Summary
Этот протокол описывает метод подготовки обогащенного устьиц клеток гвардии, которая является полезной для физиологических и биологических исследований.
Abstract
Исследование клеток охранник имеет важное значение для знания конкретного вклада этого типа ячейки для общей функции растений. Однако часто бывает сложно изолировать и таким образом, изучая их часто обеспечивает вызов.
Это исследование определяет метод обогащения устьиц клеток гвардии. Протокол использует Скотч изолировать гвардии клетки и извлечения белков из клеток. Этот метод улучшает целостность и доходность гвардии ячейки во время изоляции и обеспечивает надежную образец для изучения клеточных сигналов процессов и как они связаны с устьичного движение фенотипов. В этом методе листья растений были разделены между двумя частями ленты и очищенные врозь, чтобы удалить abaxial сторону. Этот протокол был применен к листовой ткани Arabidopsis изолировать гвардии клеток. Клетки относились с флуоресцеин диацетат (FDA) для определения жизнеспособности и абсцизовой кислоты (АБА) для оценки движения устьиц в ответ на ABA. В заключение этот протокол окажется полезным для подготовки обогащенного устьиц клеток гвардии и изоляции белков. Качество клеток и белков получил здесь включить физиологические и другие биологические исследования.
Introduction
Устьиц играют важную роль в общей физиологии и фитнес растений. Эти крошечные завод конкретные структуры формируются две специализированные клетки эпидермиса, известный как охранник клетки и наиболее обильно находятся на abaxial поверхности листьев. Устьиц необходимы для обмен газов между завода и атмосферы, а также контроль за потери воды за счет транспирации. Гвардии клетки регулируют устьиц диафрагмы путем интеграции различных внешних (например, света, влажности, возбудитель контакт, уровни углекислого газа) и внутренние (например., эндогенных гормонов) раздражители1,2. За последние 20 лет этот тип ячейки стала модель системы для изучения ячейки сигнализации процессы в растениях. Эти клетки составляют небольшую долю общего числа клеток в листа; Таким образом расследовать их уникальных сотовых, биохимических и молекулярных свойств в виде одноклеточных, необходимо изолировать их от других типов клетки листа. В прошлом гвардии клетки исследования часто связан с подготовкой гвардии клеток протопласта (GCP)3,4,5. Это обычно требует использования большого количества унижающих достоинство ферменты клеточной стенки, и или механические нарушения через смешивания и оказалось, чтобы быть дорогостоящим и трудоемким, поскольку он обычно занимает много времени, чтобы подготовить образец GCP, часто раз с маленькой доходности. Что еще более важно потому что гвардии клетки действуют в качестве полной пары регулировать устьиц диафрагмы, использование GCP можно рассматривать как искусственные системы для изучения клеток гвардии сигнализации.
Здесь мы разработали метод подготовить устьиц, в которых нетронутыми гвардии клетки обогащаются и сохранять физиологические реакции на раздражители. Этот метод был вдохновлен метод, который был использован для изолировать мезофилл клеток протопласта6,7. В нашем методе устьиц готовятся с использованием четких Скотч сначала отделить большинство клеток мезофилл придает adaxial слой листьев от abaxial слой, содержащий тротуар и гвардии клетки. Это делается путем проставления кусок ленты на каждой стороне листа и пилинг их друг от друга. Клетки из abaxial слоя разрешается взять под свет в буфере устьиц открытия. Позже оставшиеся тротуар клетки удаляются с помощью небольшого количества клеточной стенки, унижающего достоинство ферментов, оставив позади гвардии ячейку, обогащаются на ленте.
В этой простой метод устьичного гвардии клетки, которые являются жизнеспособной и гибкой можно быстро и эффективно быть готовым, принимая менее чем за час для получения обогащенного устьиц клеток гвардии из 50 пилинг с минимальными затратами. Этот метод предусматривает меньший ущерб для растительных клеток, чем предыдущие методы, где готовят протопласта. Кроме того материалы собраны из этого метода доходности желательно белка сумм. Самое главное потому что лист не подвергается смешивания или длительных пищеварение раз и гвардии клетки остаются нетронутыми, результаты исследований более тесно будет отношение к естественной биологии клетки гвардии. С помощью этого метода можно соотнести устьичных движений в реальном времени с изменениями на молекулярном уровне. Таким образом знания, полученные от исследований с использованием этого метода подготовки бы важное значение для более полного понимания гвардии клеток сигнализации.
