Summary
Ce protocole décrit une méthode de préparation des cellules de garde des stomates enrichis qui est utile pour des études biologiques physiologiques et autres.
Abstract
L’étude des cellules stomatiques est essentiel à la connaissance des apports spécifiques de ce type de cellule à la fonction globale de plantes. Toutefois, il est souvent difficile d’isoler, et donc les étudier souvent fournit un défi.
Cette étude établit une méthode d’enrichissement stomatique cellules de garde. Le protocole utilise le ruban Scotch pour isoler les cellules stomatiques et extraire des protéines des cellules. Cette méthode améliore l’intégrité et le rendement des cellules de garde lors de l’isolation et fournit un échantillon fiable pour l’étude des processus de signalisation cellulaire et comment elles sont corrélées aux phénotypes mouvement stomatique. Dans cette méthode, les feuilles de la plante ont été partitionnés entre deux portions de la bande et pelées part pour retirer la face abaxiale. Ce protocole a été appliqué aux tissus foliaires Arabidopsis pour isoler les cellules stomatiques. Les cellules ont été traitées avec la fluorescéine diacétate (FDA) pour déterminer la viabilité et l’acide abscissique (ABA) pour évaluer le mouvement des stomates en réponse à ABA. En conclusion, le présent Protocole s’avère utile pour la préparation des cellules de garde des stomates enrichis et isoler des protéines. La qualité des protéines et cellules obtenus ici activation physiologique et autres études biologiques.
Introduction
Stomates jouent un rôle important dans la physiologie et la remise en forme de plantes ensemble. Ces structures spécifiques de plantes minuscules sont formés par deux cellules épidermiques spécialisées appelées cellules stomatiques et sont trouvent plus abondamment sur la face abaxiale des feuilles. Stomates sont nécessaires pour l’échange de gaz entre la plante et l’atmosphère, ainsi que le contrôle des pertes d’eau par transpiration. Réglementer les cellules stomatiques ouverture des stomates grâce à l’intégration de différent externe (par exemple, lumière, humidité, contact de l’agent pathogène, des niveaux de dioxyde de carbone) et internes (p. ex.., hormones endogènes) stimuli1,2. Au cours des 20 dernières années, ce type de cellule est devenu un système modèle pour étudier cellule signalisation processus chez les plantes. Ces cellules forment une petite fraction des cellules totales dans une feuille ; ainsi, afin d’étudier leur cellulaire unique, les propriétés biochimiques et moléculaires d’une manière unicellulaires, il faut les isoler des autres types de cellules de feuille. Dans le passé, études des cellules de garde ont souvent impliqué la préparation des cellules de garde des protoplastes (GCP)3,4,5. Typiquement, cela nécessite l’utilisation de grandes quantités d’enzymes dégradant la paroi cellulaire et ou rupture mécanique par mélange et a prouvé d’être coûteux et fastidieux car il faut généralement plusieurs heures pour préparer un échantillon GCP, souvent de fois avec peu de rendement. Plus important encore, parce que les cellules de garde agissent comme des paires complètes pour réguler l’ouverture des stomates, l’utilisation des BPC peut considérer comme un système artificiel à l’étude de la signalisation des cellules de garde.
Ici, nous avons développé une méthode pour préparer des stomates dans lequel les cellules de garde intactes sont enrichis et maintenir les réactions physiologiques aux stimuli. Cette méthode s’inspire d’une méthode qui a permis d’isoler du mésophylle cellule protoplastes6,7. Dans notre méthode, les stomates sont préparés selon claire ruban Scotch pour séparer tout d’abord la majorité des cellules du mésophylle jointe à la couche adaxiale de la feuille de la couche abaxiale contenant les chaussées et les cellules stomatiques. Cela se fait par l’apposition d’un morceau de ruban de chaque côté de la feuille et les peeling appart. Les cellules de la couche abaxiale sont autorisés à récupérer sous la lumière dans un tampon de l’ouverture des stomates. Plus tard, les cellules restantes de la chaussée sont supprimés à l’aide d’une petite quantité d’enzymes, laissant derrière elle des cellules de garde qui s’enrichissent sur la bande de dégradant les parois cellulaires.
Dans cette méthode simple, stomatiques cellules stomatiques qui soient viables et adaptés peuvent rapidement et efficacement être prêt, en moins d’une heure pour obtenir des cellules de garde des stomates enrichis de 50 peelings avec un coût minime. La méthode ici impose moins de dommages aux cellules végétales que les méthodes précédentes où sont préparés les protoplastes. En outre, les matières recueillies de cette méthode rendement protéines souhaitable s’élève. Surtout, parce que la feuille n’est pas soumise à la fusion ou temps de digestion longue et cellules stomatiques sont intacts, les résultats d’études sera plus étroitement des celui de la garde physique biologie d’une cellule. Avec cette méthode, stomatiques mouvements peuvent être reliées en temps réel à des changements au niveau moléculaire. Ainsi, les connaissances acquises grâce à des études à l’aide de cette méthode de préparation serait important pour une compréhension plus complète de la signalisation des cellules de garde.
Nous avons utilisé la plante Arabidopsis thaliana comme modèle ; Toutefois, le présent protocole peut être appliqué à l’enrichissement de stomatiques cellules stomatiques chez d’autres espèces végétales telles que Brassica napus avec de petites modifications dans le temps de digestion. Comme une preuve de concept, nous avons démontré que stomatiques cellules stomatiques, enrichis par l’intermédiaire de cette méthode sont viables et réactif aux stimuli comme indiqué par le dosage de fluorescéine diacétate (FDA) et les études utilisant l’hormone végétale l’acide abscissique (ABA), respectivement. En outre, nous avons démontré que les protéines de haute qualité peuvent être isolés dans ces cellules stomatiques. Nous décrivons ici un protocole détaillé de ce processus.
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Protocol
1. la culture de plantes
- Faire germer les graines dans le mélange de rempotage. Faire pousser des plantes dans une chambre de croissance avec une intensité lumineuse de 140 µmol photons m−2 s −1 et une photopériode de 8 h à 22 ° C et 16 h de lumière sombre à 18 ° C pendant 2 semaines.
- Repiquez les plantules de tailles similaires individuellement dans 4" diamètre pots contenant du sol et de grandir pour 3 semaines dans les mêmes conditions supplémentaires décrits à l’étape 1.1.
NOTE : Arroser les plantes avec l’eau du robinet deux fois par semaine pour garder le sol humide.
2. préparation des stomates enrichis
- Enlever les feuilles des plantes d’a. thaliana 5 - semaine vieux individuels avec un scalpel.
- Fixez chaque feuille à deux morceaux de ruban adhésif Scotch transparent, avec une seule pièce adhérant aux stomates (dessous) et l’autre pièce adhérant à adaxiale côté (supérieur) de la feuille. Laisser le ruban sur la feuille pendant 5 s.
- Gentle peel apart les deux morceaux de bandes à l’aide de l’index et le pouce de chaque main pour séparer le côté abaxial avec plancher et cellules stomatiques et du côté adaxial avec les cellules du mésophylle.
- Place les pelures de la face abaxiale des feuilles dans 60 mL de stomates ouverture tampon (50 mM de KCl, 10 mM MES-KOH, ajusté à pH 6.2 avec 1 M KOH) en taille 40 mm × 12 mm Petri plats car ils sont prélevés.
- Répétez les étapes ci-dessus jusqu'à ce que toutes les pelures d’échantillon sont prélevés.
- Placer les boîtes de Pétri contenant les épluchures dans la chambre de croissance dans des conditions légères, a indiqué à l’étape 1.1. Laisser les pelures sous la lumière pendant 2 h à pleine ouverture des stomates.
- Place les peelings en boîte de Pétri contenant 50 mL de paroi cellulaire digestion mélange d’enzymes (cellulase 0,7 % R-10, 0.025 % macerozyme R-10, 0,1 % (p/v) polyvinylpyrrolidone-40 et albumine sérique bovine de 0,25 % (p/v) en solution de base de 55 % (0,55 M sorbitol, 0,5 mM 20 mm x 150 mm CaCl2, 0,5 mM MgCl2, l’acide ascorbique 0,5 mM, 10 µM KH2PO4, 5 mM 4-morpholineethanesulfonic acid (MES) à pH 5,7 ajusté avec 1 M KOH).
- Agiter les pelures sur un agitateur réciproque dans un plat de Pétri à 50 tr/min pendant 20 min.
- Supprimer les pelures de solution enzymatique avec des pincettes après 20 min. déposer les pelures dans un Pétri de la taille de 150 x 20 mm contenant 50 mL d’eau.
- À l’aide d’une pipette de transfert, rincer les peelings pour 15 s deux fois avec 10 mL d’eau afin d’éliminer toute solution enzymatique résiduelle.
- Pince à épiler permet de placer des pelures dans un plat de Pétri de taille 150 x 20 mm avec 50 mL de stomates frais ouverture du tampon tel qu’utilisé à l’étape 2.4. Incuber pendant 1 heure dans des conditions légères a indiqué à l’étape 1.1 afin de permettre les stomates à récupérer.
3. l’acide abscissique (ABA) traitement et analyse de mouvement de stomates
- Dans un plat de Pétri de dimensions 150 x 20 mm. Incuber les pelures de stomates enrichi à 30° C pendant 15 min dans 50 mL de tampon ouverture stomatique ou dans 50 mL de tampon ouverture stomatique avec une concentration finale de 10 µM ABA pour le temps de traitement approprié.
- Placez les peelings sur un agitateur à 50 tr/min pendant 5, 15 et 30 min. Après chaque intervalle de temps enlever une peau avec des pincettes et suivez les étapes d’imagerie à l’étape 3.3.
- Prendre des photos des stomates avant traitement à l’ABA et aux divers points de temps après le traitement ABA avec un microscope optique.
- Prendre une pelle et le placer sur une lame de microscope de verre.
- Placer la lame sur la platine du microscope et ajuster la scène afin que l’image de la peau peut être visualisée.
- Régler l’amende et du cours mettant l’accent sur la loupe pour obtenir une image claire des cellules stomatiques.
- Prendre plusieurs images de stomates multiples à un grossissement de 40 X.
- Mesurer 60 ouvertures stomatiques avec ImageJ8.
- Calculer l’écart-type et l’importance à une valeur p < 0,05 des 60 mesures d’ouverture des stomates.
4. protein Extraction et séparation de SDS-Page
- Moudre les pelures pour 15 s dans l’azote assez liquide pour couvrir les peelings à l’aide d’un réfrigéré de mortier et un pilon.
- Par 50 peelings, ajouter 3 mL de phénol Tris saturée (pH 8,8) et 3 mL de tampon d’extraction protéique (0,9 M de sucrose, 0,1 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,4 % 2-mercaptoéthanol, 10 µL d’inhibiteur de protéase et phosphatase 1 mM) avec une pipette pour le mortier et puis moudre les pelures pour addi 5 tional minutes sous une hotte.
- L’extrait à l’aide d’une pipette de transfert et les peelings à l’aide de pinces métalliques pour un Oakridge Centrifuger le tube et agitent dans un agitateur à 50 tr/min pendant 1 h à 4 ° C.
- Retirer les pelures du tube à centrifuger Oakridge et centrifuger l’extrait à 5 000 x g pendant 10 min. Ensuite, transférer la phase phénolique haut de la page dans un nouveau tube propre micro-centrifuge à l’aide d’une pipette.
- Précipité le phénol extraites des protéines en ajoutant 5 volumes de glacé d’acétate d’ammonium 0.1 M à 100 % de méthanol. Vortex brièvement et incuber une nuit à-20 ° C.
- Centrifuger à 20 000 x g à 4 ° C pendant 20 min, éliminer le surnageant en le versant lentement hors du tube et de retenir le culot de protéine dans le tube.
- Laver le culot de protéines deux fois avec l’acétate d’ammonium 0.1 M dans le méthanol, puis deux fois avec 80 % d’acétone et une fois avec de l’acétone froid 100 %.
NOTE : Lavages s’effectuent en ajoutant 10 mL de réactif spécifié au tube de protéine. Agiter dans un agitateur à 50 tr/min pendant 5 min, suivi d’une centrifugation à 15 000 x g à 4 ° C pendant 10 min. Verser ensuite le réactif du tube conservant seulement le culot de protéine. - Ajouter 1 mL d’acétone froid 100 % au culot et remettre en suspension en pipettant également lentement, monter et descendre.
- Suspension de protéine de transfert via la pipette à un tube à centrifuger-micro 2 mL puis centrifuger à 20 000 x g à 4 ° C pendant 5 min.
- Retirer l’acétone par la décantation du tube puis sécher le culot dans la hotte pendant 10 min.
- Dissoudre la protéine dans un tube à centrifuger-micro avec 200 µL de tampon de dissolution (urée 8 M, 0,5 % SDS, 30 mM Tris-HCl pH 8,5) et vortexer pendant 30 min. Centrifuger à 20 000 x g à 15 ° C pendant 20 min et le surnageant dans un nouveau tube à frais virés.
- Quantifier le taux protéique, suivant le protocole de quantification du protéine9.
- Utiliser des échantillons de protéine pour la séparation des protéines par électrophorèse sur gel, suivant le protocole n°10.
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Representative Results
Une image représentative des cellules stomatiques Arabidopsis avant et après que la digestion du mésophylle et des cellules épidermiques est illustrée à la Figure 1. La viabilité des cellules de garde avant et après l’enlèvement du mésophylle et les cellules épidermiques peut être observée à l’aide de FDA pour mesurer l’activité enzymatique et l’intégrité de la membrane cellulaire (Figure 1 b et 1D). La figure 2 illustre le mouvement stomatique d’Arabidopsis en réponse à un traitement ABA. Ouverture des stomates diminue de plus de 50 % après 30 minutes de traitement avec l’ABA. Figure 2 a est une évolution du mouvement de stomates. À divers moments, les photos ont été prises avec un microscope optique. Ouverture des stomates a été mesurée avec ImageJ et les résultats ont été présentés comme la moyenne de 60 à 80 ouverture mesure ± erreurs-types. Une image représentative de l’ouverture des stomates à chaque instant est montrée dans la Figure 2 b. Abondance relative, la séparation et la détection de protéines sont observés par SDS-PAGE (Figure 3). Quatre réplicats biologiques sont inclus pour mettre l’accent sur la reproductibilité de l’extraction de la protéine de cette méthode.
Figure 1 . Fluorescéine diacétate viabilité coloration des cellules de garde avant et après l’enlèvement du mésophylle et les cellules épidermiques. Peelings (A) (non digérées) sous champ lumineux. (B) les peelings (non digérées) et colorées avec la FDA. (C) peelings (digérés) sous lumineux (D) les peelings (digérés) sur le terrain et colorées avec la FDA. Toutes les photos ont été prises à un grossissement de 40 X. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Mouvement stomatique d’Arabidopsis en réponse à ABA. Épiderme ont été épluchés des feuilles complètement développées, avec des cellules épidermiques enlevé et préalablement incubée sous la lumière avec le tampon d’ouverture (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.2) pendant 2 h, puis incubées avec de l’eau ou avec 10 µM un traitement ABA pour 5, 10 et 30 min. (A) Évolution temporelle du mouvement stomatique. (B) image représentative des stomates à chaque point. Les données sont indiquées comme moyen ± écart type de trois expériences indépendantes. Analyse de variance (ANOVA) a été préformé pour analyser les différences moyennes. Différentes lettres indiquent des valeurs moyennes significativement différentes à p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . SDS-PAGE séparer des protéines des cellules stomatiques enrichies à l’aide de la méthode d’extraction de protéine phénol-basé. Quantités égales (40 µg) de protéines ont été résolues à l’aide de 12,5 % sur gel de polyacrylamide et visualisés avec CBB. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les cellules de garde sont un système modèle pour l’étude des mécanismes de transduction de signal dans les plantes et il est important de veiller à ce que la préparation des échantillons utilisés dans l’étude est la plus appropriée pour répondre à des questions biologiques. Malgré l’intérêt croissant pour les cellules de garde au sein de la communauté de recherche plante, il n’y a aucune méthode universelle sur comment préparer les cellules stomatiques stomatiques qui permettrait à la fois le mouvement stomatique et physiologie ainsi que les changements moléculaires à étudier dans un système. Le défi pour les isoler peut être attribué en grande partie à leur petite taille, de faible abondance et de la structure unique, qui peut rendre plus ou moins difficile de les enlever des feuilles entières.
Ce protocole prévoit une méthode sur la manière de surmonter ces obstacles, selon une méthode développés écorces de ruban isolant. La méthode présentée dans le présent protocole fournit un moyen pour isoler les stomates garde les cellules intactes, qui restent physiologiquement sensibles aux stimuli. La préparation de ces échantillons rend possible pour l’extraction des protéines des cellules de garde pouvant servir comme produit de départ pour des études protéomiques détaillées, telles que les études protéomique quantitative utilisant des Tags de masse en Tandem (TMT) et ou balise isobarique pour quantification relative et absolue (iTRAQ)11,12. En outre, cette méthode peut être légèrement modifiée et optimisée afin de rendre possible l’étude des petites molécules, telles que des métabolites dans les cellules de garde. L’expérience ici utilisé la phytohormone ABA comme un éliciteur mouvement stomatique chez Arabidopsis, mais d’autres traitements peuvent être utilisés en conséquence. Cette méthode est également adaptable à d’autres espèces végétales.
En raison de la conception expérimentale et la nature des matériaux utilisés dans le présent protocole, il y a quelques étapes cruciales. Gommage désagrège les côtés abaxiales et adaxiales de la feuille (étape 2.2), mais il est important que cela est fait sans hésiter et en appliquant une pression douce égale pour les deux morceaux de la bande pour que la couche abaxiale soit uniforme après qu’il est supprimé. Il est important d’optimiser le temps de digestion et technique de peeling individuels des espèces végétales dans l’étude car ils peuvent avoir le temps de digestion optimale différentes. Lors de la digestion enzymatique (étapes 2.8-2.10), le peeling doit être surveillé de près et vérifié toutes les 3-5 minutes. Ceci est important parce que les légères différences dans les couches de la peaux seront traduira dans les temps de digestion plus rapide ou plus lent. Lors du traitement les pelures avec ABA ou autres stimuli (étape 3.1), peelings doivent être espacés, flottant et en agitant doucement afin qu’ils ne se chevauchent jamais. Pelures qui se coincer ensemble ou se chevauchent peuvent donner des résultats différents due au manque de contact avec la solution.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.
Acknowledgments
Nous remercions Daniel Chen du numérique vidéo Production équipe de Buchholz High School pour l’assistance au montage de la vidéo. Cette recherche sur les cellules de garde des stomates, protéomique et métabolomique dans le laboratoire de Chen a été soutenue par des subventions de la US National Science Foundation (0818051, 1158000 et 1412547). Wenwen Kong est pris en charge par le China Scholarship Council. M. Qiuying Pang est pris en charge par le China Scholarship Council et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31570396).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
References
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