Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Stomata Tape-Peel: En förbättrad metod för vakt Cell provberedning

doi: 10.3791/57422 Published: July 15, 2018

Summary

Det här protokollet beskriver en metod för att förbereda berikad stomatala guard celler som är användbar för fysiologiska och andra biologiska studier.

Abstract

Studien av vakt celler är viktigt att kunskap om de specifika bidrag denna celltyp till den totala funktionen av växter. Men det är ofta svårt att isolera och således studera dem ofta ger en utmaning.

Denna studie fastställs en metod för anrikning av stomatala guard cell. Protokollet använder tredjeparts Scotch tejp för att isolera guard celler och extrahera proteiner från cellerna. Denna metod förbättrar integritet och avkastningen av vakt cell under isolering och ger ett tillförlitligt prov för studien av cell signalering processer och hur de korrelerar till stomatala rörelse fenotyper. I denna metod, var i växtblad delat mellan två delar av tejp och skalade isär för att ta bort den abaxial sidan. Detta protokoll tillämpades Arabidopsis bladvävnad att isolera guard celler. Cellerna behandlades med fluorescein diacetat (FDA) att avgöra lönsamhet och abscisic syra (ABA) att bedöma stomata rörelse som svar på ABA. Sammanfattningsvis visar detta protokoll användbar för att förbereda berikad stomatala guard celler och isolera proteiner. Kvaliteten på de celler och proteiner erhöll här aktivera fysiologiska och andra biologiska studier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Stomata har en viktig roll i den övergripande fysiologi och fitness av växter. Dessa små växt särskilda strukturer bildas av två specialiserade epidermala celler kallas guard celler och finns mest rikligt på den abaxial ytan av bladen. Stomata är nödvändiga för utbyte av gaser mellan anläggningen och atmosfären, samt kontroll av vattenförlust genom transpiration. Guard celler reglerar stomata bländare genom integrering av olika externa (t.ex., ljus, luftfuktighet, patogen kontakt, nivåerna av koldioxid) och inre (t.ex., endogena hormoner) stimuli1,2. Under de senaste 20 åren, har denna celltyp blivit modellsystem för att studera cell signalering processer i växter. Dessa celler bildar en bråkdel av de totala cellerna i ett blad; Således, för att undersöka deras unika cellular, biokemiska och molekylära egenskaper i en enskild cell sätt, är det nödvändigt att isolera dem från andra blad celltyper. I förflutnan handlar guard cellstudier ofta utarbetandet av vakt cell protoplasts (GCP)3,4,5. Detta vanligtvis kräver användning av stora mängder cellväggen förnedrande enzymer och eller mekaniska störningar via blandning och har visat vara kostsamma och tidskrävande som det generellt tar många timmar för att förbereda ett GCP prov, ofta gånger med lite avkastning. Viktigare, eftersom guard celler fungera som komplett par att reglera stomata bländare, kan användning av GCP ses som en konstgjord system för att studera guard cellsignalering.

Här har vi utvecklat en metod för att förbereda stomata där intakt guard celler är berikad och upprätthålla fysiologiska reaktioner på stimuli. Denna metod var inspirerad av en metod som användes för att isolera mesophyll cell protoplasts6,7. I vår metod upprättas stomata med tydliga tejp att först separera flertalet mesophyll celler bifogas det adaxial lagret av blad från det abaxial lagret som innehåller trottoaren och guard celler. Detta görs genom anbringande en bit tejp på vardera sidan av bladet och skalar dem isär. Cellerna från det abaxial lagret får återhämta sig under ljus i en stomata-öppning buffert. Senare avlägsnas de återstående trottoar cellerna med hjälp av en liten mängd cellväggen förnedrande enzymer, lämnar bakom guard cell som är berikad på bandet.

