Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Udvikling og validering af et Ultrasensitive enkelt molekyle Array Digital enzym-forbundet Immunosorbent Assay for menneskelige Interferon-α

doi: 10.3791/57421 Published: June 14, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at beskrive udviklingen og valideringen af et enkelt molekyle array digital ELISA assay, som gør det ultra-følsomme påvisning af alle IFN-α undertyper i menneskelige prøver.

Abstract

Hovedformålet med denne protokol er at beskrive udviklingen og valideringen af et interferon (IFN)-α enkelt molekyle array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. Dette giver mulighed for kvantificering af menneskelige IFN-α protein med hidtil uset følsomhed, og ingen krydsreaktivitet for andre arter af IFN.

Det første vigtige skridt i protokollen er valget af antistof parret, efterfulgt af konjugation af capture antistof til Paramagnetiske perler, og biotinylation af detektor-antistof. Efter dette trin, kan forskellige parametre såsom assay konfiguration, detektor-antistof koncentration og buffer sammensætning ændres, indtil den optimale følsomhed er opnået. Endelig vurderes specificitet og reproducerbarhed af metoden for at sikre tillid til resultaterne. Her, udviklede vi en IFN-α enkelt molekyle array assay med en grænse på påvisning af 0.69 fg/mL ved hjælp af høj-affinitet autoantistoffer isoleret fra patienter med biallelic mutationer i den autoimmune regulator (AIRE) protein forårsager autoimmune polyendocrinopathy syndrom type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrofi (APS1/APECED). Vigtigere, aktiveret disse antistoffer registrering af alle 13 IFN-α undertyper.

Denne nye metode giver mulighed for påvisning og kvantificering af IFN-α protein i menneskelige biologiske prøver på attomolar koncentrationer for første gang. Et sådant værktøj vil være meget nyttig i kontrol af niveauerne for denne cytokin i menneskers sundhed og sygdomstilstande, de fleste især infektion, autoimmunitet og autoinflammation.

Introduction

Type jeg IFNs er en familie af cytokiner, som spiller en central rolle i iscenesætte antivirale immunrespons. De blev først opdaget af Isaacs og Lindenmann 60 år siden1,2 , og det er nu kendt, at denne heterogene familie af polypeptider består af 14 forskellige underklasser (13 IFN-α undertyper og 1 IFN-β). Jeg IFNs er afgørende for regnskabsafslutningen for virale infektioner, men har også været impliceret i patologi af en række menneskelige sygdomstilstande, herunder autoimmune sygdomme systemisk lupus erythematosus (SLE), juvenil dermatomyositis (JDM), og typen Jeg interferonopathies i hvilke konstitutive type I IFN-induceret signalering-resultaterne i patologi3,4,5,6,7.

At studere type I-IFN protein niveauer i biologiske prøver har været udfordrende siden dets oprindelige identifikation som et "blande stof"1,2. I øjeblikket, er sandwich Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) den mest udbredte metode til påvisning af IFN-α protein. På trods af at være specifik, enkle og hurtige, type jeg IFN ringprøver præsentere vigtige begrænsninger, såsom begrænset følsomhed. Derudover kræver måling af alle IFN-α undertyper brug af flere assays hver med deres egen afsløring kapacitet og følsomhed. Mens der er kommercielle ringprøver, der registrerer forskellige undertyper af IFN-α, deres følsomhed er begrænset (1,95 pg/mL, 12,5 pg/mL og 12,5 pg/mL, henholdsvis) som er ofte utilstrækkelige til at opdage IFN-α protein i biologiske prøver. For at overvinde denne begrænsning, type flere biologiske proxy assays er blevet udviklet for at kvantificere I IFN-ved at måle induceret genekspression eller funktionelle aktivitet8,9,10,11, 12 , 13 , 14. alligevel disse assays giver ikke en direkte måling af IFN-α protein.

I denne undersøgelse, blev enkelt molekyle array digital ELISA teknologi brugt til at udvikle en analyse til påvisning af enkelt IFN-α proteinmolekyler. Digital ELISA udnytter det samme grundlæggende kemi som konventionelle ELISA, men reaktionen foregår i arrays bestående af 50.000 individuelle 46 femtoliter størrelse wells15,16. Enkelt proteinmolekyler er fanget af antistof-Paramagnetiske perler og markeret med en biotinylated detektor-antistof, efterfulgt af bindingen af et enzymkonjugat, streptavidin-β-galactosidase (SBG). Efterfølgende er perlerne suspenderet med et fluorogenic enzym-substrat, resorufin-β-D-galactopyranoside (RGP), til enkelt-molekyle arrays. Ved faldende volumen reaktion 2 milliarder gange17, en høj lokal koncentration af fluorescerende signal er opnået og enkelt molekyle tæller blive muligt, som hvert molekyle skaber et signal, som kan være pålideligt målt18. I det væsentlige er enkelt molekyle arrays i stand til at tælle enkelt immunocomplexes og fastlæggelse af et gennemsnitligt antal enzymer pr. perle (AEB). Tælle microwells som et signal detekteres tillader kvantificering/digitalisering af proteinmolekyler, som der er en direkte sammenhæng mellem proteinkoncentration og forholdet mellem immunocomplexed-perler og et samlet antal perler findes i femtoliter-store kamre.

Yeung mfl. udført en omfattende cross-platform evalueringsundersøgelse med ni forskellige teknologier og fire cytokin immunassays med formålet at sammenligne assay præcision, følsomhed og data sammenhæng på tværs af forskellige platforme19. Et af hovedresultaterne af undersøgelsen var, at enkelt molekyle arrays og enkelt molekyle tælle immunassay præsenteret den højeste følsomhed for påvisning af cytokiner i humant serum inden for sub-pg/mL koncentrationsområde. Enkelt molekyle array digital ELISA cytokin assays er blevet brugt til at studere rollen af TNF-α og IL-6 i Crohns sygdom20, IFN-α i interferonopathy og auto-immune patienter 7, og de forskellige post-translationally ændrede former for C-X-C motiv chemokine 10 (CXCL10) i kronisk hepatitis og raske donorer modtager sitagliptin21,22. Andre anvendelser omfatter måling af rhodopsin hos patienter med diabetisk retinopati23; undersøgelse af hjernen patologier gennem serum/plasma målinger af neurofilament lys24 og amyloid-β 1-42 peptid25, i forbindelse med multipel sklerose og Alzheimers sygdom, henholdsvis. Enkelt molekyle array assays kan også bruges til forbedret patogen detektion såsom karakterisering af HIV virus reservoir26, og også til påvisning af DNA27 og micro RNA'er28. En stor fordel ved enkelt molekyle array teknologi er denne høje alsidighed, som en assay mod enhver analysand af interesse kan udvikles, hvis en bestemt antistof par er tilgængelig. Derudover er homebrew assay kits kommercielt tilgængelig, så udviklingen af nye assays, protokol som er detaljeret beskrevet i en modificeret form nedenfor.

Her, præsenteres en detaljeret beskrivelse af trinene udvikling og validering for et enkelt molekyle array assay der resulterer i øget følsomhed for IFN-α protein påvisning. Antistoffer for enkelt molekyle array assays bør være meget specifikke, undgå cross reaktivitet med relaterede proteiner (med arter specificitet i betragtning, hvis relevant). Ideelt set bør være valgt antistoffer med en KD mindre end 10-9 M; høj affinitet sikrer stærke binding, med produktion af en højere signal. Kinetik af antigen-antistof-bindingen er også vigtig, og hurtig K og langsom Koff vil favorisere antigen-antistof kompleks samling. Start med et antistof-par, der har en god præstation i klassisk ELISA, med en grænse detektionsgrænsen (LOD) af 1-100 pg/mL, øger chancerne for at opnå en meget følsomme enkelt molekyle array assay. Chang og kolleger udført detaljerede kinetiske studier af Biomolekylær interaktioner forekommer ved hvert enkelt skridt, foreslår en række ligninger til at forudsige analytiske følsomhed18. De viste at enkelt molekyle array digital ELISA synes at være effektiv inden for en bred vifte af antistof tilhørsforhold (KD ~ 10−11 - 10−9 M), samt at signal generation er mere afhængige af på sats af sådanne antistoffer.

For at udnytte høj affinitet type antistoffer tog vi fordel af antistoffer isoleret fra patienter med autoimmune polyendocrinopathy syndrom 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrofi (APS1/APECED)29. Af grunde, der endnu ikke er forstået, det store flertal af AIRE-mangel enkeltpersoner udvikle et kernesæt af høj-aviditet antistoffer mod alle IFN-α undertyper29og vi valgt to anti-IFN-α antistof kloner af supplerende bindende tilhørsforhold for de forskellige IFN-α undertyper, som anslået af IC50 værdier. Kombinationen af disse unikke høj-affinitet antistoffer med enkelt molekyle array teknologi aktiveret direkte kvantificering af IFN-α på attomolar (fg/mL) koncentrationer. Sådanne ultrasensitive IFN-α protein registrering vil bidrage til en bedre forståelse af naturen, regulering og biologiske effekt af IFN-induceret response i forskellige sygdom indstillinger.

Protocol

1. udvælgelse af antistoffer

  1. Før du begynder protokollen kontrollere alle vigtige trin (tabel 1) og vælg optimal antistoffer.
    Bemærk: For denne protokol høj affinitet anti-IFN-α antistoffer - IC50 som er beskrevet i tabel 2 blev valgt. Fortrinsvis, vælge et par, der fungerer godt med konventionelle ELISA.

2. konjugation af Capture antistof til Paramagnetiske perler og afprøvning af forskellige koncentrationer

Bemærk: Hold altid perle konjugation Buffer (BCB) og perle Wash Buffer (BWB) på isen under antistof konjugation proces.

