Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor te bereiden van verrijkte stomatal guard cellen die nuttig is voor fysiologische en andere biologische studies.
Abstract
De studie van guard cellen is essentieel om de kennis van de specifieke bijdragen van dit celtype aan de algehele functie van planten. Echter is het vaak moeilijk om te isoleren en aldus het bestuderen van hen vaak biedt een uitdaging.
Deze studie stelt een stomatal bewaker cel verrijking methode. Het protocol maakt gebruik van plakband om guard cellen isoleren en haal eiwitten uit de cellen. Deze methode verbetert de integriteit en de opbrengst van guard cel in isolatie en biedt een betrouwbare steekproef voor de studie van cel signalering processen en hoe zij aan stomatal verkeer fenotypen correleren. Bij deze methode, waren de bladeren van de plant opgedeeld tussen de twee gedeelten van de tape en geschild uit elkaar om te verwijderen van de abaxial kant. Dit protocol werd toegepast op Arabidopsis blad weefsel te isoleren guard cellen. De cellen werden behandeld met fluoresceïne DIACETAAT (FDA) om te bepalen van de levensvatbaarheid en abscisic zuur (ABA) te beoordelen van stoma verkeer naar aanleiding van ABA. Tot slot bewijst dit protocol nuttig voor de voorbereiding van verrijkte stomatal guard cellen en isoleren van eiwitten. De kwaliteit van de cellen en eiwitten verkregen hier inschakelen fysiologische en andere biologische studies.
Introduction
Stoma spelen een belangrijke rol in de algemene fysiologie en fitness van planten. Deze kleine plant specifieke structuren worden gevormd door twee gespecialiseerde epidermale cellen bekend als bewaker cellen en meest overvloedig zijn gevonden op het abaxial oppervlak van bladeren. Stoma zijn noodzakelijk voor de uitwisseling van gassen tussen de fabriek en de atmosfeer, evenals de controle van waterverlies door transpiratie. Guard cellen regelen stoma diafragma door de integratie van verschillende externe (bijvoorbeeld, licht, vochtigheid, pathogen contact, kooldioxide niveaus) en interne (bv., endogene hormonen) prikkels1,2. In de afgelopen 20 jaar uitgegroeid tot dit celtype een modelsysteem voor studeren cel signalering processen in planten. Deze cellen vormen een klein deel van het totaal aantal cellen in een blad; om te onderzoeken hun unieke mobiele, biochemische en moleculaire eigenschappen in een eencellige manier, het is dus noodzakelijk om hen te isoleren van andere celtypes van het blad. In het verleden betrokken guard cel studies zijn vaak de voorbereiding van guard cel protoplasten (GCP)3,4,5. Dit meestal vereist het gebruik van grote hoeveelheden van celwand vernederende enzymen en/of mechanische storingen via mengen en heeft bewezen om dure en tijdrovende worden als het over het algemeen vele uren duurt te bereiden een steekproef GCP, vaak tijden met weinig rendement. Wat nog belangrijker is, doordat guard cellen als volledige paren fungeert aan stoma diafragma te regelen, kan het gebruik van GCP worden gezien als een kunstmatige systeem aan het bestuderen van de guard cel signalering.
Hier hebben wij een methode ter voorbereiding van de stoma waarin intact guard cellen zijn verrijkt en onderhouden van fysiologische reacties op prikkels ontwikkeld. Deze methode werd geïnspireerd door een methode die werd gebruikt voor het isoleren van de mesophyl cel protoplasten6,7. In onze werkwijze, zijn stoma bereid duidelijk plakband eerst scheiden de meerderheid van de mesophyl cellen zijn verbonden met de adaxial laag van het blad vanaf de abaxial laag met de bestrating en guard cellen. Dit wordt gedaan door het aanbrengen van een stukje tape aan elke kant van het blad en peeling hen uit elkaar. De cellen uit de abaxial laag zijn toegestaan om te herstellen onder licht in een buffer van de stoma-opening. Later worden de overgebleven cellen van de bestrating verwijderd met behulp van een kleine hoeveelheid celwand vernederende enzymen, guard cel die zijn verrijkt achterlaat op de tape.
