Summary
Denne protokol beskriver en metode til at forberede beriget spalteåbningernes guard celler, der er nyttig for fysiologiske og andre biologiske undersøgelser.
Abstract
Studiet af guard celler er vigtigt, at viden om de specifikke bidrag af denne celletype til den overordnede funktion af planter. Men det er ofte vanskeligt at isolere og dermed at studere dem ofte giver en udfordring.
Denne undersøgelse etablerer en spalteåbningernes vagt celle berigelse metode. Protokollen udnytter Scotch tape for at isolere guard celler og udtrække proteiner fra cellerne. Denne metode forbedrer integritet og udbytte af guard celle under isolation og giver en pålidelig prøve for undersøgelse af celle signalering processer og hvordan de korrelerer til spalteåbningernes bevægelse fænotyper. I denne metode, var plante blade opdelt mellem to dele af båndet og pillet fra hinanden for at fjerne den abaxial side. Denne protokol blev anvendt til Arabidopsis blad væv til at isolere guard celler. Cellerne blev behandlet med fluorescein diacetat (FDA) til at bestemme levedygtighed og abscisic syre (ABA) at vurdere spalteåbninger bevægelse i svar til ABA. Til sidst, denne protokol viser sig nyttigt for at forberede beriget spalteåbningernes guard celler og isolere proteiner. Kvaliteten af celler og proteiner fremstillet her aktiver fysiologiske og andre biologiske undersøgelser.
Introduction
Spalteåbninger spiller en vigtig rolle i den overordnede fysiologi og fitness af planter. Disse lille plante specifikke strukturer er dannet af to specialiserede epidermale celler kendt som vagt celler og findes mest talrigt på abaxial overfladen af bladene. Spalteåbningerne er nødvendige for udvekslingen af gasser mellem anlægget og atmosfæren, samt kontrol af vandtab gennem transpiration. Vagt celler regulere spalteåbninger blænde gennem integration af forskellige eksterne (f.eks., lys, fugtighed, patogen kontakt, kuldioxid niveauer) og indre (e.g., endogene hormoner) stimuli1,2. I de sidste 20 år, er denne celletype blevet en modelsystem for at studere celle signalering processer i planter. Disse celler udgør en lille brøkdel af de samlede cellerne i et blad; for at undersøge deres unikke cellulære, biokemiske og molekylær egenskaber i en enkelt celle måde, det er således nødvendigt at isolere dem fra andre blad celletyper. I fortiden, har vagt celle undersøgelser ofte involveret udarbejdelse af vagt celle protoplasts (GCP)3,4,5. Dette typisk kræver brug af store mængder af cellevæg nedværdigende enzymer og eller mekanisk afbrydelse via blanding og har vist sig at være dyrt og tidskrævende som det generelt tager mange timer til at forberede en GCP prøve, ofte gange med ringe udbytte. Endnu vigtigere, fordi guard celler fungerer som komplet par at regulere spalteåbninger blænde, kan brugen af GCP ses som et kunstigt system til at studere guard celle signalering.
Her, har vi udviklet en metode til at forberede spalteåbninger hvor intakt guard celler er beriget og vedligeholde fysiologiske reaktioner på stimuli. Denne metode var inspireret af en metode, der blev brugt til at isolere mesofyllet celle protoplasts6,7. I vores metode tilberedt spalteåbninger ved hjælp af klare Scotch tape til første adskille fleste mesofyllet celler knyttet til det adaxial lag af blade fra abaxial laget med fortovet og vagt celler. Dette gøres ved at anbringe et stykke tape på hver side af bladet og peeling dem fra hinanden. Celler fra det abaxial lag er tilladt at inddrive under lys i en buffer, spalteåbninger-åbning. Senere fjernes de resterende fortov celler ved hjælp af en lille mængde af cellevæggen nedværdigende enzymer, efterlod guard celle, der er beriget på båndet.
I denne simple metode, spalteåbningernes vagt celler, der er både bæredygtige og lydhør kan hurtigt og være effektivt parat, tager mindre end en time for at få beriget spalteåbningernes guard celler fra 50 peelinger med minimale omkostninger. Metoden her pålægger mindre skade på plantecellerne end tidligere metoder hvor protoplasts tilberedes. Derudover materiale, der indsamles fra denne metode udbytte ønskelig protein beløb. Vigtigst, fordi bladet ikke er udsat for blanding eller langvarige fordøjelsen gange og vagt celler forbliver intakt, resultaterne af undersøgelserne vil nærmere være relevant som en vagt cellens naturlige biologi. Med denne metode kan være korreleret spalteåbningernes bevægelser i realtid med ændringer på det molekylære niveau. Således, den viden opnået fra undersøgelser ved hjælp af denne forberedelse metode ville være vigtigt for en mere omfattende forståelse af guard celle signalering.
Vi brugte planten Arabidopsis thaliana som model. men denne protokol kan anvendes til berigelse af spalteåbningernes guard celler i andre plantearter såsom Brassica napus med små ændringer i fordøjelsestid. Som en proof of concept viste vi, at spalteåbningernes guard celler beriget via denne metode er levedygtig og reagerer på stimuli som vist af fluorescein diacetat (FDA) analyse og undersøgelser udnytter anlægget hormon abscisic syre (ABA), henholdsvis. Derudover har vi vist, at høj kvalitet proteiner kan isoleres fra disse guard celler. Her beskriver vi en detaljeret protokol af denne proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dyrkning af planter
- Spire frø i pottemuld blanding. Dyrke planter i et vækst kammer med en lysintensitet af 140 µmol fotoner m−2 s 1 og en lysperiode 8 h lys ved 22 ° C og 16 h mørke ved 18 ° C i 2 uger.
- Transplant planter af lignende størrelser individuelt i 4" diameter Potter indeholdende jorden og vokse til en yderligere 3 uger i de samme betingelser beskrevet taktfast 1.1.
Bemærk: Vand planterne med vand fra hanen to gange om ugen til at holde jorden fugtig.
2. fremstilling af beriget spalteåbninger
- Fjern bladene af 5 - uger gamle A. thaliana planter individuelle med en skalpel.
- Knytte hvert blad til to stykker klar Scotch tape, med ét stykke fastholdelsen af den abaxial (nedre) side og de andre stykke tilslutte sig adaxial (øverste) side af bladet. Forlade båndet på bladet for 5 s.
- Blid skræl apart de to stykker bånd ved hjælp af pegefinger og tommelfinger på hver hånd for at adskille den abaxial side med fortovet og vagt celler og den adaxial side med mesofyllet celler.
- Sted peels fra den abaxial side af bladene i 60 mL af spalteåbninger åbning buffer (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, indstillet til pH 6.2 med 1 M KOH) i 40 mm × 12 mm størrelse Petri retter som de er indsamlet.
- Gentag ovenstående trin, indtil alle prøve peelinger er indsamlet.
- Placer de petriskåle, der indeholder peels i vækst kammer under lysforhold i trin 1.1. Forlade peelinger under lys for 2 h fuldt åbne spalteåbningerne.
- Sted peels i en 150 mm x 20 mm petriskål indeholder 50 mL af cellevæggen fordøje enzym blanding (0,7% cellulase R-10 0.025% macerozyme R-10, 0,1% (w/v) polyvinylpyrrolidon-40 og 0,25% (w/v) bovint serumalbumin i 55% grundlæggende løsning (0,55 M sorbitol, 0,5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,5 mM ascorbinsyre, 10 µM KH2PO4, 5 mM 4-morpholineethanesulfonic syre (MES) ved pH 5.7 justeret med 1 M KOH).
- Ryst skræl på en gensidig shaker i en petriskål ved 50 rpm i 20 min.
- Fjern skræl fra enzymet løsning med pincet, efter 20 min. overføre peelinger til en 150 mm x 20 mm størrelse petriskål indeholdende 50 mL vand.
- Ved hjælp af en overførsel pipette, skyl skræl for 15 s to gange med 10 mL vand for at fjerne enhver resterende enzym løsning.
- Bruge pincet til at placere peels i en 150 mm x 20 mm størrelse petriskål med 50 mL frisk spalteåbninger åbning buffer som bruges i trin 2.4. Inkuber i 1 time i lys betingelserne i trin 1.1 tillade spalteåbninger at inddrive.
3. Abscisic syre (ABA) behandling og spalteåbningerne bevægelse analyse
- I en 150 mm x 20 mm størrelse petriskål. Inkuber beriget spalteåbninger peelinger ved 30° C i 15 min i 50 mL af spalteåbningernes åbning buffer eller 50 mL af spalteåbningernes åbning buffer med en slutkoncentration på 10 µM ABA for passende behandling gang.
- Sted skaller på en shaker på 50 rpm i 5, 15 og 30 min. Efter hvert tidsinterval fjerne en skræl med en pincet og følg imaging fremgangsmåden punkt 3.3.
- Tage billeder af spalteåbninger før ABA-behandling og på de forskellige tidspunkter efter ABA behandling med et lysmikroskop.
- Tage en skræl og placere den på et glas objektglas.
- Placer diasset på stadiet mikroskop og justere fase, så billedet af skræl kan visualiseres.
- Justere bøden og selvfølgelig fokus på mikroskop til at få et klart billede af guard celler.
- Tage flere billeder af flere spalteåbninger på 40 X forstørrelse.
- Måle 60 spalteåbningernes åbninger ved hjælp af ImageJ8.
- Beregne standardafvigelsen og betydning på en p-værdi < 0,05 60 spalteåbningernes blænde måleresultaterne.
4. protein udvinding og SDS-Page adskillelse
- Male skræl for 15 s i nok flydende kvælstof til at dække peelinger ved hjælp af en kølet morter og støder.
- Pr. 50 peelinger, tilsættes 3 mL af Tris mættet phenol (pH 8,8) og 3 mL protein ekstraktionsbuffer (0,9 M saccharose, 0,1 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,4% 2-Mercaptoethanol, 10 µL af 1 mM protease og fosfatase hæmmer) med en pipette til mørtel og derefter male skræl for 5 addi nelle minutter i et stinkskab.
- Overføre ekstrakt ved hjælp af en pipette og skræl ved hjælp af metal pincet til en Oakridge centrifugeres tube og agitere på en shaker på 50 rpm i 1 time ved 4 ° C.
- Fjerne peels fra Oakridge centrifugeglas og centrifugeres ekstrakt på 5.000 x g i 10 min. Derefter overføre den øverste phenol fase til en ny ren micro-centrifugerør ved hjælp af en pipette.
- Bundfaldet af phenol udvundet proteiner ved at tilføje 5 bind for iskold 0,1 M ammoniumacetat i 100% methanol. Vortex kort og der inkuberes natten over ved-20 ° C.
- Der centrifugeres ved 20.000 x g ved 4 ° C i 20 min., dekanteres af langsomt hælde det ud af røret og fastholde protein pellet i røret.
- Vask protein pellet to gange med 0,1 M ammoniumacetat i methanol, og derefter to gange med 80% acetone og en gang med 100% kolde acetone.
Bemærk: Vasker er gjort ved at tilføje 10 mL af angivne reagens til rør af protein. Agitere på en shaker på 50 rpm i 5 min, efterfulgt af centrifugering ved 15.000 x g ved 4 ° C i 10 min. Derefter hælde reagens ud af røret bevarer kun protein pellet. - Tilsættes 1 mL 100% kolde acetone til pellet og genopslæmmes af pipettering langsomt op og ned.
- Overføre protein suspension via pipette til en 2 mL micro-centrifugerør derefter centrifugeres ved 20.000 x g ved 4 ° C i 5 min.
- Fjerne acetone ved dekantering det fra rør og tørre pellet i stinkskab i 10 min.
- Opløser proteinet i et micro-centrifugerør med 200 µL af opløsningen buffer (8 M urinstof, 0,5% SDS, 30 mM Tris-HCl pH-værdi på 8,5) og vortex i 30 min. Centrifuge på 20.000 x g ved 15 ° C i 20 min og indsamle supernatanten i en ny tube.
- Kvantificere proteinkoncentration efter protein kvantificering protokol9.
- Bruge protein prøver for protein adskillelse af gelelektroforese efter protokollen10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et repræsentativt billede af Arabidopsis guard celler før og efter fordøjelsen af mesofyllet og epidermal celler er vist i figur 1. Vagt cellernes levedygtighed før og efter fjernelse af mesofyllet og epidermal celler kan observeres ved hjælp af FDA til at måle enzymatisk aktivitet og celle membran integritet (figur 1B og 1 D). Figur 2 illustrerer spalteåbningernes bevægelighed Arabidopsis svar til ABA-behandling. Spalteåbningernes blænde falder mere end 50 procent efter 30 minutter af behandling med ABA. Figur 2A er et tidsforløb spalteåbninger bevægelighed. På forskellige tidspunkter, blev billeder taget med et lysmikroskop. Spalteåbningernes blænde blev målt med ImageJ og resultater blev præsenteret som gennemsnit fra 60 til 80 blænde målinger ± standard fejl. Et repræsentativt billede af spalteåbninger blænde på hvert tidspunkt er vist i figur 2B. Protein påvisning, adskillelse og relativ overflod er observeret af SDS-PAGE (figur 3). Fire biologiske replikater er medtaget for at understrege reproducerbarhed af protein udtræk fra denne metode.
