговой жидкости, сотовой лизатов, supernatants культуры31 и даже дыхание32. Обычно 1:3 Разведение плазмы производится во избежание потенциальных засорения анализатор массив одной молекулы. Однако аналита интерес может присутствовать при очень низких концентрациях в соответствующих биологических образцов и более высокие концентрации образца может быть необходимо (в зависимости от анализа чувствительности)33. Хотя существует потенциал для мультиплексирования при сохранении хорошей чувствительностью34, это более сложный процесс и анализов для измерения более чем 6 белков внутри те же эксперименты должны еще быть развитых35.
Способность выявлять и количественно цитокинов и другие биологические соответствующих белков при таких низких концентрациях открывает совершенно новый спектр приложений33,36. Хорошо известно, что многие белки оказывать свое действие даже при очень низких концентрациях, которые до сих пор были ниже предела обнаружения лучших ELISAs37. В то время как другие иммуноанализа технологии предлагают преимущества перед обычными ELISA19, мы демонстрируем здесь что одной молекулы массив цифровых ELISA является воспроизводимость и надежной платформой для сверхчувствительная обнаружения низкой концентрации цитокинов в образцах. Таким образом эта технология предлагает огромный потенциал для открытия биомаркеров и улучшение пациента управления широкого спектра заболеваний.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
DD и YJC отметить поддержку от НРУ (проект IFNX, нет. CE17001002) и ImmunoQure AG для предоставления моноклональных антител. Мы благодарим Brigitte Бадер-Менье, Наталия Беллон, Кристин Bodemer, Алекс Belot, Изабель мелки и Пьер Quartier за предоставление клинических образцов. YJC признает Европейский исследовательский совет (GA 309449: стипендий для YJC) и государственные субсидии по программе «Инвестиции для будущего», учитывая ссылку АНР-10-IAHU-01 в ведении Национального исследовательского агентства (Франция).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) | ImmunoQure AG | NA | Not commercially available |
| Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) | ImmunoQure AG | NA | Not commercially available |
| Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone | eBioscience | BMS216C | |
| Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone | eBioscience | BMS216BK | Not an ELISA kit but bulk abs |
| IFN α2c | eBioscience | BMS305 | OK |
| IFN αI (17) | PBL | 11150-1 | |
| IFN α2a | PBL | 11100-1 | |
| IFN α2a | PeproTech | No longer available | |
| IFN α2b | PBL | 11105-1 | |
| IFN α1 | PBL | 11175-1 | |
| IFN α4a (M1) | PBL | 11177-1 | |
| IFN α4b (a4) | PBL | 11180-1 | |
| IFN αB2 (a8) | PBL | 11115-1 | |
| IFN αC (a10) | PBL | 11120-1 | |
| IFN αD (a1) | PBL | 11125-1 | |
| IFN αG (a5) | PBL | 11135-1 | |
| IFN αF (a21) | PBL | 11130-1 | |
| IFN αH2 (a14) | PBL | 11145-1 | |
| IFN αJ1 (a7) | PBL | 11160-1 | |
| IFN αK (a6) | PBL | 11165-1 | |
| IFN αWA (a16) | PBL | 11190-1 | |
| IFN λ1 | PeproTech | 300-02L | |
| IFN λ2 | PeproTech | 300-02K | |
| IFN ω | PeproTech | 300-02J | |
| IFN β | PeproTech | 300-02BC | |
| IFN γ | PeproTech | 300-02 | |
| Anti-IFN-α ELISA | PBL | 41115.1 | |
| 96-well plates | Corning | 3904 | |
| ISRE-Reporter | Qiagen | CCS-008L | |
| Fu-GENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Mediuem | ThermoFischer Scientific | 31985062 | |
| Dual-Luciferase Reporter assay | Promega | E1910 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Spectrophotometer NanoDrop 1000 | Thermo Scientific | No longer available | |
| Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres | Merck Millipore | UFC505096 | |
| Bead Conjugation Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
| Non-Encoded Paramagnetic Beads | Quanterix | 101360 | |
| Bead Wash Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
| EDC | Fisher Scientific | 11844071 | |
| Bead Blocking Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
| Bead Diluent Buffer | Quanterix | 101362 | |
| Detector and Sample Diluent | Quanterix | 101359 | |
| Biotinylation Reaction Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
| NHS-PEG4-Biotin | Fisher Scientific | 11891195 | |
| diH2O | |||
| Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) | Thermo Scientific | 75002478 | |
| Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) | IKA | MS2 | |
| Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) | Thermo Scientific | ||
| Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) | Thermo Scientific | ||
| 1.7mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) | VWR | 521-2844 | |
| Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) | Eppendorf | ||
| Single molecule array (Simoa) reagents | |||
| SBG, Bead and Detector Barcode Labels | Quanterix | 101652 | |
| 15 mL Reagent Bottles | Quanterix | 102411 | |
| Simoa specimen 96-well plates | Quanterix | 101457 | |
| Simoa Discs | Quanterix | 100001 | |
| Simoa 2.0 conductive Tips | Quanterix | 101726 | |
| Simoa Cuvettes | Quanterix | 100803 | |
| Simoa SBG Reagent | Quanterix | 102295 | |
| Simoa RGP Reagent | Quanterix | 101736 | |
| Simoa System Buffer 1 | Quanterix | 100486 | |
| Simoa System Buffer 2 | Quanterix | 100487 | |
| Sealing Oil | Quanterix | 100206 | |
| ddH2O | |||
| Simoa HD-1 Analyzer | Quanterix | 100032 | |
| Technologies | |||
| Single molecule array (Simoa) | Quanterix | ||
| Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems | Singluex |
References
- Isaacs, A., Lindenmann, J. Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).
- Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).
- Hunt, D., et al. Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta. N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).
- Hooks, J. J., et al. Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease. N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).
- Greenberg, S. A., et al. Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis. Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).
- Crow, Y. J. Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).
- Rodero, M. P., Crow, Y. J. Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview. J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).
- Lewis, J. A. A sensitive biological assay for interferons. J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).
- Meager, A. Biological assays for interferons. J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).
- Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies. Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).
- Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy. Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).
- Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons. Pharmacology. 84, 135-144 (2009).
- Li, Y., et al. Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).
- Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon. PLoS One. 6, e25858 (2011).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples. R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).
- Simoa. Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology. Whitepaper 1.0. , Quanterix Corp. 1-2 (2013).
- Chang, L., et al. Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations. J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).
- Yeung, D., et al. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum. J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).
- Song, L., et al. Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease. J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).
- Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy. PLoS One. 10, e0133236 (2015).
- Decalf, J., et al. Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies. EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).
- Rabing Brix Petersen, E., et al. Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology. J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).
- Disanto, G., et al. Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis. Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).
- Song, L., et al. A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics. Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).
- Passaes, C., et al. Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents. J. Virol. 91, e02296 (2017).
- Song, L., et al. Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays. Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).
- Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays. Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).
- Meyer, S., et al. AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies. Cell. 166, 582-595 (2016).
- Simoa. Homebrew Assay Development Guide. Simoa HD-1 Analyzer & Quanterix SR-X. User-0021 08. , Quanterix corporation. (2017).
- Rodero, M. P., et al. Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease. J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).
- Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation. J. Breath Res. 9, 047108 (2015).
- Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery. Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).
- Wilson, D. H., et al. The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing. J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).
- Rivnak, A. J., et al. A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood. J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).
- Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).