In deze eenvoudige methode, stomatal guard-cellen die zowel levensvatbare en responsieve kan snel en efficiënt worden voorbereid houdend van minder dan een uur te verkrijgen van verrijkte stomatal guard cellen van 50 schillen met minimale kosten. De methode hier legt minder schade aan de plantencellen dan eerdere methoden waar protoplasten worden bereid. Bovendien, materiaal dat wordt opgevangen uit deze methode opbrengst wenselijk eiwit bedragen. Vooral omdat het blad niet aan het mengen onderworpen is of langdurige spijsvertering tijden en guard cellen intact blijven, zullen de resultaten van studies nauwer relevant zijn voor die van een natuurlijke guard celbiologie. Met deze methode kunnen stomatal bewegingen in real-time worden gecorreleerd met wijzigingen op het moleculaire niveau. Dus zou de kennis die opgedaan uit studies met behulp van deze methode voorbereiding zijn belangrijk voor een vollediger begrip van guard cel signalering.
We gebruikten de plant Arabidopsis thaliana als een model; Dit protocol kan echter worden toegepast op de verrijking van stomatal guard cellen bij andere plantensoorten zoals Brassica napus met kleine wijzigingen in de tijd van de spijsvertering. Als een bewijs van concept, hebben wij aangetoond dat stomatal guard cellen verrijkt via deze methode levensvatbare en reageren op stimuli, zoals blijkt uit de fluoresceïne DIACETAAT (FDA) assay en studies met behulp van het plantenhormoon abscisic zuur (ABA), respectievelijk. Daarnaast hebben we aangetoond dat eiwitten van hoge kwaliteit geïsoleerd uit deze cellen guard worden kunnen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol van dit proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. het kweken van planten
- Kiemen de zaden in potten mengsel. Planten groeien in een groei-kamer met een lichtsterkte van 140 µmol fotonen m−2 s −1 en een fotoperiode van 8 h licht bij 22 ° C en 16u donker bij 18 ° C voor 2 weken.
- Zaailingen van vergelijkbare grootte afzonderlijk overplanten in 4" diameter potten met de grond en groeien voor een extra 3 weken in dezelfde voorwaarden in stap 1.1 beschreven.
Opmerking: Planten met leidingwater twee keer per week Water de bodem om vochtig te houden.
2. voorbereiding van verrijkte stoma
- Verwijder de bladeren van 5 - weken oude A. thaliana planten individuele met een scalpel.
- Elk blad aan twee stukjes plakband duidelijk, koppelen met één stuk vast te houden aan de abaxial (onderkant) en het andere stuk aan adaxial (bovenste) van het blad. Laat de tape op het blad voor 5 s.
- Gentle peel apart de twee stukken van tapes met behulp van de wijsvinger en de duim op elke hand te scheiden van de abaxial kant met bestrating en guard cellen en de adaxial kant met mesophyl cellen.
- Plaats de schillen van de abaxial kant van de bladeren in 60 mL stoma openen buffer (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, aangepast aan de pH 6.2 met 1 M KOH) in 40 mm × 12 mm grootte Petri gerechten zoals ze zijn verzameld.
- Herhaal de bovenstaande stappen totdat alle monster schillen zijn verzameld.
- Plaats de petrischalen met het schillen in de kamer van de groei onder lichte voorwaarden zoals beschreven in stap 1.1. Laat de schillen onder het licht voor 2 h stoma volledig te openen.
- Plaats schillen in een 150 mm x 20 mm petrischaal met 50 mL celwand verteren enzym mengsel (0,7% cellulase R-10, 0,025% macerozyme R-10, 0,1% (g/v) Polyvinylpyrrolidon-40 en 0,25% (m/v) bovien serumalbumine in 55% basisoplossing (0.55 M sorbitol, 0.5 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, ascorbinezuur 0,5 mM, 10 µM KH2PO4, 5 mM 4-morpholineethanesulfonic zuur (MES) op pH 5.7 aangepast met 1 M KOH).
- Schud de schillen op een wederzijdse shaker in een petrischaal bij 50 rpm voor 20 min.
- Verwijder schillen uit enzym oplossing met een pincet, na 20 min. de schillen overbrengen in een petrischaal 150 x 20 mm grootte met 50 mL water.
- Met behulp van een pipet overdracht, spoel schillen voor 15 s tweemaal met 10 mL water voor het verwijderen van alle resterende enzym-oplossing.
- Gebruik pincet om schillen in een petrischaal van 150 x 20 mm grootte met 50 mL verse stoma openen buffer zoals gebruikt in stap 2.4. Incubeer gedurende 1 h in lichte voorwaarden zoals beschreven in stap 1.1 om de stoma te herstellen.
3. Abscisic zuur (ABA) behandeling en stoma verkeer Assay
- In een petrischaal 150 x 20 mm grootte. Incubeer de schillen van de verrijkte stoma bij 30° C gedurende 15 min in 50 mL van de stomatal opening buffer of 50 mL van de stomatal opening buffer met een eindconcentratie van 10 µM ABA voor de juiste behandeling keer.
- Plaats schillen op een shaker 50 rpm voor 5, 15 en 30 min. Na elk tijdsinterval een peeling verwijdert met een pincet en de beeldvorming stappen in stap 3.3.
- Neem beelden van stoma vóór ABA behandeling en tijdens de verschillende tijdstippen na ABA behandeling met een lichte Microscoop.
- Neem een peeling en plaats het op een microscoopglaasje van glas.
- Plaats van de dia in het werkgebied van de Microscoop en het werkgebied zodanig aanpassen dat het imago van de schil kan worden gevisualiseerd.
- Aanpassen van de boete en focus op de Microscoop om een duidelijk beeld van de guard cellen cursus.
- Neem verschillende beelden van meerdere stoma bij 40 X vergroting.
- Meten van 60 stomatal openingen ImageJ8gebruikt.
- Berekent de standaardfout en betekenis op een p-waarde < 0.05 van de 60 stomatal diafragma metingen.
4. eiwit extractie en afscheiding van de SDS-pagina
- Slijpen van de schillen voor 15 s in genoeg vloeibare stikstof ter dekking van de schillen met behulp van een gekoeld mortier en een stamper.
- Per 50 schillen, voeg 3 mL van Tris verzadigd fenol (pH 8,8) en 3 mL eiwit extractie buffer (0,9 M sacharose, 0,1 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,4% 2-Mercaptoethanol, 10 µL van 1 mM protease en phosphatase remmer) met een pipet op de mortel en vervolgens vermalen de schillen voor 5 addi operationele minuten in een zuurkast.
- Overdracht van het extract met behulp van een precisiepipet en de schillen met behulp van metalen pincet naar een Oakridge Centrifugeer buis en agitate in een roteerapparaat bij 50 omwentelingen per minuut gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Verwijder de schillen uit de Oakridge centrifugebuis en Centrifugeer het extract bij 5.000 x g gedurende 10 minuten. Breng de hoogste fenolische fase aan een nieuwe schone micro-centrifuge buis met behulp van een precisiepipet.
- Neerslag de fenol geëxtraheerd eiwitten door 5 volumes ijskoude ammoniumacetaat op 0,1 M in 100% methanol toe te voegen. Vortex kort en na een nacht bebroeden bij-20 ° C.
- Bij 20.000 x g bij 4 ° C gedurende 20 minuten centrifugeren, decanteren van het supernatant door gieten het langzaam uit de buis en behouden van de eiwit-pellet in de buis.
- Wassen van de eiwit-pellet tweemaal met 0,1 M ammoniumacetaat in methanol, en vervolgens tweemaal met 80% aceton en eenmaal met 100% koude aceton.
Opmerking: Wast zijn gedaan door het toevoegen van 10 mL opgegeven reagens aan de buis van eiwit. Agitate in een roteerapparaat bij 50 t/min gedurende 5 minuten, gevolgd door centrifugatie bij 15.000 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Giet het reagens uit de buis behoud alleen de eiwit-pellet. - 1 mL van 100% koude aceton toevoegen aan de pellet en resuspendeer door pipetteren langzaam op en neer.
- Breng de eiwitten via Pipetteer een 2 mL micro-centrifuge buis dan Centrifugeer bij 20.000 x g bij 4 ° C gedurende 5 min.
- Verwijderen van de aceton door het decanteren uit buis en droog de pellet in de zuurkast gedurende 10 minuten.
- De proteïne in een micro-centrifuge buis met 200 µL van ontbinding buffer (8 M ureum, 0,5% SDS, 30 mM Tris-HCl bij pH 8,5) ontbinden en vortex voor 30 min. Centrifuge bij 20.000 x g bij 15 ° C gedurende 20 min en verzamelen de bovendrijvende substantie in een nieuwe buis.
- Kwantificeren van de eiwitconcentratie na de eiwit kwantificering protocol9.
- EiwitSteekproeven voor eiwit scheiding door de Elektroforese van het gel na het protocol10gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een representatief beeld van Arabidopsis guard cellen vóór en na vertering van de mesophyl en epidermale cellen is afgebeeld in Figuur 1. Levensvatbaarheid van de cellen van de Guard vóór en na de verwijdering van mesophyl en epidermale cellen kan worden waargenomen met behulp van FDA enzymatische activiteit en integriteit van de celmembraan (figuur 1B en 1 D) te meten. Figuur 2 illustreert stomatal verkeer van Arabidopsis in reactie op ABA behandeling. Meer dan 50 procent vermindert stomatal diafragma na 30 minuten van de behandeling met de ABA. Figuur 2A is een tijdsverloop van stoma beweging. Op verschillende tijdstippen, werden foto's genomen met een lichte Microscoop. Stomatal diafragma werd gemeten met ImageJ en resultaten werden gepresenteerd als het gemiddelde van 60 tot 80 diafragma metingen ± standaardfouten. Een representatief beeld van de stoma-opening op elk punt van de tijd wordt weergegeven in figuur 2B. Eiwit detectie, scheiding en relatieve overvloed worden waargenomen door SDS-PAGE (Figuur 3). Vier biologische replicatieonderzoeken worden opgenomen om te benadrukken de reproduceerbaarheid van eiwit extractie van deze methode.
Figuur 1 . Fluoresceïne DIACETAAT levensvatbaarheid kleuring van guard cellen vóór en na de verwijdering van mesophyl en epidermale cellen. (A) schillen (onverteerde) onder heldere veld. (B) schillen (onverteerde) en gekleurd met FDA. (C) schillen (verteerd) onder helder field (D) schillen (verteerd) en bevlekt met FDA. Alle foto's werden genomen op 40 X vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Stomatal verkeer van Arabidopsis in reactie op ABA. Epidermis werden geschild uit volledig uitgevouwen bladeren, met epidermale cellen verwijderd, en vooraf onder licht met de buffer van de opening (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.2) gedurende 2 uur, geïncubeerd en vervolgens geïncubeerd met water of met 10 µM ABA behandeling voor 5, 10 en 30 min. (A) Tijdsverloop van stomatal verkeer. (B) representatieve foto van stoma op elk moment wijs. De gegevens worden weergegeven als middel van ± SE van drie onafhankelijke experimenten. Variantieanalyse (ANOVA) was voorgevormde voor het analyseren van de gemiddelde verschillen. Verschillende letters vermeld afwijkt van de gemiddelde waarden bij p < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . SDS-pagina scheiding van proteïnen van verrijkte guard cellen met behulp van fenol gebaseerde eiwit extractiemethode. Gelijke hoeveelheden (40 µg) eiwitten zijn opgelost met behulp van 12,5% polyacrylamide-gel en gevisualiseerd met CBB. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Guard cellen zijn een modelsysteem voor het bestuderen van signaaltransductie mechanismen in planten en het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de bereiding van de monsters in de studie gebruikt het meest geschikt is om biologische vragen te beantwoorden. Ondanks de toenemende interesse in guard cellen binnen de onderzoekswereld plant, er is geen universele methode op hoe voor te bereiden stomatal guard-cellen die het mogelijk de stomatal beweging en de Fysiologie maken evenals de moleculaire veranderingen worden bestudeerd in een systeem. De uitdaging om te isoleren hen kan grotendeels worden toegeschreven aan hun kleine omvang, lage overvloed en unieke structuur, waardoor het meer of minder moeilijk te verwijderen hen uit hele bladeren.