I den här enkla metoden stomatala guard celler som är både lönsamt och lyhörd kan snabbt och vara effektivt beredda, tar mindre än en timme att få berikade stomatala guard celler från 50 peeling med minimal kostnad. Metoden här medför mindre skada på växtcellerna än tidigare metoder där protoplasts tillagas. Dessutom material som samlats in från denna metod avkastning önskvärt protein belopp. Viktigast av allt, eftersom bladet inte utsätts för blandning eller långa matsmältningen gånger och guard celler förbli intakt, kommer resultaten av studier närmare vara relevant som en vakt cellens naturliga biologi. Med den här metoden kan vara korrelerade stomatala rörelser i realtid med förändringar på molekylär nivå. Således skulle den kunskap som erhållits från studier med denna förberedelse metod vara viktigt för en mer omfattande förståelse av vakt cellsignalering.

Vi använde växten Arabidopsis thaliana som en modell; Detta protokoll kan emellertid tillämpas på anrikningen av stomatala guard celler i andra växtarter såsom Brassica napus med små ändringar i koktiden. Som ett bevis på konceptet, har vi visat att stomatala guard celler berikad via denna metod är livskraftig och lyhörda för stimuli som visas av fluorescein diacetat (FDA) analys och studier utnyttjar anläggningen hormon abscisic syran (ABA), respektive. Dessutom har vi visat att högkvalitativa proteiner kan isoleras från dessa guard celler. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll av denna process.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. plantor

  1. Gro fröna i krukväxtjord blandning. Odla växter i en tillväxt kammare med en ljusintensitet 140 µmol fotoner m−2 s −1 och en fotoperiod 8 h ljus vid 22 ° C och 16 h mörkt vid 18 ° C i 2 veckor.
  2. Fröplantorna av liknande storleksanpassar individuellt 4 ”diameter krukor som innehåller smutsa och växa ytterligare-3 veckor på samma villkor som beskrivs i steg 1,1.
    Obs: Vatten växter med kranvatten två gånger i veckan för att hålla jorden fuktig.

2. beredning av berikade Stomata

  1. Ta bort bladen av 5 - vecka-gammal A. thaliana växter enskilda med en skalpell.
  2. Tillmäter två bitar av klar tejp, varje blad med en bit ansluter sig till abaxial (undersidan) och den andra bit som ansluter sig till adaxial (övre) sidan av bladet. Lämna bandet på lövet för 5 s.
  3. Mild peeling isär två bitar av band för att skilja den abaxial sidan med trottoaren och guard celler och den adaxial sidan med mesophyll celler med pekfinger och tummen på varje hand.
  4. Plats peeling från abaxial sida av bladen i 60 mL stomata öppna buffert (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, justerad till pH 6,2 med 1 M KOH) i 40 mm × 12 mm storlek Petri rätter som de samlas.
    1. Upprepa stegen ovan tills alla prov peeling samlas.
  5. Placera de petriskålar som innehåller peeling in i tillväxt kammaren ljus villkor som anges i steg 1,1. Lämna peeling under ljuset för 2 h att fullt ut öppna klyvöppningar.
  6. Plats peeling i en 150 mm x 20 mm petriskål innehållande 50 mL cellväggen smälta enzym blandning (0,7% cellulase R-10, 0.025% macerozyme R-10, 0,1% (w/v) polyvinylpyrrolidon-40 och 0,25% (w/v) bovint serumalbumin i 55% grundläggande lösning (0.55 M sorbitol, 0,5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,5 mM askorbinsyra, 10 µM KH2PO4, 5 mM 4-morpholineethanesulfonic syra (MES) vid pH 5,7 justeras med 1 M KOH).
  7. Skaka peeling på en ömsesidig shaker i en petriskål vid 50 rpm i 20 min.
  8. Ta bort peeling från enzym lösning med pincett efter 20 min. överföra peeling till en 150 x 20 mm storlek petriskål innehållande 50 mL vatten.
  9. Med överföring pipett skölj peeling för 15 s två gånger med 10 mL vatten för att avlägsna eventuell kvarvarande enzym lösning.
  10. Använda pincett för att placera peeling i en 150 x 20 mm storlek petriskål med 50 mL färsk stomata öppna buffert som används i steg 2,4. Inkubera i 1 h i ljusförhållanden som anges i steg 1.1 att tillåta stomata återställa.

3. Abscisic syra (ABA) behandling och Stomata rörelse Assay

  1. I en 150 x 20 mm storlek petriskål. Inkubera berikad stomata peeling vid 30° C i 15 min i 50 mL stomatala öppning bufferten eller i 50 mL stomatala öppning bufferten med en slutlig koncentration på 10 µM ABA för lämplig behandling gången.
  2. Placera peeling på en shaker vid 50 rpm för 5, 15 och 30 min. Efter varje tidsintervall ta bort en skal med pincett och imaging enligt instruktionerna i steg 3.3.
  3. Ta bilder av stomata före ABA behandling och vid olika tidpunkter efter ABA behandling med ett ljusmikroskop.
    1. Ta en peeling och placera den på ett glas objektglas.
    2. Placera bilden på Mikroskop scenen och justera scenen så att bilden av skalet kan visualiseras.
    3. Justera bötesbeloppet och jagar fokus på mikroskopet att få en tydlig bild av vakt cellerna.
    4. Ta flera bilder av flera stomata på 40 X förstoring.
  4. Mät 60 stomatala öppningar använder ImageJ8.
  5. Beräkna standardfel och betydelse på ett p-värde < 0,05 av 60 stomatala bländare mätningar.

4. protein utvinning och SDS-Page Separation

  1. Slipa peeling för 15 s i tillräckligt flytande kväve att täcka peeling med en kyld mortel och stöt.
  2. Per 50 peeling, tillsätt 3 mL av Tris mättad fenol (pH 8,8) och 3 mL protein utvinning buffert (0,9 M sackaros, 0.1 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,4% 2-merkaptoetanol, 10 µL av 1 mM proteas och fosfatas hämmare) med en pipett till murbruk och sedan slipa peeling för 5 addi tionella minuter i dragskåp.
  3. Överföra extraktet med hjälp av en pipett och peeling med metall pincett till ett Oakridge Centrifugera röret och agitera på en shaker vid 50 rpm för 1 h vid 4 ° C.
  4. Ta bort peeling från Oakridge centrifugröret och Centrifugera extraktet på 5 000 x g i 10 min. Sedan överföra den översta fenoliska fasen till en ny ren mikro-centrifugrör med pipett.
  5. Fällningen av fenol extraherade proteiner genom att lägga till 5 volymer iskall 0,1 M ammoniumacetat i 100% metanol. Vortex kort och inkubera över natten vid-20 ° C.
  6. Centrifugera vid 20 000 x g vid 4 ° C i 20 min, Dekantera supernatanten genom att sakta hälla det ur röret och behålla protein pelleten i röret.
  7. Tvätta protein pelleten två gånger med 0,1 M ammoniumacetat i metanol, och sedan två gånger med 80% aceton och en gång med 100% kallt aceton.
    Obs: Tvättar görs genom att tillsätta 10 mL angivna reagens till röret av protein. Agitera på en shaker vid 50 rpm för 5 min, följt av centrifugering vid 15 000 x g vid 4 ° C i 10 min. Häll sedan reagensen ur röret behåller endast protein pelleten.
  8. Tillsätt 1 mL 100% kallt aceton till pelleten och slamma genom pipettering långsamt upp och ner.
  9. Överföra protein suspension via pipett till en 2 mL mikro-centrifugrör sedan Centrifugera 20 000 x g vid 4 ° C i 5 min.
  10. Ta bort aceton genom dekantering det från röret och torka pelleten i dragskåp i 10 min.
  11. Lös upp proteinet i ett mikro-centrifugrör med 200 µL upplösning buffert (8 M urea, 0,5% SDS, 30 mM Tris-HCl vid pH 8,5) och virvel för 30 min. Centrifugera vid 20 000 x g vid 15 ° C i 20 min och samla supernatanten i en ny tub.
  12. Kvantifiera protein koncentrationen efter protein kvantifiering protokoll9.
  13. Använda protein prover för protein separation med gelelektrofores efter de protokoll10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En representativ bild av Arabidopsis guard celler före och efter matsmältningen mesophyll och epidermala celler visas i figur 1. Guard cellviabilitet före och efter borttagning av mesophyll och epidermala celler kan observeras med hjälp av FDA för att mäta enzymaktiviteten och cellmembranet integritet (figur 1B och 1 D). Figur 2 illustrerar stomatala rörelse av Arabidopsis i ABA behandlingssvaret. Stomatala bländare minskar mer än 50 procent efter 30 minuters behandling med ABA. Figur 2A är en dags kurs stomata rörlighet. Vid olika tidpunkter, är bilder tagna med ett ljusmikroskop. Stomatala bländare mättes med ImageJ och resultaten presenterades som ett genomsnitt från 60 till 80 bländare mätningar ± standard fel. En representativ bild av stomata bländaren vid varje tidpunkt visas i figur 2B. Identifiering av protein, separation och relativa överflöd observeras av SDS-PAGE (figur 3). Fyra biologiska replikat ingår att betona reproducerbarheten för protein utvinning från denna metod.

Figure 1
Figur 1 . Fluorescein diacetat livskraft färgning av vakt celler före och efter borttagning av mesophyll och epidermala celler. (A) peeling (osmält) under ljusa fält. (B) peeling (osmält) och färgas med FDA. (C) peeling (rötas) under ljusa fält (D) peeling (rötas) och färgas med FDA. Alla bilder är tagna på 40 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Stomatala rörelse av Arabidopsis svar på ABA. Epidermis skalades från fullt utvecklat blad, med epidermala celler tas bort, och pre inkuberas under ljus med öppning bufferten (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6,2) för 2 h, och sedan inkuberas med vatten eller med 10 µM ABA behandling för 5, 10 och 30 min. (A) Tidsförloppet för stomatala rörelse. (B) representativ bild av stomata på varje gång peka. Uppgifterna presenteras som medel ± SE tre oberoende experiment. Variansanalys (ANOVA) var förformade för att analysera genomsnittliga skillnader. Olika bokstäver anger signifikant medelvärdena på p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . SDS-PAGE separation av proteiner från berikade guard celler med fenol-baserade protein utvinning metod. Lika (40 µg) mängder proteiner har lösts med hjälp av 12,5% polyakrylamidgel och visualiseras med CBB. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Guard celler är ett modellsystem för att studera signaltransduktion mekanismer i växter och det är viktigt att säkerställa att beredning av prover som används i studien är den mest lämpliga att besvara biologiska frågor. Trots det öka intresset i guard celler inom forskarsamhället växt, finns det ingen universalmetod om hur att förbereda stomatala guard celler som skulle tillåta både stomatala rörelse och fysiologi samt de molekylära förändringarna studeras i en systemet. Utmaningen att isolera dem kan hänföras till stor del till deras liten storlek, låg överflöd och unika struktur, som kan göra det mer eller mindre svårt att ta bort dem från hela blad.

Detta protokoll ger en metod för hur att övervinna dessa hinder, isolera dem med en utvecklad tejp-peel metod. Metoden presenteras i detta protokoll ger ett sätt för att isolera intakt stomatala guard celler, som förblir fysiologiskt lyhörda för stimuli. Beredning av dessa prover gör det möjligt för utvinning av vakt cellproteiner som kunde fungera som utgångsmaterial för djupgående proteomiska studier, såsom kvantitativa proteomiska studier utnyttjar Tandem Mass Taggar (TMT) och eller isobariska tagg för relativa och absoluta kvantitering (iTRAQ)11,12. Dessutom, kan denna metod ändras något och optimerad för att möjliggöra studier av små molekyler, som metaboliter som påträffas i guard celler. Experimentet här utnyttjas phytohormone ABA som en anstränga för stomatala rörelse i Arabidopsis, men andra behandlingar kan användas med detta. Denna metod kan också anpassas till andra växtarter.

På grund av experimentell design och vilken typ av material som används i detta protokoll, finns det några viktiga steg. Medan peeling isär abaxial och adaxial sidorna av bladet (steg 2.2), är det viktigt att det görs utan att tveka och genom att tillämpa lika lätt tryck båda bitar av bandet så att det abaxial lagret är enhetlig efter det avlägsnas. Det är viktigt att optimera enskilda peeling teknik och matsmältning tid för växtarterna i studien eftersom de kan ha olika optimal matsmältning gånger. Under enzym matsmältningen (steg 2,8-2.10), bör peeling bevakas noga och kontrolleras varje 3-5 minuter. Detta är viktigt eftersom vissa skillnader i lagrarna av peeling kommer att resultera i snabbare eller långsammare matsmältningen gånger. Vid behandling av peeling med ABA eller andra stimuli (steg 3.1), bör peeling vara jämnt fördelade, flytande och skaka försiktigt så att de aldrig överlappa. Peeling som fastnar tillsammans eller överlappar kan ge olika resultat på grund av brist på kontakt med lösningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter förklarade.

Acknowledgments

Vi tackar Daniel Chen från Digital Video produktion Team av Buchholz högstadiet för hjälp med att redigera video. Denna forskning på stomatala guard celler, proteomik och metabolomik i Chen labbet har fått stöd genom bidrag från oss National Science Foundation (0818051, 1158000 och 1412547). Wenwen Kong stöds av Kina stipendium rådet. Dr. Qiuying Pang stöds av Kina stipendium rådet och National Natural Science Foundation Kina (31570396).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stainless Steel Surgical Scalpel Feather   NC9999403
Scotch Tape (3M) ULINE S-9781
Petri Dish Sigma-Aldrich BR455701
Cellulase (Onozuka R-10)  Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. 21560003-3
Macerozyme R-10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. 21560003-4
DM6000B Microscope  Leica Microsystems
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails Thermo Fisher Scientific   PI78443
Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 3119-0030
EZQ Protein Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific R33200
Fluorescein Diacetate (FDA) Thermo Fisher Scientific F1303
Abscisic Acid Sigma-Aldrich A4906
Metro Mix 500 BWI Companies  TX-500
Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737
Bio-Safe Comassie (G-250) Bio-Rad 161-0786
Microcentrifuge Tube (2mL) USA Scientific, Inc. 1620-2700
ImageJ software National Institute of Health
Tweezers  Sigma-Aldrich F4017-1EA
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1043
Microscope slides Fisherbrand 12-550-A3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69, (4), 451-462 (2009).
  2. Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
  3. Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26, (8), 844-849 (2013).
  4. Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts. New Phytologist. 153, (3), 517-526 (2002).
  5. Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, (12), 4108-4112 (1987).
  6. Wu, F. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 10 (2009).
  7. Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, (2015).
  8. Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  9. Agnew, B., Murray, D., Patton, W. A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents. Electrophoresis. 25, (15), 2478-2485 (2004).
  10. He, F. Laemmli-SDS-PAGE. Bio-protocol. Bio101, (80), (2011).
  11. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895). Analytical Chemistry. 78, (12), 4235-4235 (2006).
  12. Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7, (3), 340-350 (2007).
Stomata Tape-Peel: En förbättrad metod för vakt Cell provberedning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lawrence II, S., Pang, Q., Kong, W., Chen, S. Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation. J. Vis. Exp. (137), e57422, doi:10.3791/57422 (2018).More

Lawrence II, S., Pang, Q., Kong, W., Chen, S. Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation. J. Vis. Exp. (137), e57422, doi:10.3791/57422 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter