Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att beskriva utveckling och validering av en enda molekyl array digital ELISA-testet, vilket gör den ultra känslig detektion av alla IFN-α undertyper i mänskliga prover.
Abstract
Huvudsyftet med detta protokoll är att beskriva utveckling och validering av en interferon (IFN)-α enda molekyl array digital enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) analys. Detta system möjliggör kvantifiering av humant IFN-α protein med oöverträffad känslighet och ingen korsreaktivitet för andra arter av IFN.
Det första viktiga steget i protokollet är valet av antikropp paret, följt av konjugationen av capture antikropp till paramagnetiska pärlor och biotinylation hos en detektionsantikropp. Efter detta steg, kan olika parametrar såsom assay konfiguration, detektor antikroppskoncentrationen och buffert sammansättning ändras tills optimal känslighet uppnås. Slutligen, specificitet och metodens reproducerbarhet bedöms för att säkerställa förtroendet för resultaten. Här utvecklade vi ett IFN-α enda molekyl array test med en detektionsgräns på 0,69 fg/mL med hög affinitet autoantikroppar isolerade från patienter med biallelic mutationer i proteinet autoimmuna regulator (AIRE) orsakar autoimmuna polyendocrinopathy syndrom typ 1/autoimmuna polyendocrinopathy-candidiasis-ektodermala dystrofi (APS1/APECED). Ännu viktigare, aktiverat dessa antikroppar upptäckt av alla 13 undertyper för IFN-α.
Denna nya metod tillåter detektering och kvantifiering av IFN-α protein i mänskliga biologiska prover vid attomolar koncentrationer för första gången. Ett sådant verktyg kommer att vara mycket användbart i övervakningen av denna cytokin i hälso- och sjukdomstillstånd, de flesta särskilt infektioner, autoimmunitet och autoinflammation.
Introduction
Typ jag behandlats är en familj av cytokiner som spelar en central roll i iscensättandet antivirala immunsvar. De upptäcktes först av Isaacs och Lindenmann 60 år sedan1,2 och det är nu känt att denna heterogen familj av polypeptider består av 14 olika underklasser (13 IFN-α subtyper och 1 IFN-β). Typ jag behandlats är väsentliga för clearance av virusinfektioner, men har också varit inblandade i en mängd mänskliga sjukdomstillstånd, inklusive autoimmuna sjukdomar systemisk lupus erythematosus (SLE), juvenil dermatomyosit (JDM), patologi och typ Jag interferonopathies i vilken konstituerande typen IFN-inducerad signalering resultaten i patologi3,4,5,6,7.
Studera typ I IFN protein nivåer i biologiska prover har varit utmanande sedan dess inledande identifiering som en ”störande ämne”1,2. Sandwich enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) är för närvarande den mest använda metoden för påvisande av IFN-α protein. Trots att specifika, enkel och snabb, typ I IFN ELISAs närvarande viktiga begränsningar, såsom begränsad känslighet. Dessutom, kräver mätning av alla IFN-α subtyper användning av flera analyser varje med sin egen upptäckt kapacitet och känslighet. Medan det finns kommersiella ELISA-test som upptäcker olika subtyper av IFN-α, deras känslighet är begränsad (1,95 pg/mL, 12,5 pg/mL och 12,5 pg/mL, respektive) som ofta är otillräcklig för att upptäcka IFN-α protein i biologiska prover. För att kringgå den här begränsningen av flera biologiska proxy analyser har utvecklats för att kvantifiera typ I IFN genom att mäta inducerade genuttryck eller funktionell aktivitet8,9,10,11, 12 , 13 , 14. dessa analyser ger dock inte en direkt mätning av proteinet IFN-α.
I denna studie användes enda molekyl med digital array ELISA-teknik för att utveckla ett test för påvisande av enstaka IFN-α proteinmolekyler. Digitala ELISA använder samma grundläggande kemi som konventionella ELISA, dock reaktionen sker i matriser bestående av 50 000 enskilda 46 femtoliter storlek brunnar15,16. Enda proteinmolekyler fångas av antikroppsbelagda paramagnetiska pärlor och märkt med en biotinylerade detektionsantikropp, följt av bindningen av ett enzymkonjugat, streptividin-β-galaktosidas (SBG). Därefter, är pärlorna upphängda med ett fluorogenic enzym substrat, resorufin-β-D-galactopyranoside (RGP), till singel-molekyl arrayer. Genom att minska volymen reaktion 2 miljarder gånger17, en hög lokal koncentration av fluorescerande signal uppnås och enda molekyl räknas blir möjligt, eftersom varje molekyl skapar en signal som nu kan tillförlitligt mätt18. I huvudsak kan enda molekyl matriser räkna enda immunocomplexes och att bestämma ett genomsnittligt antal enzymer per pärla (AEB). Räkna mikrobrunnarna där en signal detekteras tillåter kvantifiering/digitalisering av proteinmolekyler, som det finns en direkt korrelation mellan proteinkoncentration och förhållandet mellan immunocomplexed-pärlor och en totala antalet pärlor i femtoliter-stora kamrarna.
Yeung et al. utfört en omfattande plattformsoberoende utvärderingsstudie med nio olika tekniker och fyra cytokin immunanalyser med syftet att jämföra precision analys, känslighet och data korrelation över olika plattformar19. En av de viktigaste resultaten av studien var att enda molekyl matriser och enda molekyl räknar immunoassay presenteras högsta känsligheten för upptäckt av cytokiner i humant serum inom intervallet sub-pg/mL koncentration. Enda molekyl array digital ELISA cytokin-analyser har använts för att studera rollen av TNF-α och IL-6 i Crohns sjukdom20, IFN-α i interferonopathy och autoimmuna patienter 7, och de olika post-translationally modifierade former av C-X-C motiv chemokine 10 (CXCL10) i kronisk hepatit och friska donatorer som fick sitagliptin21,22. Andra program omfatta mätning av rhodopsin i patienter med diabetesretinopati23; studien av hjärnan patologier genom serum/plasma mätningar av neurofilament light24 och amyloid-β 1-42 peptid25, i samband med multipel skleros och Alzheimers sjukdom, respektive. Enda molekyl array-analyser kan också användas för upptäckt av förbättrad patogen såsom karakterisering av HIV viral reservoar26, och även för upptäckt av DNA27 och micro RNAs28. En stor fördel med den enda molekyl array-tekniken är denna hög flexibilitet, då ett test mot någon analyt sevärdheter kan utvecklas om en specifik antikropp-paret finns. Dessutom är homebrew assay kit kommersiellt tillgängliga, så att utvecklingen av nya analyser, protokollet som är detaljerad i modifierad form nedan.
Här, presenteras en detaljerad beskrivning av utveckling och validering stegen för en enda molekyl array analys som resulterar i förbättrad känslighet för IFN-α protein upptäckt. Antikroppar för enda molekyl array analyser bör vara högspecifik, undvika arg reactivity med relaterade proteiner (med arter specificitet beaktas om det är relevant). Antikroppar med en KD mindre än 10-9 M bör helst väljas; hög affinitet säkerställer starka bindning, med produktionen av en högre signal. Kineticsen av antikropp-antigen bindningen är också viktiga och snabb Kpå och långsam Koff kommer att gynna antigen-antikropp komplexa församling. Börjar med en antikropp-par som har en bra prestanda i klassiskt ELISA, med en detektionsgräns (LOD) 1-100 pg/ml, ökar chanserna att få en mycket känslig enda molekyl array analys. Chang och kollegor utfört detaljerad kinetiska studier av biomolekylära interaktioner inträffar vid varje steg, föreslår en uppsättning ekvationer att förutsäga Analytisk känslighet18. De visade den enda molekyl arrayen digital ELISA verkar vara effektiv inom ett brett spektrum av antikropp tillhörighet (KD ~ 1011 - 10−9 M) as well as det signal generationen är mer beroende av den-andelen sådana antikroppar.
För att utnyttja hög affinitet typ antikroppar tog vi fördel av antikroppar isolerade från patienter med autoimmuna polyendocrinopathy syndromet 1/autoimmuna polyendocrinopathy-candidiasis-ektodermala dystrofi (APS1/APECED)29. Av skäl som ännu inte har förstått, den stora majoriteten av AIRE-brist individer utveckla en grunduppsättning av hög-aviditet antikroppar mot alla IFN-α subtyper29och vi valt två mot IFN-α-antikropp kloner av kompletterande bindande samhörighet för de olika subtyperna, IFN-α, som uppskattade av IC50 värden. Kombinationen av dessa unika hög affinitet antikroppar med enda molekyl array-teknik aktiverad direkt kvantifiering av IFN-α vid attomolar (fg/mL) koncentrationer. Sådana ultrasensitive IFN-α protein upptäckt kommer att bidra till en bättre förståelse av naturen, förordning och biologiska effekter av IFN-inducerad svar i olika sjukdomen inställningar.
Protocol
1. urval av antikroppar
- Innan du börjar protokollet granska alla viktiga steg (tabell 1) och Välj optimal antikroppar.
Obs: För detta protokoll valdes hög affinitet mot IFN-α antikroppar - IC50 som beskrivs i tabell 2 . Företrädesvis, välja ett par som fungerar bra med konventionella ELISA.
2. konjugering av Capture antikroppen paramagnetiska pärlor och testning av olika koncentrationer
Obs: Håll alltid pärla konjugation buffert (BCB) och pärla Wash Buffer (BWB) på isen under processen antikropp konjugation.
-
Fånga antikropp buffert Exchange
- Ta första mängder mot IFN-α-antikropp A att testa 3 olika pärla konjugationer nyckeltal (0.038 mg/mL, 0,075 mg/mL och 0,3 mg/mL).
Obs: Låg antikropp beläggning koncentrationer kan vara fördelaktigt om analysen presenterar en hög bakgrund signal. Inledande antikropp kvantitet skall redovisa en beräknad 30% förlust under processen buffert exchange. Enligt tillverkarens anvisningar och för att minska inledande bakgrund, testades koncentrationer av 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL och 0,3 mg/mL, även om dessa exakta värden erhölls ofta inte på grund av de ovannämnda variabel förlusten i bufferten utbytesprocessen. - Lägga till volymen som krävs av antikropp i en kolumn med en filter tillsammans med BCB, upp till 500 µL.
- Centrifugera kolumnerna på > 10.000 x g för 5 min och kassera genomflöde.
- Tvätta kolonnen två gånger genom att lägga till en total volym på 450 µL av BCB följt av centrifugering vid > 10 000 x g i 5 min och släng flödet genom.
- Placera filtret kolumnen som innehåller antikroppen till en ren mikrocentrifug rör uppochner - den öppna delen av kolumnen som vetter mot insidan av det nya röret - och centrifugera vid 800 x g i 1 min.
Obs: Detta steg gör att insamling av rengjorda antikropp. Ingen buffert tillägg krävs för detta steg. - Tvätta membran med 50 µL BCB och centrifugera vid 800 x g för 1 min liksom 2.1.5.
- Mätning av koncentrationen av antikroppar med låg volym spektrofotometer.
- Lägg till BCB för att uppnå den önska antikroppkoncentrationen och observera den slutliga volymen.
Obs: En volym på 200 µL kommer att användas för att beskriva resten av protokollet, denna volym som benämns 2 volymer (2V). Alla följande reagens volymer kommer att anpassas därefter. - Vortex och hålla på is.
- Ta första mängder mot IFN-α-antikropp A att testa 3 olika pärla konjugationer nyckeltal (0.038 mg/mL, 0,075 mg/mL och 0,3 mg/mL).
-
Paramagnetiska pärla förberedelse
- Överföring 2,8 x 108 pärlor (100 µL = 1V) i ett mikrofugrör.
Obs: Volymen av pärlor är beroende av den slutliga volymen som erhållits i 2.1.8. - Puls spin och sätta i en magnetisk separator för 1 min, kassera spädningsvätska och bort från magneten.
- Lägg till 2V BWB och virvel för 5 s.
- Upprepa 2.2.2 och 2.2.3 två gånger med BWB och två gånger med BCB.
- Lägg till 190 µL BCB, vortex 5 s, puls spin för 1V av pärlor och lagra tvättade pärlorna på is.
- Överföring 2,8 x 108 pärlor (100 µL = 1V) i ett mikrofugrör.
-
Bead aktivering
- Tillsätt 1 mL kall BCB till en 10-mg injektionsflaska 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydroklorid (EDC) och vortex tills lösningen är homogen.
- Lägg till 10 µL kallt utspädda EDC till tvättade pärlor, vortex, och hålla i en shaker vid 1000 rpm i 30 min i rumstemperatur för 1V av pärlor.
Obs: EDC förberedelse och tillägg till pärlorna bör göras så snabbt som möjligt på grund av EDC instabilitet i vattenlösningar. Dessutom som EDC är mycket reaktiva, är det viktigt att ha en homogen pärla suspension före EDC tillsats för att förhindra heterogena pärla aktivering. Efter EDC dessutom måste pärlor hållas i suspension.
-
Bead Konjugation av antikroppen
- Vortex och puls spin aktiverade pärlorna. Nu lägga pärlorna i en magnetisk separator för 1 min, kassera BCB supernatanten och ta bort röret från magneten.
- Tvätta pärlorna med 2V av BCB. Vortex, puls spin, och sätta i den magnetiska avskiljaren för 1 min. Sedan kassera BCB bufferten och ta bort pärlorna från magneten.
- Snabbt lägga till den kalla, buffert-utbyts 200 µL (2V) antikropp aktiverade pärlorna.
- Vortex och hålla för 2 h i shakern i rumstemperatur.
-
Bead blockerande och slutlig sanering
- Puls spin antikroppsbelagda pärlor fjädringen, sätta i den magnetiska avskiljaren för 1 min, överför supernatanten till en ny tub och mäta koncentrationen med en låg volym spektrofotometer.
Obs: Detta steg kommer att ge information om huruvida pärlorna är mättade - värden över noll indikerar pärla mättnad - som lösliga antikroppar inte binda till pärlorna blir mätbara. - Ta bort de konjugerade pärlorna från magneten, Lägg 2V av BWB, virvel för 5 s, puls spin och sätta i den magnetiska avskiljaren för 1 min.
- Överför supernatanten till en ny tub och mäta koncentrationen med en låg volym spektrofotometer.
Obs: Detta steg kommer att ge information om huruvida antikropparna är stabilt fast pärlorna. Detekterbara antikroppskoncentrationen i denna supernatanten indikerar avlossning av antikropp från pärlorna, vilket händer regelbundet. Denna analys fungerar ofta även när mycket små mängder av capture antikropp sitta kvar till pärlorna. - Ta bort de konjugerade pärlorna från magneten, Lägg 2V av BWB, virvel för 5 s, puls spin och sätta i den magnetiska avskiljaren för 1 min.
- Ta bort konjugerade pärlor från magneten, tillsätt 2V pärla blockerande buffert, virvel för 5 s, och inkubera i shakern i 30 min i rumstemperatur.
- Tvätta de antikroppsbelagda och blockerade pärlor 3 x med 2V, en gång med BWS, och 2 x med pärla spädningsvätska buffert (ignorera alla supernatanterna).
- Förvara bestruket och blockerade pärlor vid 4° C fram till användning med 2V pärla spädningsvätska buffert.
Obs: Precis innan användning, pärlor måste tvättas en gång med detektor/Sample spädmedel med en volym på 250 x pärla volym/20, använder den magnetiska avskiljaren.
- Puls spin antikroppsbelagda pärlor fjädringen, sätta i den magnetiska avskiljaren för 1 min, överför supernatanten till en ny tub och mäta koncentrationen med en låg volym spektrofotometer.
3. identifiering av antikropp Biotinylation
-
Upptäcka antikroppar buffert Exchange
- Ta 260 µg två mot IFN-α Ab kloner.
Anmärkning: Detta tar hänsyn till en 30% förlust under buffert utbyte och tillåter testning av två olika biotin/antikropp nyckeltal. - Fortsätt som 2.1 med Biotinylation reaktion buffert (BRB) i stället för BCB.
- Mät volymen och antikropp koncentrationer och justera volymen för att erhålla en slutlig koncentration av 1 mg/mL.
Obs: Detta är en föreslagna start koncentration, men det kan optimeras om analysen inte uppnår känsligheten som krävs.
- Ta 260 µg två mot IFN-α Ab kloner.
-
Identifiering av antikropp Biotinylation
- Placera den N-hydroxysuccinimide-polyeten-glycol4-biotin (NHS-PEG4-Biotin) i rumstemperatur och resuspendera med sammanlagt 400 µL destillerat vatten för att uppnå en 3,4 mM koncentration.
- Bestämma förhållandet biotin: antikropp att testa och blanda detektionsantikropp och utspädda biotin med detta (baserat på 60:1 motsvarar 100 µL detektionsantikropp och 4,5 µL av biotin).
Obs: Till att börja med testa 30: 1 och 60:1 nyckeltal. - Vortex den antikropp-biotin mix, puls spin och inkubera i 30 min i rumstemperatur.
Obs: Inget behov att skaka.
-
Biotinylerade upptäckt antikropp rening
- Överföra biotinylerade antikroppen till ett nytt filter och fortsätter sedan 2.1, utför 3 tvätt steg med BRB (400, 450, och 450 µL) och en sista samling.
- Mät volymen och koncentration av renat, biotinylerade detektionsantikropp och förvaras vid 4 ° C fram till användning.
4. assay optimering
Obs: Användning av programvaran enda molekyl array analyzer i en Homebrew konfiguration30.
Enda molekyl array analyzer maskinen styrs av programvara som gör för att köra assay standardiseringar, för att utföra provet kvantifieringar, om du vill ändra externa parametrar (bead, detektor, SBG, RGP koncentrationer; provspädningar...) och interna parametrar (antal steg, inkubationstider...) att uppnå optimal assay villkor, och kan också användas för att beräkna resultat (bakgrund, LOD, kvantiteter). Inställningarna för den enda molekyl array analyzer och att beräkna reagens volymer som krävs för varje omgång optimering, se tillverkarens anvisningar. Utföra de första omgångarna av optimering med en 2-stegs-konfiguration.
- Testa kombinationer av capture antikropp-konjugerad pärlor och biotinylerade detektionsantikropp i båda konfigurationerna.
- Testa kombinationer av tre olika mot IFN-α A fånga antikropp koncentrationer med två olika mot IFN-α B biotinylation nyckeltalen som upptäckt och fånga antikroppar, och vice versa (figur 1) urval av lämpliga villkor i analyzer programvaran.
- Välj den mest känsliga kombinationen, det vill säga de villkor som erbjuder det lägsta LOD, och använda den för ytterligare steg
Obs: Figur 1 visar hur en 0,3 mg/mL mot IFN-α en antikroppskoncentration pärla och biotin: antikropp förhållandet 30: 1 med mot IFN-α B antikroppen resulterade i högsta känslighet, vilket framgår av ett LOD 11,6 fg/ml. (Se kompletterande tabell 1). Denna kombination kommer att användas för alla framtida åtgärder. Märke att den stor känsligheten uppnås med denna särskilda analys innan några rundor av optimering.
Figur 1: val av antikropp orientering, fånga antikroppskoncentration på pärlor och baserat på biotinylation. De två möjliga olika konfigurationerna testades, med mot IFN-α A som capture antikropp och mot IFN-α B som upptäckt antikropp (A), och vice versa (B). IFNα - 2c användes som antigen. Olika capture antikropp koncentrationer samt biotin: antikropp (B:A) nyckeltal testades också för båda konfigurationerna. Streckade linjen visar LOD för i bästa skick. mot IFN-α en 0,3 mg/mL som avskiljning och mot IFN-α B biotin: detektor antikropp kvot av 30 (LOD = 11,6 mg/mL motsvarande en AEB värde av 0.017265). En 2-stegs konfiguration användes. Biotin: antikropp (B:A). vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
- Jämföra en 2 vs 3-steg konfiguration.
Obs: I en 3-stegs konfiguration finns tre olika inkubationsstegen, en med capture antikroppen, en med detektionsantikropp och en slutlig tredje för SBG enzym märkning. Dock i en 2-stegs konfiguration, fånga och upptäcka antikroppar inkuberas samtidigt med analyten sevärdheter.- Kör den enda molekyl array analyzer med capture och detektor antikroppskoncentrationen och nyckeltal från 4.1.2 att välja de konfigurationer som 2 och 3-stegs förkonfigurerade i analysatorn, följande tillverkarens instruktioner30.
- Välja den konfiguration som tillåter för högsta känslighet och behåll den för framtida åtgärder
Obs: Som visas i figur 2 och kompletterande tabell2, 2-stegs konfigurationen gav något högre känslighet och signal/bakgrund baserat för varje koncentration som testats. Därför hölls den 2-step konfigurationen för framtida åtgärder.
Diagram 2:2 vs 3-steg konfiguration jämförelse. De 2 och 3-stegs konfigurationerna bedömdes med 0,3 mg/mL mot IFN-α en antikropp som avskiljning och mot IFN-α B som detektionsantikropp i förhållandet 30 biotin: antikropp. IFNα - 2c användes som antigen. I en 3-stegs skick finns det tre olika inkubationsstegen, en med capture antikroppen, en med detektionsantikropp och en slutlig tredje för SBG enzym märkning. Dock i en 2-stegs konfiguration, fånga och upptäcka antikroppar inkuberas samtidigt med analyten sevärdheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Optimering av detektorns antikropp och SBG koncentration
- Testa tre olika koncentrationer av detektor antikropp (0,1, 0,3 och 0,6 µg/mL) tillsammans med tre olika koncentrationer av SBG (50, 150 och 250 pM) som beskrivs ovan30.
- Välj de koncentrationer som ger den högsta känsligheten och hålla dem för framtida åtgärder.
Obs: Figur 3 visar att detektorn 0,3 µg/mL och SBG 150 pM var de villkor som visade den optimala LOD. Dessa villkor gav också låg bakgrundsnivåer och medelstor amplitud, ett beteende som genererar bra standardavvikelsen (SD) värden (kompletterande tabell3). Typiska koncentrationerna varierar mellan 0,1 - 1 µg/mL för detektionsantikropp och 50-200 pM för SBG, även om högre koncentrationer (t.ex. upp till 300 pM) på det senare kan krävas. Det är viktigt att undvika förhållanden som kommer att göra bakgrunder högre än 0,02 AEB. Öka koncentrationen av detektor monoklonala antikroppar (mAb) eller SBG kommer att öka både signal svar och bakgrund. Om tillväxten i signal överkommer förändringen i bakgrunden, ökar emellertid i LOD. Kan det uppstå en situation där en minskning i bakgrunden tillåter bättre diskriminering mellan låg kalibratorer.
Figur 3: optimering av detektor och SBG koncentration. Tre olika koncentrationer av biotinylerade detektor antikropp (0,1, 0,3 och 0,6 µg/ml) tillsammans med tre olika koncentrationer av SBG (50, 150 och 250 pM) bedömdes. Streckade linjen visar LOD för i bästa skick. detektorn antikropp på 0,3 mg/mL och SBG 150 pM (LOD = 0,09 mg/mL motsvarande en AEB värde av 0.017184). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Ytterligare optimering steg
- Om känsligheten som krävs inte har uppnåtts, testa olika inkubationstider för de olika stegen med förkonfigurerade alternativen i programvaran analyzer.
- Om analysen inte är känslighet nog, optimera antalet pärlor per analys med förkonfigurerade alternativen i programvaran analyzer.
Obs: När testning av biologiska prover börjar, provvolymen är en extra parameter som är mottagliga för optimering. Se till att prover hanteras enligt förfarandena som hälsa och säkerhet.
5. assay specificitet och reproducerbarhet
- Testa IFN-α analysens specificitet, genom att testa analysens med IFN-α subtyperna och andra relaterade proteiner (figur 4a och 4b).
Figur 4: specificitet och känslighet optimerad IFNα enda molekyl array analysens. (A) IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω och IFN-γ rekombinanta proteiner testades, tillsammans med (B) 16 subtyper av IFN-α, inklusive tre IFN-α2-typer (IFN-α2a, IFN-α2b och IFN-α2c). Anpassad från Rodero et al. 2017. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
- Utvärdera reproducerbarheten för optimerad analysen genom att utföra tre oberoende replikera experiment och bedöma mellan analyser variabilitet (figur 5).
- Beräkna LOD analysens
Obs: LOD beräknades med hjälp av medelvärdet av de tre tomma + 3 standardavvikelser (SD), därmed få ett värde på 0,23 fg/mL. Standardprov utspädningsfaktorn är 1:3, ger införandet av utspädningsfaktorn ett LOD 0.69 fg/ml.
Figur 5: reproducerbarhet optimerad pan-IFN-α enda molekyl array analysens. Tre oberoende körningar utfördes med två olika massor av pärlor. För det andra partiet utfördes två oberoende experimenten. Varje mätning förvärvades dubbletter. Den streckade linjen representerar den LOD, definieras av genomsnittlig tom genomsnittliga enzym per pärla + SD över alla körningar. IFN-α17 användes som referens, med hänsyn till att härledda standardkurvan är representativt för alla andra undertyper för IFN-α, som visas i figur 4b. Handlingen visar medelvärdet och SD (felstaplar). Streckade linjer visar LOD för de olika körningarna; Kör 1: 0,073 fg/mL AEB = 0.006238, kör 2: 0,113 fg/mL AEB = 0.007119, kör 3: 0.043 fg/mL AEB = 0.05518). Anpassad från Rodero et al. 2017. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
6. protein konkurrens analys
- Utföra en protein konkurrens analys (beskrivs i figur 6 legend) för att ytterligare demonstrera analysens specificitet.
Obs: Plasmaprover från patienter med SLE (n = 5) användes.- När virus misstänks vara närvarande i det biologiska provet, förbereda inaktivering buffert genom att tillsätta 200 µL av en icke-ioinic tensid (0,5% nonidet P40 suppleant) till 40 mL detektor/Sample spädningsvätska och vortex kraftigt.
- Centrifugera biologiska prover som innehåller analyten av intresse vid 10 000 g i 15 minuter vid 4 ° C ta bort cellulära skräp.
- Blanda 185 µL detektor/Sample spädningsvätska eller inaktivering buffert med 100 µL biologiska prov (slutspädning faktor 3) och 15 µL anti-IFN-α-antikropp A (initial koncentration 1 mg/mL, slutlig koncentration 50 ug/mL) eller buffert. Inkubera i 30 min i rumstemperatur.
- Köra prover med och utan mot IFN-α-antikropp i enda molekyl array analysatorn som beskrivs ovan.
Obs: Vid signal mättnad, prover bör spädas ytterligare. 300 µL är också den volym som krävs för dubbla analyser.
Figur 6: Protein konkurrens assay. Konkurrens experimenten utfördes med hjälp av prover från fem olika SLE-patienter. Biologiska prover var centrifugeras vid 10.000 g under 15 minuter vid 4 ° C. De späddes 1/3 med detektor/Sample spädningsvätska innehållande NP40 för viral inaktivering. 15µl av mot IFN-α-antikropp A (initial koncentration 1 mg/mL, slutlig koncentration 50 µg/mL) eller buffert lades till en total volym av 300 µL. inkubation utfördes vid rumstemperatur för 30 min. kontrollgruppen visas i grått och prover behandlas med anti-IFN-α A antikropp visas i svart. Diagrammet visar medelvärdet och SD (felstaplar). Streckade linjen representerar LOD (AEB = 0.024774, 0.8037 fg/mL). Anpassad från Rodero et al. 2017 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Representative Results
Sammanfattningsvis belagd en pan-IFN-α enda molekyl array analys med en detektionsgräns på 0,69 fg/mL, med en 2-stegs-konfiguration med fånga pärlor med 0,3 mg/mL mot IFN-α en antikropp och mot IFN-α B upptäckt antikropp biotinylerade i biotin: antikropp förhållandet 30 utvecklades. De koncentrationer som används för biotinylerade detektionsantikropp och SBG var 0,3 µg/mL och 150 pM, respektive. Denna mycket specifika analys kan detektera alla 13 IFN-α subtyper och reagerar inte cross med annan typ av behandlats. Således, medan det inte är möjligt att identifiera och kvantifiera varje enskild art av IFN-α, alla av dem kan upptäckas och mätt tillsammans vilket ger en total koncentrationsvärde för IFN-α som består av 13 olika underklasser.