Мы использовали растение Arabidopsis thaliana как модель; Однако этот протокол может применяться к обогащению устьиц клеток гвардии в других видов растений, таких как рапс с небольшими изменениями в время пищеварения. Как доказательство концепции мы продемонстрировали, что устьичного гвардии клетки, обогащенный через этот метод жизнеспособным и реагировать на раздражители, как показано на флуоресцеин диацетат (FDA) анализа и исследований с использованием абсцизовой кислоты растительный гормон (ABA), соответственно. Кроме того мы продемонстрировали, что высококачественные белки могут быть изолированы от этих клеток гвардии. Здесь мы описываем подробный протокол этого процесса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выращивание растений
- Прорастают семена в заливки смеси. Растут растения в камере роста с интенсивностью освещения 140 мкмоль фотоны m−2 s −1 и фотопериода 8 h света при 22 ° C и 16 h темной при 18 ° C в течение 2 недель.
- Трансплантировать сеянцы аналогичных размеров индивидуально в 4" диаметр кастрюли, содержащие почвы и расти для дополнительных 3 недели в тех же условиях, описанных на этапе 1.1.
Примечание: Водные растения с водопроводной водой два раза в неделю сохранить влажные почвы.
2. Подготовка обогащенного устьиц
- Удалите листья 5 - неделя старый A. thaliana растений отдельных с помощью скальпеля.
- Прикрепите каждый лист на две части ясно скотч, один кусок, придерживаясь abaxial (нижнюю) и другие произведения, придерживаясь adaxial (верхний) стороне листа. Оставьте ленту на листе 5 s.
- Нежный пилинг врозь двух кусков ленты, используя указательный палец и большой палец на каждой руке для разделения на abaxial стороне с мостовой и гвардии клетки и adaxial сторону с мезофилл клеток.
- Место, пилинг с abaxial стороны листьев в 60 мл устьиц открытия буфера (50 мм KCl, 10 MES-Кох, скорректированы до pH 6.2 с 1 M Кох) в размере 40 мм × 12мм Петри блюда, как они были собраны.
- Повторите описанные выше шаги до тех пор, пока собираются все образцы пилинг.
- Место Петри, содержащий пилинг в камеру роста легких условиях, заявил на этапе 1.1. Оставьте пилинг под свет за 2 ч до полностью открыть устьиц.
- Место пилинг в 150 мм x 20 мм Петри, содержащие 50 мл клеточной стенки, усваивая смесь ферментов (0,7% целлюлаза R-10, 0,025% macerozyme R-10, 0.1% (w/v) поливинилпирролидона-40 и 0,25% (w/v) бычьего сывороточного альбумина в основной раствор 55% (сорбита 0,55 М, 0,5 мм CaCl2, MgCl 0,5 мм2, аскорбиновая кислота 0,5 мм, 10 мкм х2PO4, 5 мм 4-morpholineethanesulfonic кислота (MES) при рН 5,7 скорректирована с 1 M Кох).
- Встряхните пилинг на взаимные шейкер в чашке Петри на 50 об/мин за 20 мин.
- Удаление пилинг из ферментов решения с помощью пинцета после 20 мин передачи пилинг в Петри блюдо размер 150 x 20 мм, содержащие 50 мл воды.
- С помощью пипетки передачи, промойте пилинг для 15 s дважды с 10 мл воды для удаления любого остаточного фермента решения.
- Место пилинг в 150 мм х 20 мм размер Петри блюдо с 50 мл свежего устьиц открытия буфера, используемый в шаге 2.4 с помощью пинцета. Инкубируйте 1 час в условиях освещенности, заявил на этапе 1.1 разрешить устьиц для восстановления.
3. абсцизовой кислоты (АБА) лечение и пробирного движения устьиц
- В размер 150 x 20 мм Петри. Инкубируйте пилинг обогащенного устьиц на 30° C в течение 15 мин в 50 мл устьиц открытия буфера или 50 мл устьиц открытия буфера с конечной концентрации 10 мкм ABA для надлежащего лечения время.
- Место пилинг на шейкер на 50 об/мин за 5, 15 и 30 мин. После каждого интервала удалить кожуру с помощью пинцета и визуализации выполните шаг 3.3.
- Принимать образы устьиц до лечения Аба и в различные моменты времени после лечения ABA с световой микроскоп.
- Взять кожуру и поместите ее на стекло микроскопа.
- Поместите слайд на микроскопа и отрегулировать сцене так, что изображение корки могут быть визуализированы.
