Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å forberede beriket øverst celler som er nyttig for fysiologiske og andre biologiske studier.
Abstract
Studiet av celler er avgjørende for kunnskap om de spesielle bidragene av denne cellen til funksjonen samlet planter. Men det er vanskelig å isolere og dermed studere dem ofte gir en utfordring.
Denne studien etablerer en lys langsgående vakt celle berikelse metode. Protokollen utnytter teip for å isolere celler og ekstra proteiner fra cellene. Denne metoden forbedrer integritet og avkastning på vakt cellen under isolasjon og gir et pålitelig utvalg for studier av cellen signalnettverk prosesser og hvordan de relateres til øverst bevegelse fenotyper. I denne metoden anlegget bladene delt mellom to deler av tape og skrelles fra hverandre for å fjerne den abaxial siden. Denne protokollen ble brukt Arabidopsis blad vev å isolere celler. Cellene ble behandlet med fluorescein diacetate (FDA) for å bestemme levedyktigheten og abscisic syre (ABA) å vurdere stomata bevegelse svar på ABA. Avslutningsvis beviser denne protokollen nyttig for utarbeidelse beriket øverst celler og isolere proteiner. Kvaliteten på celler og proteiner fått her aktivere fysiologiske og andre biologiske studier.
Introduction
Stomata spiller en viktig rolle i den generelle fysiologi og fitness av planter. Disse små anlegg spesifikke strukturer er dannet av to spesialiserte epidermal celler kjent som celler og er funnet mest rikelig på abaxial overflaten av bladene. Stomata er nødvendig for utveksling av gasser mellom anlegget og atmosfæren, samt kontroll av vanntap gjennom transpirasjon. Celler regulere stomata blenderåpning gjennom integrering av annen ekstern (f.eks, lys, fuktighet, patogen kontakt, karbondioksid nivået) og interne (f.eks., endogen hormoner) stimuli1,2. I de siste 20 årene blitt dette celle type et modellsystem for studere celle signalisering prosesser i planter. Disse cellene utgjør en liten brøkdel av de totale cellene i et blad; Dermed, for å undersøke deres unike mobilnettet, biokjemiske og molekylære egenskaper i en enkeltcelle måte, er det nødvendig å isolere dem fra andre blad celletyper. I siste, har vakt celle studier ofte involvert utarbeidelse av vakt celle protoplasts (GCP)3,4,5. Dette vanligvis krever bruk av store mengder celleveggen nedverdigende enzymer og eller mekanisk avbrudd via blanding og har vist seg å være kostbart og tidkrevende som det vanligvis tar mange timer å forberede et GCP utvalg, ofte tider med liten avkastning. Enda viktigere, fordi celler som fullstendig par å regulere stomata blenderåpning, ses bruk av GCP som en kunstig system å studere vakt celle signalisering.
Her har vi utviklet en metode for å forberede stomata som intakt celler er beriket og vedlikeholde fysiologiske responser på stimuli. Denne metoden ble inspirert av en metode som ble brukt til å isolere mesophyll celle protoplasts6,7. I vår metode forberedt stomata med teip først skille fleste mesophyll cellene knyttet til adaxial laget av bladet fra det abaxial laget som inneholder fortau og celler. Dette gjøres ved påføring et stykke tape på hver side av bladet og flassing dem fra hverandre. Cellene fra abaxial laget kan gjenopprette under lys i en stomata-åpning buffer. Senere fjernes resterende fortauet cellene med en liten mengde cellevegg nedverdigende enzymer, etterlot vakt cellen som er beriket på båndet.
I denne enkle metoden øverst celler som både levedyktig og forståelsesfull kan raskt og være effektivt forberedt, tar mindre enn en time å få beriket øverst celler fra 50 skreller med minimal kostnad. Metoden her legger mindre skade anlegget celler enn tidligere metoder hvor protoplasts er forberedt. I tillegg samlet materiale fra denne metoden avkastning ønskelig protein beløp. Viktigst, fordi bladet ikke er utsatt for blending eller lengre fordøyelsen ganger og celler forblir intakt, vil resultatene av studier nærmere være relevant for en vakt celle naturlig biologi. Med denne metoden kan øverst bevegelser være korrelert i sanntid med endringer på molekylært nivå. Dermed vil kunnskapen fra studier med denne forberedelse metoden være viktig for en mer omfattende forståelse av vakt celle signalisering.
Vi brukte planten Arabidopsis thaliana som modell; men denne protokollen gjelder anriking av øverst celler i andre plantearter som Brassica napus med små modifikasjoner i fordøyelsen tid. Som et bevis på konseptet, har vi vist at øverst celler beriket via denne metoden er levedyktig og responsive til stimuli som vist av fluorescein diacetate (FDA) analyse og studier utnytte plantehormonet abscisic syre (ABA), henholdsvis. I tillegg har vi vist at høy kvalitet proteiner kan isoleres fra disse celler. Her beskriver vi detaljerte protokollen denne prosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voksende planter
- Spire frøene potting blanding. Dyrke planter i en vekst kammer med lav intensitet av 140 µmol fotoner m2 s −1 og en fotoperiode 8 timer lys på 22 ° C og 16 h mørke ved 18 ° C i 2 uker.
- Transplant planter av lignende størrelser individuelt i 4" diameter potter med jord og vokse for ytterligere 3 uker i samme vilkår beskrevet i trinn 1.1.
Merk: Vann planter med vann fra springen to ganger i uken til å holde jorda fuktig.
2. utarbeidelse av beriket Stomata
- Fjern 5 - uke gamle A. thaliana planter individ med skalpell.
- Fest hvert blad til to stykker av klart teip, med ett stykke overholder abaxial (lavere) siden og den andre brikken overholder adaxial (øvre) siden av bladet. La tape på bladet for 5 s.
- Mild peeling apart de to stykker bånd med pekefingeren og tommelen på hver hånd for å skille abaxial siden med fortau og celler og adaxial siden med mesophyll celler.
- Sted skreller fra abaxial side av blader i 60 mL stomata åpne buffer (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, justere pH 6.2 med 1 M KOH) 40 mm × 12 mm størrelse Petri retter som de er samlet.
- Gjenta trinnene ovenfor til alle prøve skreller er samlet.
- Plass Petri retter som inneholder skreller i vekst kammer under lysforhold i trinn 1.1. La skreller under lys for 2 h for å åpne stomata.
- Sted skreller i en 150 mm x 20 mm Petriskål inneholder 50 mL av cellevegg oversikten enzym blanding (0,7% cellulase R-10, 0.025% macerozyme R-10, 0,1% (w/v) polyvinylpyrrolidone-40 og 0,25% (w/v) bovin serum albumin i 55% grunnleggende løsning (0.55 M sorbitol, 0,5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,5 mM askorbinsyre, 10 µM KH2PO4, 5 mM 4-morpholineethanesulfonic syre (MES) ved pH 5.7 justert med 1 M KOH).
- Riste skreller på en gjensidig shaker i en Petriskål 50 RPM for 20 min.
- Fjerne skreller fra enzym løsning med pinsett etter 20 min. overføre skreller til en 150 x 20 mm størrelse bensin fat som inneholder 50 mL vann.
- Bruker en overføring pipette, skyll skreller for 15 s to ganger med 10 mL vann for å fjerne eventuelle gjenværende enzym løsning.
- Bruke pinsett for å plassere skreller i en 150 x 20 mm størrelse Petriskål med 50 mL av fersk stomata åpne bufferen som brukes i trinnet 2.4. Inkuber 1t i lys i trinn 1.1 å tillate stomata å gjenopprette.
3. Abscisic Acid (ABA) behandling og Stomata bevegelse analysen
- I en 150 x 20 mm størrelse Petriskål. Inkuber beriket stomata skreller på 30° C i 15 min i 50 mL av øverst åpning bufferen eller 50 mL av øverst åpning bufferen med en siste konsentrasjon av 10 µM ABA for riktig behandling tid.
- Plasser skreller på en shaker på 50 rpm i 5, 15 og 30 min. Etter hvert tidsintervall fjerne en skallet med pinsett og tenkelig fremgangsmåten i trinn 3.3.
- Ta bilder av stomata før ABA behandling og på ulike tidspunkt etter ABA behandling med lys mikroskop.
- Ta en skallet og plassere den på en barometer microscope skyve.
- Plasser lysbildet på mikroskopet scenen og Juster prosjektstadium slik at bildet av skallet kan visualiseres.