För att undersöka det potentiella diagnostiska värdet av denna nyutvecklade analys, IFN-α protein i plasma och serum från friska individer mättes och jämfördes med prover från patienter med SLE och JDM. Som illustreras i figur 7, upptäcktes höga nivåer av IFN-α protein sjukdomen kohorterna jämfört med friska kontroller. Den streckade linjen visar LOD för en konventionell kommersiellt tillgänglig ELISA, som illustrerar hur detta tillvägagångssätt inte skulle upptäcka IFN-α protein i dessa patientgrupper trots de kända intresseorganisationerna för denna cytokin med dessa fenotyper. IFN-α kunde dessutom kvantifieras över 5 loggar av omfattning, som illustrerar det brett dynamiskt omfånget av analysen, med detekterbara halter mellan 1-10 fg/mL bekräftar den känsliga naturen i analysen.
Figur 7: kvantifiering av IFN-α protein i plasma och serum från patientgrupper. Denna siffra har ändrats från Rodero et al. 2017. plasma från friska kontroller (n = 20) och patienter med SLE (n = 72) och JDM (n = 43) testades med pan-IFNα enda molekyl array analys. Analysen utfördes med envägs ANOVA-test (Kruskal-Wallis) och Dunns flera jämförelse tester mellan grupperna. Median är avbildad. Streckade linjen visar LOD av en referens mänsklig mot IFN-α ELISA (1,95 pg/mL = 1950 fg/mL). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Steg | Överväganden | Referens |
| 1. antikropp par val | Mål olika epitoper | Tabell 2 |
| Hög affinitet | ||
| Snabbt Kpå / långsam Koff | ||
| 2. antikropp par orientering | Välj villkor med den lägsta gränsen för upptäckt | Figur 1 |
| 3. fånga antikroppskoncentration | ||
| 4. biotin: detektor antikropp baserat | ||
| 5. 2 vs 3-steg konfiguration | Välj villkor med högst Signal: bakgrund i förhållande | Figur 2 |
| 6. detektor antikroppskoncentration | Välj villkor med den lägsta gränsen för upptäckt | Figur 3 |
| 7. SBG koncentration | ||
| 8. specificitet | Bedöma korsreaktivitet | Figur 4 |
| 9. känslighet | Bedöma erkännande av subtyper (om tillämpligt) | |
| 10. reproducerbarhet | Bedöma assay variabilitet | Figur 5 |
Tabell 1: Sammanfattning av åtgärder för utveckling och optimering av en enda molekyl array analys. Denna tabell sammanfattar de olika steg som krävs för utveckling och optimering av en enda molekyl array analys, från inledande valet av antikropp par tills bedömningen av reproducerbarhet.
| Antigen | 8H 1 (A) | 12H 5 B | Sifalimumab | Rontalizumab |
| IFNΑ1 | 28,3 | 51,3 | 460 | 22.63 |
| IFNΑ2 | 2563 | 10,7 | 9,02 | 2.15 |
| IFNΑ4 | 5.11 | 2,99 | 35.35 | 325,3 |
| IFNΑ5 | 2,01 | 19,6 | 93.29 | 2,49 |
| IFNΑ6 | 64,7 | 3.03 | 4,97 | - |
| IFNΑ7 | 0,9 | 0,63 | 233,1 | - |
| IFNΑ8 | 302 | 0,83 | 691 | 10,86 |
| IFNΑ10 | 2,54 | 0,71 | 43,2 | - |
| IFNΑ14 | 3224 | 2.1 | 14,52 | 0,9 |
| IFNΑ16 | 1,83 | 32,99 | 59,18 | 28.65 |
| IFNΑ17 | 2.21 | 0,77 | 890.9 | 23,86 |
| IFNΑ21 | 2,78 | 12,87 | 1769 | 5.8 |
Tabell 2: Pan-alpha antikropp urval. IC50 (ng/mL) fastställs med hjälp av elementet interferon-stimulerad svar (ISRE)-luciferas neutralization assay. Tabellen visar IC50 värdena för mAbs används i enda molekyl array analys för alla IFN-α undertyper. 10 000 HEK 293 MSR celler var seedad i vit halv-området 96 brunnar och omvänd-transfekterade med 50 ng förblandade ISRE-Firefly luciferas reporter och Renilla luciferas konstruktioner med transfection reagens enligt tillverkarens anvisningar. Den luciferas-uttryckande bygga tjänade som en inre normalisering kontroll. Cellerna var inkuberas över natten i minskat Serum Medium kompletteras med 0,1 mM onödiga aminosyror, 1 mM natrium pyruvat, 0,5% fetalt bovint serum vid 37 ° C, 5% CO2 i en fuktad atmosfär. Efter natten inkubation stimuleras celler för 24 h med medium som innehåller blandningar av rekombinant humant IFN-α med eller utan mot IFN-α mAbs eller kontroll IgG som hade varit teststamman för 1 h vid 37 ° C. Efter 24 h av stimulering utfördes dubbla luciferas reporter analyser enligt tillverkarens anvisningar. «-» Ej bestämd. Sifalimumab är en helt human, immunglobulin G1 κ monoklonal antikropp som binder till och neutraliserar majoriteten av IFN-α undertyper; Rontalizumab är en humaniserad monoklonal antikropp mot IFN-α. Anpassad från Meyer et al. 2016 och Rodero o.a. 2017.
Kompletterande Tabell1: val av antikropp orientering, fånga antikroppskoncentration på pärlor och baserat på biotinylation. De två möjliga olika konfigurationerna testades, med mot IFN-α A som capture antikropp och mot IFN-α B som upptäckt antikropp (A), och vice versa (B). IFNα - 2c användes som antigen. Olika capture antikropp koncentrationer samt biotin: antikropp (B:A) nyckeltal testades också för båda konfigurationerna. Mättnad (Sat). Orange: AEB värden som användes för beräkning av LOD; dessa koncentrationer ansågs tom som AEB värden varit stabil. LOD beräknades som menar tom + 3SD. vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Tabell2: Test av 2 vs 3-steg konfiguration. De 2 och 3 - steg konfigurationerna bedömdes med IFNα - 2c som antigen. AEB visas samt som signal/bakgrund ransoner (S/B) värdena för båda villkoren. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Tabell3: optimering av detektor och SBG koncentration. Tre olika koncentrationer av biotinylerade detektor antikropp (0,1, 0,3 och 0,6 µg/mL) tillsammans med tre olika koncentrationer av SBG (50, 150 och 250 pM) bedömdes. AEB värden visas för de nio testa villkor. Orange: AEB värden som användes för beräkning av LOD; dessa koncentrationer ansågs tom som AEB värden varit stabil. LOD beräknades som menar tom + 3SD. vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Tabell4: specificitet och känslighet optimerad IFNα enda molekyl array analysens. Genomsnittliga enzym per pärlor värden visas när IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω och IFN-γ rekombinanta proteiner var testade (A), tillsammans med de 16 undertyperna av IFN-α (B). «-» Ej bestämd. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Tabell5: reproducerbarhet optimerad IFNα enda molekyl array analysens. De AEB medelvärdena för alla tre oberoende körs visas till en koncentration av 10.000 fg/mL. «-» Ej bestämd. Mättnad (Sat). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Tabell6: Protein konkurrens assay. Genomsnittliga enzym per pärlor värden visas för alla villkor testade. Mätningar gjorda i två exemplar. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Discussion
Vi beskrivs häri, utveckling och validering av en mycket reproducerbara, ultrasensitive enda molekyl array digital ELISA för direkt kvantifiering av IFN-α protein i mänskliga prover (steg sammanfattas i tabell 1). En av de viktigaste stegen i utvecklingen av analysen är valet av antikropp par16, med egenskaper när det gäller kinetik och epitop bindande nyckeln till en framgångsrik analys. Det är viktigt att undvika användning av Parade monoklonala antikroppar som riktar den samma epitop eller som orsaka sterisk hinder. Polyklonala antikroppar kan användas som identifiering antikroppar för att övervinna sådana begränsningar. Vid varje given steg uppnås inte önskad känslighet, bör ytterligare optimeringsmöjligheter övervägas. Detta kan inkludera användning av alternativa antikropp par, förändringar i parametrar såsom protein typ (t.ex. BSA < kasein), pH (6.0-8,5), jonstyrka, buffertkapacitet (e.g. NaCl och fosfat koncentrationer), bärare pärlor eller förekomsten av tensider. Ett brett utbud av parametrar optimeras con när du utvecklar en enda molekyl array analys. Dock sammantaget förhållanden som ger hög signal: bakgrunden nyckeltal och minimal LODs är de program (se figur 1, figur 2och figur 3).
När det gäller specificitet, IFN-α analysen visade ingen arg reactivity för eventuella andra behandlats testade (β, γ, λ1, λ2, ω) (figur 4a) och var i stånd att upptäcka alla 13 IFN-α subtyper (figur 4b). Analysen visade dock en lägre affinitet för IFN-α2 subtyp, (figur 4b och kompletterande Tabell4). Intressant, observerades olika känslighet för olika klasser av IFN-α2 (a, b, c) också, vilket kan bero på olika framställningsmetoder eller olika aminosyresekvenser, som de IFN-α2 subtyperna erhölls från olika kommersiella leverantörer. Med detta som enda undantag gav alla IFN-α arter mycket liknande svar. Analysens specificitet visades ytterligare av förbehandling av prov med den mot IFN-α en klon, som upphävts signalen (figur 6 och kompletterande Tabell6).
En av de främsta fördelarna med denna teknik är att någon analyt sevärdheter kan potentiellt riktade16. Dessutom kan olika biologiska prov testas, som serum, plasma, cerebrospinalvätska, cellulär lysates, kultur supernatanterna31 och även andetag32. Vanligtvis, utförs en 1:3 utspädning av plasma för att undvika potentiella igensättning av den enda molekyl array analyzer. Dock analyten av intresse kunde närvara vid mycket låga koncentrationer i de relevanta biologiska provet och högre koncentrationer av prov kan vara obligatoriska (beroende på analysens känslighet)33. Även om det finns potential för multiplexing bibehållen bra känslighet34, är det en mer utmanande process och analyser för att mäta större än 6 proteiner inom samma experimenten har ändå till vara framkallade35.
Förmågan att upptäcka och kvantifiera cytokiner och andra biologiska relevanta proteiner vid sådana låga koncentrationer öppnar upp en helt ny rad applikationer33,36. Det är väl känt att många proteiner utövar sina effekter även vid mycket låga koncentrationer, som hittills låg under detektionsgränsen för de bästa ELISAs37. Medan andra immunoassay tekniker erbjuder fördelar jämfört med konventionella ELISA19, visar vi här att enda molekyl array digital ELISA är en reproducerbar och robust plattform för ultrasensitive upptäckt av låg koncentration cytokiner i mänskliga prover. Denna teknik erbjuder enorma möjligheter för biomarkör identifiering och förbättrade patientens hantering av ett brett spektrum av sjukdomar.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
DD och YJC erkänner stöd från ANR (projekt IFNX, ingen. CE17001002) och ImmunoQure AG för att tillhandahålla monoklonala antikroppar. Vi tackar Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki och Pierre Quartier för att tillhandahålla kliniska prover. YJC erkänner Europeiska forskningsrådet (GA 309449: gemenskap till YJC), och ett statsbidrag som förvaltas av National Research Agency (Frankrike) enligt programmet ”investeringar för framtiden” med referensnummer ANR-10-IAHU-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) | ImmunoQure AG | NA | Not commercially available |
| Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) | ImmunoQure AG | NA | Not commercially available |
| Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone | eBioscience | BMS216C | |
| Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone | eBioscience | BMS216BK | Not an ELISA kit but bulk abs |
| IFN α2c | eBioscience | BMS305 | OK |
| IFN αI (17) | PBL | 11150-1 | |
| IFN α2a | PBL | 11100-1 | |
| IFN α2a | PeproTech | No longer available | |
| IFN α2b | PBL | 11105-1 | |
| IFN α1 | PBL | 11175-1 | |
| IFN α4a (M1) | PBL | 11177-1 | |
| IFN α4b (a4) | PBL | 11180-1 | |
| IFN αB2 (a8) | PBL | 11115-1 | |
| IFN αC (a10) | PBL | 11120-1 | |
| IFN αD (a1) | PBL | 11125-1 | |
| IFN αG (a5) | PBL | 11135-1 | |
| IFN αF (a21) | PBL | 11130-1 | |
| IFN αH2 (a14) | PBL | 11145-1 | |
| IFN αJ1 (a7) | PBL | 11160-1 | |
| IFN αK (a6) | PBL | 11165-1 | |
| IFN αWA (a16) | PBL | 11190-1 | |
| IFN λ1 | PeproTech | 300-02L | |
| IFN λ2 | PeproTech | 300-02K | |
| IFN ω | PeproTech | 300-02J | |
| IFN β | PeproTech | 300-02BC | |
| IFN γ | PeproTech | 300-02 | |
| Anti-IFN-α ELISA | PBL | 41115.1 | |
| 96-well plates | Corning | 3904 | |
| ISRE-Reporter | Qiagen | CCS-008L | |
| Fu-GENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Mediuem | ThermoFischer Scientific | 31985062 | |
| Dual-Luciferase Reporter assay | Promega | E1910 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Spectrophotometer NanoDrop 1000 | Thermo Scientific | No longer available | |
| Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres | Merck Millipore | UFC505096 | |
| Bead Conjugation Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
| Non-Encoded Paramagnetic Beads | Quanterix | 101360 | |
| Bead Wash Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
| EDC | Fisher Scientific | 11844071 | |
| Bead Blocking Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
| Bead Diluent Buffer | Quanterix | 101362 | |
| Detector and Sample Diluent | Quanterix | 101359 | |
| Biotinylation Reaction Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
| NHS-PEG4-Biotin | Fisher Scientific | 11891195 | |
| diH2O | |||
| Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) | Thermo Scientific | 75002478 | |
| Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) | IKA | MS2 | |
| Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) | Thermo Scientific | ||
| Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) | Thermo Scientific | ||
| 1.7mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) | VWR | 521-2844 | |
| Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) | Eppendorf | ||
| Single molecule array (Simoa) reagents | |||
| SBG, Bead and Detector Barcode Labels | Quanterix | 101652 | |
| 15 mL Reagent Bottles | Quanterix | 102411 | |
| Simoa specimen 96-well plates | Quanterix | 101457 | |
| Simoa Discs | Quanterix | 100001 | |
| Simoa 2.0 conductive Tips | Quanterix | 101726 | |
| Simoa Cuvettes | Quanterix | 100803 | |
| Simoa SBG Reagent | Quanterix | 102295 | |
| Simoa RGP Reagent | Quanterix | 101736 | |
| Simoa System Buffer 1 | Quanterix | 100486 | |
| Simoa System Buffer 2 | Quanterix | 100487 | |
| Sealing Oil | Quanterix | 100206 | |
| ddH2O | |||
| Simoa HD-1 Analyzer | Quanterix | 100032 | |
| Technologies | |||
| Single molecule array (Simoa) | Quanterix | ||
| Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems | Singluex |
References
- Isaacs, A., Lindenmann, J. Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).
- Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).
- Hunt, D., et al. Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta. N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).
- Hooks, J. J., et al. Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease. N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).
- Greenberg, S. A., et al. Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis. Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).
- Crow, Y. J. Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).
- Rodero, M. P., Crow, Y. J. Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview. J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).
- Lewis, J. A. A sensitive biological assay for interferons. J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).
- Meager, A. Biological assays for interferons. J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).
- Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies. Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).
- Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy. Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).
- Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons. Pharmacology. 84, 135-144 (2009).
- Li, Y., et al. Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).
- Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon. PLoS One. 6, e25858 (2011).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples. R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).
- Simoa. Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology. Whitepaper 1.0. , Quanterix Corp. 1-2 (2013).
- Chang, L., et al. Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations. J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).
- Yeung, D., et al. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum. J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).
- Song, L., et al. Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease. J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).
- Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy. PLoS One. 10, e0133236 (2015).
- Decalf, J., et al. Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies. EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).
- Rabing Brix Petersen, E., et al. Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology. J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).
- Disanto, G., et al. Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis. Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).
- Song, L., et al. A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics. Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).
- Passaes, C., et al. Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents. J. Virol. 91, e02296 (2017).
- Song, L., et al. Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays. Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).
- Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays. Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).
- Meyer, S., et al. AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies. Cell. 166, 582-595 (2016).
- Simoa. Homebrew Assay Development Guide. Simoa HD-1 Analyzer & Quanterix SR-X. User-0021 08. , Quanterix corporation. (2017).
- Rodero, M. P., et al. Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease. J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).
- Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation. J. Breath Res. 9, 047108 (2015).
- Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery. Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).
- Wilson, D. H., et al. The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing. J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).
- Rivnak, A. J., et al. A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood. J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).
- Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).