- Отрегулируйте размер штрафа и курс акцент на Микроскоп, чтобы получить четкое изображение гвардии клеток.
- Возьмите несколько изображений нескольких устьиц на 40 кратном.
- Измерьте 60 устьичного отверстия с помощью ImageJ8.
- Вычислить стандартная ошибка и значение в p значение < 0,05 60 измерений устьичной диафрагмы.
4. белка добычу и разъединения SDS-Page
- Растереть пилинг для 15 s в достаточно жидкого азота для покрытия пилинг с использованием охлажденной ступку и пестик.
- За 50 пилинги, добавить 3 мл трис насыщенных фенола (рН 8,8) и 3 мл белка добычу буфера (0,9 М сахарозы, 0.1 М трис-HCl, 0,01 М ЭДТА, 0,4% 2-меркаптоэтанол, 10 мкл ингибитора протеазы и фосфатазы 1 мм) с пипеткой с раствором и затем шлифуют пилинг для 5 addi ных минут зонта.
- Передача с помощью пипетки экстракт и пилинг с использованием металлических Пинцеты для Окридж центрифуга трубки и агитировать на шейкер на 50 об/мин за 1 час при 4 ° C.
- Удаление пилинг из трубки Окридж центрифуги и центрифуги экстракт на 5000 x g за 10 мин. Затем перенесите Топ фенольные этап новой чистой микро пластиковых пробирок с помощью пипетки.
- Преципитат фенола извлечены белки, добавив 5 томов ледяной ацетата аммония 0,1 М в 100% метанола. Вихревой кратко и инкубировать на ночь при-20 ° C.
- Центрифуга на 20000 x g при 4 ° C в течение 20 мин, сцеживаться супернатанта, медленно поливая из трубки и удерживать Пелле белка в трубе.
- Помыть лепешка белка дважды с Ацетат аммония 0,1 М в метаноле и затем дважды с 80% ацетона и один раз с 100% холодной ацетона.
Примечание: Моет выполняются путем добавления 10 мл реагента, указанного на трубу белка. Агитируйте на шейкер на 50 об/мин за 5 мин, затем центрифугированием на 15000 x g при 4 ° C на 10 мин. Затем налейте реагент из трубки, сохраняя только белок Пелле. - Добавьте 1 мл 100% ацетона, холодные гранулы и вновь приостановить, медленно закупорить вверх и вниз.
- Передачи подвеска белка через пипетку в 2-мл пробирку микро центрифуги, а затем центрифуги на 20000 x g при 4 ° C за 5 мин.
- Удалите ацетон, переливание из трубки и сухие гранулы в вытяжной шкаф на 10 мин.
- Распустить белка в микро пластиковых пробирок с 200 мкл буфера распада (8 M мочевины, 0,5% SDS, 30 мм трис-HCl при рН 8,5) и вихрь 30 мин центрифуги на 20000 x g, при 15 ° С 20 мин и собирать супернатант в новой трубки.
- Количественно определить концентрацию белка после белка количественной протокол9.
- Используйте образцы протеина для разделения белков электрофорезом геля после протокол10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель изображение Arabidopsis гвардии клеток до и после переваривание мезофилл и эпидермальных клеток показана на рисунке 1. Жизнеспособность клеток гвардии до и после удаления мезофилл и эпидермальных клеток можно наблюдать с помощью FDA для измерения ферментативную активность и целостности клеточных мембран (рис. 1B и 1 D). Рисунок 2 иллюстрирует устьичного движение арабидопсиса в ответ на лечение АБА. Устьичное отверстие уменьшается более чем на 50 процентов после 30 минут лечения с ABA. Рисунок 2A – это время курс движения устьиц. В различные моменты времени фотографии были сделаны с световой микроскоп. Устьичное отверстие было измерено с ImageJ и результаты были представлены как в среднем от 60 до 80 Апертура измерения ± стандартных ошибок. Представитель изображение проема устьиц на каждом этапе будет показано на рисунке 2B. Определение белка, разделения и относительное изобилие наблюдаются на SDS-PAGE (рис. 3). Четыре биологических реплицирует включены подчеркнуть воспроизводимость извлечения белков из этого метода.
Рисунок 1 . Флуоресцеин диацетат жизнеспособности окрашивания клеток гвардии до и после удаления мезофилл и эпидермальных клеток. (A) пилинг (непереваренной) под светлые области. (B) пилинг (непереваренной) и витражи с FDA. (C) пилинг (переваривается) под ярким поле (D) пилинг (переваривается) и витражи с FDA. Все фотографии были сделаны на 40 кратном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Устьиц движение арабидопсиса в ответ на ABA. Эпидермис были очищенные от полностью расширенной листьев, с эпидермальных клеток удалены и предварительно инкубировали при свете с открытия буфера (50 мм KCl, 10 мм MES-Кох, pH 6.2) за 2 ч, затем инкубируют с водой или с 10 мкм ABA лечения для 5, 10 и 30 мин (A) Курс движения устьиц. Пункт (B) представитель образ устьиц на каждый раз. Данные отображаются как средства ± SE трех независимых экспериментов. Дисперсионный анализ (ANOVA) был предварительно для анализа разницы средних. Различные буквы указывают значительно различные средние значения в p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . SDS-PAGE разделение белков обогащенного гвардии клетки, с помощью метода экстракции белка на основе фенола. Равное количество белков (40 мкг) были урегулированы с помощью геля полиакриламида 12,5% и визуализированы с CBB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гвардии клетки являются модель системы для изучения механизмы трансдукции сигнала в растениях, и важно обеспечить наиболее подходящий ответ на биологические вопросы подготовки проб, используемых в исследовании. Несмотря на растущий интерес к гвардии клеток в рамках исследовательского сообщества растений, не существует универсального метода о том, как подготовить устьичного гвардии клетки, которые позволят устьичного движения и физиологии и молекулярные изменения учился в одной системы. Вызов, чтобы изолировать их может объясняться в значительной степени их малый размер, низкая изобилия и уникальной структуры, которые могут сделать его более или менее трудно удалить их из всего листья.
Этот протокол предоставляет метод о том, как преодолеть эти препятствия, изолируя их с помощью метода развитых ленточных пил. Метод, представленный в настоящем Протоколе предоставляет способ для изоляции нетронутыми устьичного гвардии клетки, которые остаются физиологически реагировать на раздражители. Подготовка этих образцов делает возможным для извлечения гвардии клетки белки, которые могли бы служить исходным материалом для углубленного протеомических исследований, таких как количественные протеомических исследований с использованием тандем массы Теги (ТМТ), и или Изобарический тег для относительные и абсолютные количественный (iTRAQ)11,12. Кроме того этот метод может слегка изменен и оптимизированы, чтобы сделать возможным изучение малых молекул, таких как метаболиты, обнаруженные в клетках гвардии. Эксперимента здесь использованы фитогормона ABA как elicitor для устьичной движения в проростках Arabidopsis, однако другие методы лечения могут быть использованы соответственно. Этот метод также адаптированы для других видов растений.
Из-за экспериментальный дизайн и характере материалов, используемых в настоящем протоколе есть некоторые важные шаги. Хотя помимо пилинг с abaxial и adaxial стороны листа (шаг 2.2), важно, что это делается без колебаний и применения равных нежный давление на обе части ленты так, что abaxial слой единообразных после ее удаления. Это важно для оптимизации отдельных пилинг технику и пищеварение время для видов растений в исследовании, как они могут иметь различные оптимального пищеварения раз. Во время пищеварения энзима (шаги 2.8-2.10) пилинг следует внимательно и проверяется каждые 3-5 минут. Это важно, потому что незначительные различия в слоях пилинг приведет к раза быстрее или медленнее пищеварение. При лечении пилинг с ABA или другие раздражители (шаг 3.1), пилинг должен равном расстоянии, плавающие и тряски слегка так, что они никогда не перекрываются. Пилинги, которые застряли вместе или дублирования может дают разные результаты из-за отсутствия контакта с раствором.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Отсутствие конфликта интересов объявил.
Acknowledgments
Мы благодарим Даниэль Чэнь от цифрового видео производства команда Бухгольц высшей школы для помощи в редактировании видео. Это исследование на устьичную гвардии клетки, протеомики и метаболомики в лаборатории Чэнь была поддержана грантов от нас национального научного фонда (0818051, 1158000 и 1412547). Wenwen Kong поддерживается Советом стипендии Китая. Д-р Qiuying Пан поддерживается Советом стипендии Китая и национального фонда естественных наук Китая (31570396).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
References
- Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
- Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
- Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).
- Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts. New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).
- Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).
- Wu, F. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 10 (2009).
- Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, (2015).
- Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Agnew, B., Murray, D., Patton, W. A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents. Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895). Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