Figur 1 . Fluorescein diacetat levedygtighed farvning af guard celler før og efter fjernelse af mesofyllet og epidermal celler. (A) skræl (ufordøjet) under lysfelt. (B) skræl (ufordøjet) og farves med FDA. (C) skræl (fordøjet) under lyse feltet (D) skræl (fordøjet) og farves med FDA. Alle billeder blev taget på 40 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Spalteåbningernes bevægelighed Arabidopsis svar på ABA. Epidermis blev skrællet fra fuldt udbygget blade, med epidermal celler fjernes, og forud inkuberet i lys med åbningen buffer (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.2) i 2 timer, og derefter inkuberes med vand eller med 10 µM ABA behandling for 5, 10 og 30 min. (A) Tidsforløb spalteåbningernes bevægelighed. (B) repræsentativt billede af spalteåbninger på hver gang pege. Dataene, der er vist som middel ± SE tre uafhængige forsøg. Variansanalyse (ANOVA) var præfabrikerede for at analysere betyde forskelle. Forskellige bogstaver angiver væsentligt forskellige gennemsnitlige værdier på p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . SDS-PAGE adskillelse af proteiner fra beriget guard celler ved hjælp af phenol-baseret protein ekstraktion metode. Lige store mængder (40 µg) af proteiner er løst ved hjælp af 12,5% polyacrylamid gel og visualiseret med CBB. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vagt celler er et modelsystem til at studere signaltransduktion mekanismer i planter og det er vigtigt at sikre, at forberedelsen af prøver, der indgår i undersøgelsen er den mest hensigtsmæssige til at besvare biologiske spørgsmål. Trods den stigende interesse i vagt celler inden for forskning plantesamfund, der er ingen universel metode om hvordan man forbereder spalteåbningernes guard celler, der ville give både spalteåbningernes bevægelse og fysiologi samt de molekylære forandringer skal undersøges i en system. Udfordring at isolere dem kan tilskrives stor del at deres lille størrelse, lave overflod og unikke struktur, som kan gøre det mere eller mindre svært at fjerne dem fra hele blade.
Denne protokol giver en metode om hvordan man kan overvinde disse forhindringer, isolerer dem ved hjælp af en udviklet tape-peel metode. Metoden fremlægges i denne protokol giver en måde til at isolere intakt spalteåbningernes guard celler, som forbliver fysiologisk reagerer på stimuli. Forberedelsen af disse prøver gør det muligt for udvinding af guard celle proteiner, der kunne tjene som udgangsmateriale for dybdegående proteom undersøgelser, såsom kvantitative proteom undersøgelser udnytter Tandem masse Tags (TMT) og eller Isobar tag for relative og absolutte kvantitering (iTRAQ)11,12. Desuden, kan denne metode lidt ændret og optimeret til at gøre muligt studiet af små molekyler, som metabolitter fundet i vagt celler. Eksperimentet her udnyttede phytohormone ABA som en elicitor til spalteåbningernes bevægelse i Arabidopsis, men andre behandlinger kan bruges i overensstemmelse hermed. Denne metode er også kan tilpasses til andre plantearter.
På grund af den eksperimentelle design og arten af de materialer, der anvendes i denne protokol, er der nogle afgørende skridt. Mens peeling fra hinanden de abaxial og adaxial sider af blad (trin 2.2), er det vigtigt, at det sker uden tøven og ved at anvende lige blide tryk på begge stykker af båndet, således at det abaxial lag er ensartet, efter det er fjernet. Det er vigtigt at optimere individuelle peeling teknik og fordøjelse tid til plantearter i undersøgelsen, som de kan have forskellige optimal fordøjelse gange. Under enzym fordøjelsen (trin 2.8-2.10), bør peelinger overvåget nøje og kontrolleres hver 3-5 minutter. Dette er vigtigt fordi mindre forskelle i lag af peelinger vil resultere i hurtigere eller langsommere fordøjelsen gange. Ved behandling af skræl med ABA eller andre stimuli (trin 3.1), skal skræl være ligeligt fordelt, flydende og ryster forsigtigt, således at de aldrig overlappe hinanden. Skræl, der sidder fast sammen eller overlapper hinanden kan give forskellige resultater skyldes manglende kontakt med løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Daniel Chen fra Digital Video produktion Team af Buchholz High School for hjælp til at redigere videoen. Denne forskning om spalteåbningernes guard celler, proteomics og metabolomics i Chen lab er blevet støttet af tilskud fra os National Science Foundation (0818051, 1158000 og 1412547). Wenwen Kong understøttes af Kina stipendium Rådet. Dr. Qiuying Pang er støttet af Kina stipendium Rådet og National Natural Science Foundation of China (31570396).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
References
- Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
- Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
- Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).
- Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts. New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).
- Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).
- Wu, F. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 10 (2009).
- Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, (2015).
- Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Agnew, B., Murray, D., Patton, W. A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents. Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895). Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