Dit protocol biedt een methode op hoe te overwinnen van deze hindernissen, isoleren met behulp van een methode ontwikkelde tape-peel. De methode die gepresenteerd in dit protocol biedt een manier voor het isoleren van intact stomatal guard-cellen, die fysiologisch reageren op prikkels blijven. De voorbereiding van deze monsters maakt het mogelijk voor de winning van guard cel eiwitten die kunnen dienen als de grondstof voor diepgaande proteomic studies, zoals kwantitatieve proteomic studies met behulp van Tandem massa Tags (TMT) en/of isobarische tag voor relatieve en absolute kwantificatie (iTRAQ)11,12. Daarnaast kan deze methode iets worden gewijzigd en geoptimaliseerd voor de studie van kleine molecules, zoals metabolieten gevonden in de guard cellen mogelijk maken. Het experiment hier gebruikt de phytohormone ABA als een elicitor voor stomatal beweging in Arabidopsis, maar andere behandelingen kunnen dienovereenkomstig worden gebruikt. Deze methode is ook aan te passen aan andere plantensoorten.
Als gevolg van de proefopzet en de aard van de in dit protocol gebruikte materialen, zijn er enkele kritische stappen. Hoewel peeling uit elkaar de abaxial en adaxial kanten van het blad (stap 2.2), is het belangrijk dat dit gebeurt zonder aarzeling en door toepassing van gelijke zachte druk op beide stukken van de tape, zodat de abaxial laag uniform is nadat het is verwijderd. Het is belangrijk voor het optimaliseren van individuele peeling techniek en spijsvertering tijd voor de plantensoorten in de studie, zoals zij verschillende optimale spijsvertering tijden wellicht. Tijdens de spijsvertering enzym (stappen 2.8-2.10), moeten de schillen keek nauw en gecontroleerd elke 3-5 minuten. Dit is belangrijk omdat kleine verschillen in de lagen van de schillen in sneller of langzamer spijsvertering tijden resulteren zal. Bij de behandeling van de schillen met ABA of andere stimuli (stap 3.1), moeten schillen worden gelijk verdeeld, drijvende en zachtjes te schudden zodat ze nooit overlappen. Schillen die samen blijven steken of overlappen kunnen verschillende resultaten wegens gebrek aan contact met oplossing opleveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Daniel Chen vanaf de digitale Video productie Team van Buchholz High School voor hulp bij het bewerken van de video. Dit onderzoek op stomatal guard cellen, proteomics en metabolomica in het lab Chen heeft gesteund door subsidies van de ons National Science Foundation (0818051, 1158000 en 1412547). Wenwen Kong wordt ondersteund door de Raad van de beurs van China. Dr. Qiuying Pang wordt ondersteund door de China Scholarship Raad en nationale Natural Science Foundation van China (31570396).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
References
- Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
- Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
- Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).
- Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts. New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).
- Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).
- Wu, F. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 10 (2009).
- Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, (2015).
- Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Agnew, B., Murray, D., Patton, W. A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents. Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895). Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