- Juster fine og selvfølgelig fokus på mikroskop for å få et klart bilde av cellene.
- Ta flere bilder av flere stomata på 40 X forstørrelse.
- Måle 60 øverst blenderåpninger bruker ImageJ8.
- Beregn standardfeil og betydning på en p-verdien < 0,05 av 60 øverst blenderåpning målinger.
4. protein utvinning og SDS side separasjon
- Slipe skreller for 15 s i nok flytende nitrogen å dekke skreller bruker en kjølt morter.
- Per 50 skreller, legge 3 mL Tris mettet fenol (pH 8,8) og 3 mL protein utvinning buffer (0.9 M sukrose, 0.1 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,4% 2-Mercaptoethanol, 10 µL av 1 mM protease og fosfatase hemmer) med en pipette til mørtelen og deretter male skreller for 5 tillegg nale minutter i avtrekksvifte.
- Overføre ekstrakt bruker en pipette og skreller ved hjelp av metall pinsett til en Oakridge sentrifuge rør og rist på en shaker på 50 rpm 1t på 4 ° C.
- Fjern skreller fra Oakridge sentrifuge røret og sentrifuge ekstrakt 5000 x g i 10 min. Deretter overføre den øverste fenoliske fasen til en ny ren mikro-sentrifuge tube bruker en pipette.
- Utløse fenol utdraget proteiner ved å legge 5 mengder iskald 0.1 M ammonium acetate i 100% metanol. Vortex kort og ruge over natten på 20 ° C.
- Sentrifuge 20.000 x g på 4 ° C for 20 min, Dekanter nedbryting av langsomt helle den ut av røret og beholde protein pellet i røret.
- Vaske protein pellet to ganger med 0.1 M ammonium acetate i metanol, og deretter to ganger med 80% aceton og én gang med 100% kaldt aceton.
Merk: Vasker gjøres ved å legge 10 mL av angitte reagens til røret protein. Rist på en shaker på 50 rpm for 5 min, etterfulgt av sentrifugering 15.000 x g ved 4 ° C i 10 min. Så helle kastes ut av røret beholder bare protein pellets. - Legge til 1 mL av 100% kaldt aceton pellet og re suspendere av sakte pipettering opp og ned.
- Overføre protein suspensjon via pipette slik 2 mL mikro-sentrifuge deretter sentrifuge 20.000 x g ved 4 ° C i 5 minutter.
- Fjerne aceton ved dekantere det vin fra rør og tørk pellet i avtrekksvifte i 10 min.
- Oppløse proteinet i en mikro-sentrifuge rør med 200 µL oppløsning bufferen (8 M urea, 0,5% SDS, 30 mM Tris-HCl ved pH 8.5) og vortex for 30 min. sentrifuge 20.000 x g ved 15 ° C for 20 min og samle nedbryting i et nytt rør.
- Kvantifisere protein konsentrasjon etter protein kvantifisering protokollen9.
- Bruke protein prøver for proteiner av gel geleelektroforese følge protokollen10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et representativt bilde av Arabidopsis celler før og etter fordøyelsen av de mesophyll og epidermal er vist i figur 1. Guard celle levedyktighet før og etter fjerning av mesophyll og epidermal celler kan observeres med FDA for å måle enzymatisk aktivitet og celle membran integritet (figur 1B og 1 D). Figur 2 viser øverst bevegelse av Arabidopsis svar på ABA behandling. Øverst blenderåpning synker mer enn 50 prosent etter 30 minutter med behandling ABA. Figur 2A er en tid av stomata bevegelse. På ulike tidspunkt, ble bildene tatt med en lys mikroskop. Øverst blenderåpning ble målt med ImageJ og resultatene ble presentert som et gjennomsnitt fra 60 til 80 blenderåpning målinger ± standardfeil. Et representativt bilde av stomata blenderåpning på hvert tidspunkt er vist i figur 2B. Proteinet oppdagelsen, separasjon og relative overflod er observert av SDS-siden (Figur 3). Fire biologiske gjentak er inkludert understreke reproduserbarhet protein utvinning fra denne metoden.
Figur 1 . Fluorescein diacetate levedyktighet farging av celler før og etter fjerning av mesophyll og epidermal celler. (A) skreller (ufordøyd) under lysende felt. (B) skreller (ufordøyd) og farget med FDA. (C) (fordøyd) under lyse felt (D) skreller (fordøyd) og farget med FDA. Alle bildene ble tatt på 40 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Øverst bevegelse av Arabidopsis svar på ABA. Overhuden var skrelles fullt utvidet blader, med epidermal celler fjernes, og pre ruges under lys med åpning bufferen (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.2) for 2 h, og deretter inkubert med vann eller 10 µM ABA behandling for 5, 10 og 30 min. (A) Gang løpet av øverst bevegelse. (B) representativt bilde av stomata på hver gang peker. Dataene vises som betyr ± SE tre uavhengige eksperimenter. Variansanalyse (ANOVA) ble utført for å analysere mener forskjeller. Forskjellige bokstaver angi signifikant forskjellig mener verdiene på p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . SDS side separasjon av proteiner fra beriket celler med fenol-basert protein utvinning metoden. Like mye (40 µg) proteiner ble løst med 12,5% polyakrylamid gel og visualisert med CBB. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er viktig å sikre at utarbeidelse av prøver som brukes i studien er den mest passende for biologiske spørsmål celler er et modellsystem for å studere signal signaltransduksjon mekanismer i planter. Til tross for økende interessen celler i anlegget forskning samfunnet, det finnes ingen universell metode deg øverst celler som ville tillate både øverst bevegelse og fysiologi og molekylære endringene bli studert i en system. Utfordringen å isolere dem kan tilskrives i stor grad deres liten størrelse, lave overflod og unike struktur, som kan gjøre det mer eller mindre vanskelig å fjerne dem fra hele blader.
Denne protokollen inneholder en metode på hvordan man kan overvinne disse hindringene, isolere dem bruke en utviklet tape-skallet. Metoden som presenteres i denne protokollen gir en måte for å isolere intakt øverst celler, som er fysiologisk lydhør overfor stimuli. Utarbeidelse av disse prøvene gjør det mulig for utvinning av vakt celle proteiner som kan tjene som den starte materialet for grundig proteomic studier, som kvantitative proteomic studier utnytte Tandem masse Tags (TMT) og eller isobar koden for relative og absolutte kvantifisering (iTRAQ)11,12. Denne metoden kan i tillegg endres litt og optimalisert for å muliggjøre studiet av små molekyler, som metabolitter i celler. Eksperimentet her utnyttet phytohormone ABA som en elicitor for øverst bevegelse i Arabidopsis, men andre behandlinger kan brukes tilsvarende. Denne metoden er også tilpasses andre plantearter.
Eksperimentell design og materialer som brukes i denne protokollen natur, finnes det noen viktige trinn. Mens peeling hverandre den abaxial og adaxial siden av bladet (trinn 2.2), er det viktig at det er gjort uten å nøle og ved å bruke like lett trykk på begge delene av båndet slik at det abaxial laget er uniform når den er fjernet. Det er viktig å optimalisere individuelle peeling teknikk og fordøyelsen tid for plantearter i studien som de har forskjellige optimal fordøyelse ganger. Under enzym fordøyelsen (trinn 2.8-2.10), skal skreller være overvåket nøye og sjekket hver 3-5 minutter. Dette er viktig fordi små forskjeller i lagene på skreller vil resultere i raskere eller langsommere fordøyelsen ganger. Ved behandling av skreller ABA eller andre stimuli (trinn 3.1), skal skreller være like linjeavstand, flytende og rister forsiktig slik at de aldri overlapper. Skreller at får problemer sammen eller overlapper kan gi forskjellige resultater grunn mangel på kontakt med løsningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Daniel Chen fra Digital Video produksjon Team av Buchholz High School hjelp med redigering av video. Denne forskningen på øverst celler, Proteomikk og metabolomics i Chen lab har blitt støttet av tilskudd fra oss National Science Foundation (0818051, 1158000 og 1412547). Wenwen Kong støttes av Kina stipend rådet. Dr. Qiuying Pang støttes av Kina stipend råd og National Natural Science Foundation i Kina (31570396).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
References
- Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
- Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
- Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).
- Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts. New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).
- Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).
- Wu, F. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 10 (2009).
- Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, (2015).
- Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Agnew, B., Murray, D., Patton, W. A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents. Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895). Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