  1. Fange antistof Buffer Exchange
    1. Tage indledende mængder af anti-IFN-α antistof A for at teste 3 forskellige perle bøjninger nøgletal (0,038 mg/mL, 0.075 mg/mL og 0,3 mg/mL).
      Bemærk: Lav antistof belægning koncentrationer kan være gavnligt, hvis analysen præsenterer en høj baggrund signal. Indledende antistof mængde bør udgøre en anslået 30% tab under buffer exchange proces. Ifølge producentens anvisninger og for at mindske oprindelige baggrund blev koncentrationer af 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL og 0,3 mg/mL testet, selv om disse nøjagtige værdier blev ofte ikke fås på grund af de ovennævnte variable tab i bufferen Exchange proces.
    2. Tilføje den krævede mængde af antistof i en filterkolonne sammen med BCB, op til 500 µL.
    3. Centrifugeres kolonner på > 10.000 x g til 5 min og kassér gennemstrømnings-.
    4. Kolonnen udvaskes to gange ved at tilføje en samlet maengde paa 450 µL af BCB efterfulgt af centrifugering ved > 10.000 x g i 5 min og kassér flow gennem.
    5. Placer filterkolonne indeholder antistof i en ren microcentrifuge tube hovedet - den åbne del af kolonnen vender indersiden af de nye rør - og centrifugeres ved 800 x g i 1 min.
      Bemærk: Dette trin vil mulighed for samling af de rensede antistof. Ingen buffer tilføjelse er nødvendig for dette trin.
    6. Vask membraner med 50 µL BCB og centrifugeres ved 800 x g i 1 min i 2.1.5.
    7. Mål koncentrationen af antistof ved hjælp af en lav lydstyrke Spektrofotometer.
    8. Tilføje BCB for at opnå den ønskede antistof koncentration og Bemærk det endelige rumfang.
      Bemærk: Et rumfang på 200 µL vil blive brugt til at beskrive resten af protokollen, denne diskenhed bliver benævnt 2 bind (2V). Alle de følgende reagens mængder vil blive tilpasset i overensstemmelse hermed.
    9. Vortex og holde på is.
  2. Paramagnetiske perle forberedelse
    1. Overførsel 2,8 x 108 perler (100 µL = 1V) ind i et mikrofuge rør.
      Bemærk: Mængden af perler er afhængig af det endelige rumfang fremstillet i 2.1.8.
    2. Puls spin og sætte i en magnetisk separator for 1 min, kassere fortyndingsmiddel, og fjerne fra magnet.
    3. Tilføje 2V BWB og vortex for 5 s.
    4. Gentag 2.2.2 og 2.2.3 to gange med BWB og to gange med BCB.
    5. Tilføje 190 µL BCB, vortex 5 s, pulse spin 1V af perler, og gemme de vasket perler på is.
  3. Perle aktivering
    1. Der tilsættes 1 mL af kolde BCB til et 10-mg hætteglas af 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochlorid (EDC) og vortex indtil løsningen er homogen.
    2. 1V af perler tilføje 10 µL af kolde fortyndet EDC vasket perler, vortex og holde i en shaker ved 1000 rpm i 30 min. ved stuetemperatur.
      Bemærk: EDC forberedelse og tilføjelse til perlerne bør ske så hurtigt som muligt på grund af EDC ustabilitet i vandige opløsninger. Også, som EDC er meget reaktive, det er vigtigt at have en homogen perle suspension før EDC tilsætning for at forhindre heterogene perle aktivering. Efter EDC, skal perler opbevares i suspension.
  4. Perle konjugation af antistoffet
    1. Vortex og puls spin de aktiverede perler. Nu sætte perlerne i en magnetisk separator for 1 min, kassere BCB supernatanten og fjerne røret fra magneten.
    2. Vask perler med 2V af BCB. Vortex, puls spin, og sætte i den magnetisk separator for 1 min. Derefter kasseres BCB buffer og fjerne perlerne fra magneten.
    3. Hurtigt tilføje den kolde, buffer-udvekslet 200 µL (2V) af antistof til de aktiverede perler.
    4. Vortex og holde i 2 timer i shaker ved stuetemperatur.
  5. Perle blokering og endelige Clean-up
    1. Puls spin suspension antistof-perler sat i den magnetisk separator for 1 min, overføre supernatanten til en ny tube og måle koncentrationen med en lav lydstyrke Spektrofotometer.
      Bemærk: Dette trin vil give oplysninger om hvorvidt perlerne er mættet - værdier over nul angiver perle mætning - som opløselige antistof ikke bindes til perlerne vil kunne måles.
    2. Fjerne de konjugerede perler fra magneten, tilføje 2V af BWB, vortex for 5 s, pulse spin og læg i en magnetisk separator for 1 min.
    3. Overføre supernatanten til en ny tube og måle koncentrationen ved hjælp af en lav lydstyrke Spektrofotometer.
      Bemærk: Dette trin vil give oplysninger om hvorvidt antistofferne er stabilt fastgjort til perlerne. Påviseligt antistof koncentration i denne supernatanten vil angive udstationering af antistoffet fra perler, hvilket sker regelmæssigt. Denne analyse virker ofte, selv når meget små mængder af capture antistof forbliver knyttet til perlerne.
    4. Fjerne de konjugerede perler fra magneten, tilføje 2V af BWB, vortex for 5 s, pulse spin og læg i en magnetisk separator for 1 min.
    5. Fjern konjugeret perler fra magneten, tilføje 2V perle blokerende buffer, vortex for 5 s, og Inkuber i shaker i 30 min. ved stuetemperatur.
    6. Vask de enkelte antistof-coatede og blokerede perler 3 x med 2V, én gang med BWS, og 2 x med perle fortyndingsmiddel Buffer (kassere alle supernatanter).
    7. Gemme de belagt og blokerede perler ved 4° C indtil brug med 2V perle fortyndingsmiddel buffer.
      Bemærk: Lige før brug, perler skal vaskes en gang med detektor/prøve fortynder med et volumen på 250 x perle volumen/20, ved hjælp af en magnetisk separator.

3. detektering antistof Biotinylation

  1. Påvisning antistof Buffer Exchange
    1. Tage 260 µg af to anti-IFN-α Ab kloner.
      Bemærk: Det tager hensyn til en 30% tab under buffer udveksling og tillader test af to forskellige biotin/antistof nøgletal.
    2. Fortsætte som 2.1 med Biotinylation reaktion Buffer (BRB) i stedet for BCB.
    3. Måle volumen og antistof koncentrationer og justere lydstyrken for at opnå en endelig koncentration på 1 mg/mL.
      Bemærk: Dette er en foreslået start koncentration, men det kan optimeres, hvis analysen ikke opnå den fornødne følsomhed.
  2. Påvisning antistof Biotinylation
    1. Bringe N-hydroxysuccinimide-polyethylen-glycol4-biotin (NHS-PEG4-Biotin) til stuetemperatur og resuspend med ialt 400 µL destilleret vand til at opnå en 3,4 mM koncentration.
    2. Beslutte biotin: antistof forholdet til test og bland detektor-antistof og fortyndet biotin i overensstemmelse hermed (60:1 ratio er lig 100 µL af detektor-antistof og 4,5 µL af biotin).
      Bemærk: For at begynde, teste 30: 1 og 60:1 nøgletal.
    3. Vortex antistof-biotin blandingen, puls spin og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur.
      Bemærk: Ingen grund til at ryste.
  3. Biotinylated påvisning antistof rensning
    1. Overføre biotinylated antistof til et nyt filter og fortsætte som 2.1, udfører 3 vask trin med BRB (400, 450, og 450 µL) og en afsluttende samling.
    2. Måle volumen og koncentration af renset, biotinylated påvisning antistof og opbevares ved 4 ° C indtil brug.

4. indhold optimering

Bemærk: Brug af enkelt molekyle array analyzer software i en Homebrew konfiguration30.
Enkelt molekyle array analyzer maskine er kontrolleret af software, der gør det muligt for at køre assay standardiseringer, for at udføre prøven kvantificeringer, for at ændre parametre for eksterne (perle, detektor, SBG, RGP koncentrationer; prøve fortyndinger...) og interne parametre (antallet af trin, inkuberingstider...) at opnå optimal assay betingelser, og kan også bruges til at beregne resultater (baggrund, LOD, mængder). Se producentens instruktioner for installation af enkelt molekyle array analyzer og til at beregne reagens diskenheder kræves for hver runde af optimering. Udføre de første runder af optimering ved hjælp af en 2-trins konfiguration.

  1. Teste kombinationer af capture antistof konjugeret perler og biotinylated detektor-antistof i begge konfigurationer.
    1. Teste kombinationer af de tre forskellige anti-IFN-α A fange antistof koncentrationer med to forskellige anti-IFN-α B biotinylation nøgletal som afsløring og fange antistoffer, og vice versa (figur 1) ved udvælgelse af de relevante betingelser i analyzer software.
    2. Vælge den mest følsomme kombination, dvs de betingelser, der tilbyder den laveste LOD, og bruge det til yderligere trin
      Bemærk: Figur 1 viser hvordan en 0,3 mg/mL anti-IFN-α en antistof perle koncentration og biotin: antistof forholdet 30: 1 med anti-IFN-α B antistof resulterede i den højeste følsomhed, som det fremgår af et LOD på 11,6 fg/mL. (Se supplerende tabel 1). Denne kombination bruges for alle fremtidige skridt. Bemærk, at den store følsomhed opnået med denne særlige assay før enhver runder af optimering.

Figure 1
Figur 1: udvælgelse af antistof orientering, fange antistof koncentration på perler og biotinylation ratio. De to forskellige konfigurationer blev testet, ved hjælp af anti-IFN-α A som fange antistof, og anti-IFN-α B som påvisning antistof (A), og vice versa (B). IFNα - 2c blev brugt som antigen. Forskellige capture antistof koncentrationer samt biotin: antistof (B:A) nøgletal blev også testet for både konfigurationer. Stiplede linje viser LOD for den bedste tilstand; anti-IFN-α en 0,3 mg/mL som opsamling og anti-IFN-α B biotin: detektor-antistof forholdet mellem 30 (LOD = 11,6 mg/mL, svarende til en AEB værdi af 0.017265). En 2-trins konfiguration blev brugt. Biotin: antistof (B:A). venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Sammenligne en 2 vs 3-trins konfiguration.
    Bemærk: I en 3-trins konfiguration, der er tre forskellige inkubation trin, den ene med capture-antistof, en med detektor-antistof og en endelig tredje én for SBG enzym mærkning. Dog i en 2-trins konfiguration, fange og registrering af antistoffer er udruget samtidig med analysand af interesse.
    1. Køre enkelt molekyle array analyzer med opsamling og detektor-antistof koncentration og nøgletal fra 4.1.2 at vælge 2 og 3-trins konfigurationer præ-konfigureret i analysatoren, følgende producentens instruktioner30.
    2. Vælge den konfiguration, der giver mulighed for de højeste følsomhed og holde det for fremtidige skridt
      Bemærk: Som vist i figur 2 og supplerende tabel 2, 2-trins konfiguration gav lidt højere følsomhed og signal/baggrund ratio for hver koncentration testet. Derfor, den 2-trins konfiguration blev holdt for fremtidige skridt.

Figure 2
Figur 2:2 vs 3-trins konfiguration sammenligning. 2 og 3-trins konfigurationer blev vurderet ved hjælp af 0,3 mg/mL af anti-IFN-α en antistof som opsamling og anti-IFN-α B som detektor-antistof i forholdet 30 biotin: antistof. IFNα - 2c blev brugt som antigen. I en 3-trins tilstand indstilling er der tre forskellige inkubation trin, ét med capture-antistof, en med detektor-antistof og en afsluttende tredie SBG enzym mærkning. Dog i en 2-trins konfiguration, fange og registrering af antistoffer er udruget samtidig med analysand af interesse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Detektor-antistof og SBG koncentration optimering
    1. Teste tre forskellige koncentrationer af detektor-antistof (0,1, 0,3 og 0,6 µg/mL) sammen med tre forskellige koncentrationer af SBG (50, 150 og 250 pM) som beskrevet ovenfor30.
    2. Vælg de koncentrationer, der giver den højeste følsomhed og holde dem for fremtidige skridt.
      Bemærk: Figur 3 viser detektoren 0,3 µg/mL og SBG 150 pM var de betingelser, der viste den optimale LOD. Disse betingelser gav også lav baggrundsniveauer og medium amplitude, en adfærd, der producerer gode standardafvigelse (SD) værdier (supplerende tabel 3). Typiske koncentrationer mellem 0,1 - 1 µg/mL for detektor-antistof og 50-200 pM for SBG, selv om højere koncentrationer (f.eks. op til 300 pM) sidstnævnte kan være påkrævet. Det er vigtigt at undgå forhold, der vil gøre baggrunde højere end 0,02 AEB. Øger koncentrationen af detektor monoklonale antistof (mAb) eller SBG vil forbedre både signal reaktion og baggrund. Men hvis tilvækst i signal overvinder ændringen i baggrunden, LOD vil forbedre. Kan opstå en situation, hvor et fald i baggrunden giver bedre forskelsbehandling mellem lav kalibratorer.

Figure 3
Figur 3: detektor og SBG koncentration optimering. Tre forskellige koncentrationer af biotinylated detektor antistof (0,1, 0,3 og 0,6 µg/ml) sammen med tre forskellige koncentrationer af SBG (50, 150 og 250 pM) blev vurderet. Stiplede linje viser LOD for den bedste tilstand; detektor-antistof på 0,3 mg/mL og SBG 150 pM (LOD = 0,09 mg/mL, svarende til en AEB værdi af 0.017184). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Yderligere optimering trin
    1. Hvis den fornødne følsomhed ikke er opnået, teste forskellige inkuberingstider for de forskellige trin ved hjælp af forudkonfigurerede indstillinger i analyzer software.
    2. Hvis analysen ikke er følsomhed nok, optimere antallet af perler per analyse ved hjælp af forudkonfigurerede indstillinger i analyzer software.
      Bemærk: Når afprøvning af biologiske prøver begynder, sample volumen er en ekstra parameter, der er modtagelige for optimering. Sørg for, at prøverne håndteres efter procedurerne, sundhed og sikkerhed.

5. indhold specificitet og reproducerbarhed

  1. Teste IFN-α assay specificitet, ved at teste assay med forskellige IFN-α undertyper og andre relaterede proteiner (figur 4a og 4b).

Figure 4
Figur 4: specificiteten og følsomheden af optimeret IFNα enkelt molekyle array assay. (A) IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω og IFN-γ rekombinante proteiner blev testet, samt b 16 undertyper af IFN-α, herunder tre IFN-en2 typer (IFN-α2a, IFN-α2b og IFN-α2c). Tilpasset fra Rodero mfl. 2017. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Vurdere reproducerbarhed af optimeret analysen ved at udføre tre uafhængige Repliker eksperimenter og vurdere Inter assay variation (figur 5).
  2. Beregne LOD assay
    Bemærk: LOD blev beregnet ved hjælp af gennemsnittet af de tre tomme + 3 standardafvigelserne (SD), hvorved man får en værdi på 0,23 fg/mL. Fortyndingsfaktoren standardprøve er 1:3, giver inddragelse af fortyndingsfaktoren et LOD på 0,69 fg/mL.

Figure 5
Figur 5: reproducerbarhed af optimeret pan-IFN-α enkelt molekyle array assay. Tre uafhængige kører blev udført ved hjælp af to forskellige masser af perler. For det andet parti, blev to uafhængige eksperimenter udført. Hver måling blev erhvervet i dubletter. Den prikkede linje repræsenterer den LOD, defineret af betyde Tom gennemsnitlige enzym pr. perle + SD over alle kørsler. IFN-α17 blev brugt som reference, under hensyntagen til at den afledte standardkurven er repræsentative for alle andre IFN-α undertyper, som vist i figur 4b. Plot viser middelværdien og SD (fejllinjer). Stiplede linjer viser LOD for de forskellige kørsler; Køre 1: 0.073 fg/mL AEB = 0.006238, køre 2: 0,113 fg/mL AEB = 0.007119, køre 3: 0.043 fg/mL AEB = 0.05518). Tilpasset fra Rodero mfl. 2017. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

6. protein konkurrence analyse

  1. Udføre en protein konkurrence analyse (beskrevet i figur 6 legende) at yderligere demonstrere specificiteten af analysen.
    Bemærk: Plasmaprøver fra patienter med SLE (n = 5) blev brugt.
    1. Når virus er mistænkt for at være til stede i den biologiske prøve, forberede inaktivering buffer ved at tilføje 200 µL af en ikke-ioinic overfladeaktivt stof (0,5% nonidet P40 stedfortræder) 40 mL detektor/prøve fortynder og vortexes kraftigt.
    2. Der centrifugeres biologiske prøver indeholder analysand af interesse ved 10.000 g i 15 min. ved 4 ° C for at fjerne celleaffald.
    3. Mix 185 µL detektor/fortyndingsmiddel eller inaktivering prøvebuffer med 100 µL biologisk prøve (endelig fortyndingsfaktor 3) og 15 µL anti-IFN-α antistof A (indledende koncentration på 1 mg/mL, slutkoncentration 50 ug/mL) eller buffer. Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur.
    4. Køre prøver med og uden anti-IFN-α antistof i enkelt molekyle array analysatoren som beskrevet ovenfor.
      Bemærk: I tilfælde af signal mætning, prøver bør være fortyndes yderligere. 300 µL er også volumen kræves for dobbeltanalyse.

Figure 6
Figur 6: Protein konkurrence assay. Konkurrence eksperimenter blev udført ved brug af prøver fra fem forskellige SLE patienter. Biologiske prøver var centrifugeres ved 10.000 g i 15 min. ved 4 ° C. De blev fortyndet til 1/3 med detektor/prøve fortyndingsmiddel indeholder NP40 for viral inaktivering. 15µl af anti-IFN-α antistof A (indledende koncentration på 1 mg/mL, slutkoncentration 50 µg/mL) eller buffer blev tilføjet til en samlet maengde paa 300 µL. inkubation blev udført ved stuetemperatur i 30 min. kontrolgruppen er vist med gråt og prøver behandles med anti-IFN-α A antistof er vist i sort. Grafen viser middelværdien og SD (fejllinjer). Prikkede linje repræsenterer LOD (AEB = 0.024774, 0.8037 fg/mL). Tilpasset fra Rodero et al. 2017 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Representative Results

I Resumé belagt en pan-IFN-α enkelt molekyle array assay med en grænse på påvisning af 0.69 fg/mL, med en 2-trins konfiguration med capture perler med 0,3 mg/mL af anti-IFN-α et antistof, og anti-IFN-α B påvisning antistof biotinylated i biotin: antistof forholdet 30 blev udviklet. Koncentrationerne anvendes til biotinylated påvisning antistof og SBG var 0,3 µg/mL og 150 pM, henholdsvis. Denne meget specifikke assay er i stand til at afsløre alle 13 IFN-α undertyper og reagerer ikke krydser med andre slags IFNs. Således, mens det ikke er muligt at identificere og kvantificere hver enkelte arter af IFN-α, alle af dem kan påvises og målt sammen giver en samlet koncentration værdi for IFN-α, der består af 13 forskellige underklasser.

For at udforske den potentielle diagnostiske værdi af denne nyudviklede assay, IFN-α protein i plasma og serum fra raske personer blev målt og sammenlignet med prøver fra patienter med SLE og JDM. Som illustreret i figur 7, blev høje niveauer af IFN-α protein opdaget i begge sygdom kohorter i forhold til raske kontrolpersoner. Den stiplede linje angiver LOD af en konventionel kommercielt tilgængelige ELISA, illustrerer, hvordan denne fremgangsmåde ville ikke afsløre IFN-α protein i disse patientgrupper trods de kendte sammenslutninger af dette cytokine med disse fænotyper. IFN-α kan desuden kvantificeres over 5 logs af størrelsesorden, illustrerer den bredt dynamikområde assay med påviselige mængder mellem 1-10 fg/mL bekræfter den meget følsomme karakter af analysen.

Figure 7
Figur 7: kvantificering af IFN-α protein i plasma og serum fra patient kohorter. Dette tal er blevet ændret fra Rodero mfl. 2017. plasma fra raske kontrolpersoner (n = 20) og patienter med SLE (n = 72) og JDM (n = 43) blev testet med pan-IFNα enkelt molekyle array assay. Analyse blev udført ved hjælp af en-vejs ANOVA test (Kruskal-Wallis) og Dunns flere sammenligning test mellem grupper. Medianen er afbildet. Stiplede linje angiver LOD af en reference menneskelige anti-IFN-α ELISA (1,95 pg/mL = 1950 fg/mL). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Trin Overvejelser Reference
1. antistof par valg Mål forskellige epitoper Tabel 2
Høj affinitet
Hurtigt K/ langsom Kud
2. antistof par orientering Vælg betingelser med den laveste grænse påvisning Figur 1
3. fange antistof koncentration
4. biotin: detektor antistof forholdet
5. 2 vs 3-trins konfiguration Vælg betingelse med højeste Signal: baggrund forholdet Figur 2
6. detektor-antistof koncentration Vælg betingelser med den laveste grænse påvisning Figur 3
7. SBG koncentration
8. specificitet Vurdere krydsreaktivitet Figur 4
9. følsomhed Vurdere anerkendelse af undertyper (hvis relevant)
10. reproducerbarhed Vurdere assay variation Figur 5

Tabel 1: oversigt over trin til udvikling og optimering af et enkelt molekyle array assay. Denne tabel er en oversigt over de forskellige trin, der kræves til udvikling og optimering af et enkelt molekyle array assay, fra de første valg af antistof par indtil vurderingen af reproducerbarhed.

Antigen 8H 1 (A) 12H 5 (B) Sifalimumab Rontalizumab
IFNΑ1 28.3 51,3 460 22,63
IFNΑ2 2563 10.7 9.02 2.15
IFNΑ4 5.11 2,99 35.35 325.3
IFNΑ5 2,01 19,6 93.29 2,49
IFNΑ6 64.7 3,03 4,97 -
IFNΑ7 0,9 0,63 233.1 -
IFNΑ8 302 0,83 691 10.86
IFNΑ10 2,54 0,71 43.2 -
IFNΑ14 3224 2.1 14.52 0,9
IFNΑ16 1.83 32,99 59.18 28.65
IFNΑ17 2.21 0,77 890.9 23.86
IFNΑ21 2.78 12.87 1769 5.8

Tabel 2: Pan-alfa antistof udvalg. IC50 (ng/mL) bestemmes ved hjælp af interferon-stimuleret svar element (ISRE)-Luciferase neutralisering assay. Tabellen viser IC50 værdier af mAbs bruges i enkelt molekyle array assay for alle IFN-α undertyper. 10.000 HEK 293 MSR celler var seedede i hvid halv-området 96-brønd plader og omvendt-transfekteret med 50 ng forblandet ISRE-Firefly luciferase reporter og Renilla luciferase konstruktioner Transfektion reagenser ifølge producentens anvisninger. Den luciferase-udtrykker konstruktion fungerede som en indre normalisering kontrol. Celler blev inkuberet natten over i reduceret Serum Medium suppleret med 0,1 mM uvæsentlige aminosyrer, 1 mM natrium pyruvat, 0,5% føtal bovint serum ved 37 ° C, 5% CO2 i en fugtig atmosfære. Efter natten inkubation, blev celler stimuleret i 24 timer med medium, der indeholder blandinger af rekombinant humant IFN-α med eller uden anti-IFN-α mAbs eller kontrol IgG, der havde været forinkubereret i 1 timer ved 37 ° C. Efter 24 timer af stimulation, blev dobbelt luciferase reporter assays udført ifølge producentens anvisninger. «-» Ikke bestemmes. Sifalimumab er en fuldt humant, immunoglobulin G1 κ monoklonalt antistof, der bindes til og neutraliserer fleste af IFN-α undertyper; Rontalizumab er en humaniseret monoklonalt antistof mod IFN-α. Tilpasset fra Meyer et al. 2016 og Rodero et al. 2017.

Supplerende tabel 1: udvælgelse af antistof orientering, fange antistof koncentration på perler og biotinylation ratio. De to forskellige konfigurationer blev testet, ved hjælp af anti-IFN-α A som fange antistof, og anti-IFN-α B som påvisning antistof (A), og vice versa (B). IFNα - 2c blev brugt som antigen. Forskellige capture antistof koncentrationer samt biotin: antistof (B:A) nøgletal blev også testet for både konfigurationer. Mætning (lør). Orange: AEB værdier, der blev brugt til beregning af LOD; disse koncentrationer blev anset for Tom som AEB værdier forblev stabil. LOD blev beregnet som betyder tomme + 3SD. venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 2: Test af 2 vs 3-trins konfigurationen. De 2- og 3 - trin konfigurationer blev vurderet ved hjælp af IFNα - 2c som antigen. AEB værdier er såvel som signal/baggrund rationer (S/B) vist for begge betingelser. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 3: detektor og SBG koncentration optimering. Tre forskellige koncentrationer af biotinylated detektor antistof (0,1, 0,3 og 0,6 µg/mL) sammen med tre forskellige koncentrationer af SBG (50, 150 og 250 pM) blev vurderet. AEB værdier er vist for de ni testede betingelser. Orange: AEB værdier, der blev brugt til beregning af LOD; disse koncentrationer blev anset for Tom som AEB værdier forblev stabil. LOD blev beregnet som betyder tomme + 3SD. venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 4: specificiteten og følsomheden af optimeret IFNα enkelt molekyle array assay. Gennemsnitlige enzym pr. perler værdier vises når IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω og IFN-γ rekombinante proteiner var testet (A), sammen med de 16 undertyper af IFN-α (B). «-» Ikke bestemmes. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 5: reproducerbarhed af optimeret IFNα enkelt molekyle array analysen. AEB middelværdier for alle tre uafhængige kører er vist til en koncentration på 10.000 fg/mL. «-» Ikke bestemmes. Mætning (lør). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 6: Protein konkurrence assay. Gennemsnitlige enzym pr. perler værdier er vist for alle betingelser testet. Målinger blev udfærdiget i to eksemplarer. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Vi beskrevet heri, udvikling og validering af et stærkt reproducerbar, ultrasensitive enkelt molekyle array digital ELISA til direkte kvantificering af IFN-α protein i menneskelige prøver (trin opsummeret i tabel 1). Et af de mest afgørende skridt i udviklingen af analysen er valget af antistof par16, med kinetik og epitop bindende er nøglen til en vellykket assay. Det er vigtigt at undgå brug af parret monoklonale antistoffer at målrette den samme epitop eller at forårsage sterisk hindring. Polyklonale antistoffer kan bruges som påvisning antistoffer til at overvinde sådanne begrænsninger. Hvis den ønskede følsomhed ikke opnås ved enhver given skridt, bør yderligere optimering muligheder overvejes. Dette kan omfatte anvendelse af alternative antistof par, ændringer i parametre såsom protein type (f.eks. BSA < kasein), pH (6.0-8,5), ionisk styrke, stødpudeevne (fx NaCl og fosfat koncentrationer), carrier perler og/eller forekomsten af overfladeaktive stoffer. En lang række parametre optimeres con ved udvikling af et enkelt molekyle array assay. Dog samlet set betingelser, der giver høj signal: baggrund nøgletal og minimal bestemmelsesgrænseværdier er dem, foretrak (Se figur 1, figur 2og figur 3).

Vedrørende specificitet, IFN-α-Analysen viste ingen cross reaktivitet for eventuelle andre IFNs testet (β, γ, λ1, λ2, ω) (figur 4a) og var i stand til at afsløre alle 13 IFN-α undertyper (figur 4b). Analysen viste imidlertid en lavere affinitet for IFN-en2 subtype, (figur 4b og supplerende tabel 4). Interessant, blev forskellige følsomheder for de forskellige klasser af IFN-en2 (a, b, c) også observeret, hvilket kan skyldes forskellige fremstillings procedurer eller forskellige aminosyre-sekvenser, som IFN-en2 undertyper blev indhentet fra forskellige kommercielle leverandører. Med denne undtagelse gav alle IFN-α arter meget lignende svar. Specificiteten af analysen blev finpudset af forbehandling af prøver med anti-IFN-α en klon, som ophævet signal (figur 6 og supplerende tabel 6).

En af de vigtigste fordele ved denne teknologi er, at enhver analysand af interesse potentielt kan være målrettet16. Derudover kan forskellige biologiske prøver testes, serum, plasma, cerebrospinalvæske, cellulære lysates, kultur analysere31 og selv ånde32. Normalt, er en 1:3 fortynding af plasma udført for at undgå potentielle tilstopning af enkelt molekyle array analyzer. Men analysand af interesse kunne være til stede ved meget lave koncentrationer i de relevante biologiske prøve og højere koncentrationer af prøven kan være nødvendig (afhængigt af assay følsomhed)33. Selv om der er potentiale for multiplexing samtidig opretholde god følsomhed34, er det en mere udfordrende proces og assays til måling af større end 6 proteiner inden for de samme eksperimenter har endnu at være udviklet35.

Evne til at detektere og kvantificere cytokiner og andre biologiske relevante proteiner ved sådanne lave koncentrationer åbner op for en helt ny vifte af applikationer33,36. Det er velkendt, at mange proteiner udøve deres virkninger selv i meget lave koncentrationer, som indtil nu lå under detektionsgrænsen for den bedste ringprøver37. Mens andre immunoassay teknologi tilbyder fordele i forhold til konventionelle ELISA19, viser vi her, enkelt molekyle array digital ELISA er reproducerbare og robust platform for den ultrasensitive påvisning af lav koncentration cytokiner i menneskelige prøver. Som sådan, tilbyder denne teknologi enorme potentiale for biomarkør opdagelse og forbedret patient forvaltning af en lang række sygdomme.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

DD og YJC anerkender støtte fra ANR (projekt IFNX, ingen. CE17001002) og ImmunoQure AG til at give monoklonale antistoffer. Vi takker Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki og Pierre Quartier for at levere kliniske prøver. YJC anerkender det Europæiske Forskningsråd (GA 309449: stipendium til YJC), og statslige subsidier forvaltes af nationale forskning agentur (Frankrig) under programmet "Investeringer for the Future" forsynet med henvisning ANR-10-IAHU-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone eBioscience BMS216C
Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone eBioscience BMS216BK Not an ELISA kit but bulk abs
IFN α2c eBioscience BMS305 OK
IFN αI (17) PBL 11150-1
IFN α2a PBL 11100-1
IFN α2a PeproTech No longer available
IFN α2b PBL 11105-1
IFN α1 PBL 11175-1
IFN α4a (M1) PBL 11177-1
IFN α4b (a4) PBL 11180-1
IFN αB2 (a8) PBL 11115-1
IFN αC (a10) PBL 11120-1
IFN αD (a1) PBL 11125-1
IFN αG (a5) PBL 11135-1
IFN αF (a21) PBL 11130-1
IFN αH2 (a14) PBL 11145-1
IFN αJ1 (a7) PBL 11160-1
IFN αK (a6) PBL 11165-1
IFN αWA (a16) PBL 11190-1
IFN λ1 PeproTech 300-02L
IFN λ2 PeproTech 300-02K
IFN ω PeproTech 300-02J
IFN β PeproTech 300-02BC
IFN γ PeproTech 300-02
Anti-IFN-α ELISA PBL 41115.1
96-well plates Corning 3904
ISRE-Reporter Qiagen CCS-008L
Fu-GENE HD Transfection Reagent Promega E2311
Opti-MEM Reduced Serum Mediuem ThermoFischer Scientific 31985062
Dual-Luciferase Reporter assay Promega E1910
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Spectrophotometer NanoDrop 1000 Thermo Scientific No longer available
Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres Merck Millipore UFC505096
Bead Conjugation Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Non-Encoded Paramagnetic Beads Quanterix 101360
Bead Wash Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
EDC Fisher Scientific 11844071
Bead Blocking Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Bead Diluent Buffer Quanterix 101362
Detector and Sample Diluent Quanterix 101359
Biotinylation Reaction Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
NHS-PEG4-Biotin Fisher Scientific 11891195
diH2O
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) Thermo Scientific 75002478
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) IKA MS2
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
1.7mL microcentrifuge tubes Eppendorf
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) ThermoFisher Scientific 12321D
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) VWR 521-2844
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) Eppendorf
Single molecule array (Simoa) reagents
SBG, Bead and Detector Barcode Labels Quanterix 101652
15 mL Reagent Bottles Quanterix 102411
Simoa specimen 96-well plates Quanterix 101457
Simoa Discs Quanterix 100001
Simoa 2.0 conductive Tips Quanterix 101726
Simoa Cuvettes Quanterix 100803
Simoa SBG Reagent Quanterix 102295
Simoa RGP Reagent Quanterix 101736
Simoa System Buffer 1 Quanterix 100486
Simoa System Buffer 2 Quanterix 100487
Sealing Oil Quanterix 100206
ddH2O
Simoa HD-1 Analyzer Quanterix 100032
Technologies
Single molecule array (Simoa) Quanterix
Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems Singluex

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Isaacs, A., Lindenmann, J. Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).
  2. Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).
  3. Hunt, D., et al. Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta. N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).
  4. Hooks, J. J., et al. Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease. N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).
  5. Greenberg, S. A., et al. Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis. Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).
  6. Crow, Y. J. Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).
  7. Rodero, M. P., Crow, Y. J. Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview. J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).
  8. Lewis, J. A. A sensitive biological assay for interferons. J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).
  9. Meager, A. Biological assays for interferons. J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).
  10. Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies. Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).
  11. Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy. Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).
  12. Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons. Pharmacology. 84, 135-144 (2009).
  13. Li, Y., et al. Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).
  14. Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon. PLoS One. 6, e25858 (2011).
  15. Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
  16. Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples. R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).
  17. Simoa. Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology. Whitepaper 1.0. Quanterix Corp. 1-2 (2013).
  18. Chang, L., et al. Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations. J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).
  19. Yeung, D., et al. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum. J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).
  20. Song, L., et al. Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease. J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).
  21. Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy. PLoS One. 10, e0133236 (2015).
  22. Decalf, J., et al. Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies. EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).
  23. Rabing Brix Petersen, E., et al. Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology. J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).
  24. Disanto, G., et al. Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis. Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).
  25. Song, L., et al. A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics. Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).
  26. Passaes, C., et al. Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents. J. Virol. 91, e02296 (2017).
  27. Song, L., et al. Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays. Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).
  28. Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays. Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).
  29. Meyer, S., et al. AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies. Cell. 166, 582-595 (2016).
  30. Simoa. Homebrew Assay Development Guide. Simoa HD-1 Analyzer & Quanterix SR-X. User-0021 08. Quanterix corporation. (2017).
  31. Rodero, M. P., et al. Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease. J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).
  32. Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation. J. Breath Res. 9, 047108 (2015).
  33. Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery. Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).
  34. Wilson, D. H., et al. The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing. J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).
  35. Rivnak, A. J., et al. A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood. J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).
  36. Anderson, N. L., Anderson, N. G. The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).
  37. Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).
Udvikling og validering af et Ultrasensitive enkelt molekyle Array Digital enzym-forbundet Immunosorbent Assay for menneskelige Interferon-α
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Llibre, A., Bondet, V., Rodero, M. P., Hunt, D., Crow, Y. J., Duffy, D. Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α. J. Vis. Exp. (136), e57421, doi:10.3791/57421 (2018).More

Llibre, A., Bondet, V., Rodero, M. P., Hunt, D., Crow, Y. J., Duffy, D. Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α. J. Vis. Exp. (136), e57421, doi:10.3791/57421 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter