Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Анализ минералов, производимые hFOB 1.19 и Saos-2 клетки с помощью просвечивающей электронной микроскопии с энергии энергодисперсионный рентгеновский микроанализ

doi: 10.3791/57423 Published: June 24, 2018

Summary

Мы представляем протокол для сравнения состояния минералов в везикулы, выпущенное две человеческие кости клеточных линий: hFOB 1.19 и Saos-2. Их минерализации профили были проанализированы по ализарин красный-S (AR-S) окрашивание, ультрафиолетового (УФ) света визуализации, передачи изображений электронной микроскопии (ТЕА) и энергии, дисперсионный рентгеновский микроанализ (EDX).

Abstract

Это видео представляет использование просвечивающей электронной микроскопии с энергии, дисперсионный рентгеновский микроанализ (ТЕА-EDX) для сравнения состояния минералов в везикулы, выпущенное две человеческие кости клеточных линий: hFOB 1.19 и Saos-2. Эти клеточные линии, после лечения с аскорбиновой кислотой (AA) и β-Глицерофосфат (β-GP), пройти полный Остеогенные transdifferentiation от распространения к минерализации и производим Матричные везикулы (МВС) которые вызывают нуклеации апатита в внеклеточная матрица (ECM).

Основываясь на окрашивание ализарин красный-S (AR-S) и анализ состава минералов в lysates клетки с помощью ультрафиолетового (УФ) света или пузырьки с помощью изображений ТЕА, следуют EDX количественный и Ион сопоставления, можно заключить, что остеосаркома Saos-2 и osteoblastic hFOB 1.19 клетки раскрыть собственный минерализации профили. Saos-2 клетки минерализации более эффективно, чем hFOB 1.19 клетки и производят больше полезных ископаемых, которые не видны под УФ света, но похожи на гидроксиапатита (га) в том, что они имеют больше Ca и F замен.

Результаты, полученные с помощью этих методов позволяет нам заключить, что процесс минерализации отличается в зависимости от типа ячейки. Мы предлагаем, что, на клеточном уровне, происхождение и свойства везикулы предопределить тип минералов.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Кость — это тип соединительной ткани, состоящей из двух частей: органические (клетки и коллагеновые волокна) и минеральных (соединений кальция и фосфата). Основные минеральные компоненты в кости, Апатиты1. Различные типы минерализации компетентных клеток в кости (остеобласты), зубы (odontoblasts) и хряща (хондроцитов) регулируют первоначальные шаги минерализации, производя белков внеклеточного матрикса (ECM) и выпускать матрица везикулы (МВС) (рис. 1). МВС являются 100-300 Нм диаметр пузырьков, которые накапливаются кальция и фосфатов, содействия апатита нуклеации и впоследствии связать коллаген2,3. Затем MVs дезинтегрируют выпустить апатитов внеклеточных среды. Апатиты продолжают расти при контакте с коллагеновых волокон и формируют костной матрицы. Минерализация подкрепляется постоянные поставки P,я и Ca2 + в внеклеточных среды. Некоторые недавно опубликованные данные поддерживают нашу модель4,5. Мягких тканей не минерализации в физиологических условиях. Однако эктопической кальцификации может произойти в патологических условиях например сосудистой кальцификации3. Сосудистые клетки, которые приобретают остеобластов фенотипом могут производить MVs, которые вызывают нуклеации апатитов и инициировать минерализации в медиальной и интимы слои стенки кровеносных сосудов. Начиная с эктопической кальцификации напоминают нормальный endochondral минерализация3, понимание молекулярных механизмов минерализация костных клеток и хондроцитов следует обеспечить некоторые подсказки на Эктопическая кальцификация мягких тканей, которые являются сформирован.

Развитие скелетных тканей регулируется различные ферменты, факторы роста и промоутеров или ингибиторов минерализации. Антагонистическое действие ткани неспецифические щелочной фосфатазы (TNAP) (рис. 1) и ectonucleotide пирофосфатаза/фосфодиэстеразы я (NPP1), вместе с Анкирины (АНК), контролирует концентрации неорганических пирофосфат (PPя) 6. PPя, мощным ингибитором формирования HA, гидролизуется по TNAP; NPP1 гидролизует нуклеотидов трифосфаты сформировать PP,я пока ANK экспортирует PP,я из ячейки в ECM. Pi/PPi соотношение может регулировать апатита формирования7,8 возможных патологических последствий9.

Мембрана MV обогащается в ионный транспорт белков, которые облегчают начальный осадков кальция и фосфатов внутри векторы во время процесса нуклеации (рис. 1). Фосфат транспортер 1 (Пит) помогает включить Pя сгенерирована perivesicular пространства в МВС10,11. Аннексины могут быть вовлечены в привязке и транспорта Ca2 + и в процессе биофизических, который инициирует минерализации в MV просвета12,13. Мы выступаем за гипотеза, предложил ранее, для минерализации в интрацитоплазматической пузырьков внутреннего нуклеации апатита внутри мВ до его распространения в ECM14,15. В vitro моделирования подтвердил индукции формирования Ca2 +/ pя комплексов в proteoliposomes из16Л.С. и AnxA5. Это может означать, что накопление Ca2 +, P,я, AnxA5 и ПС комплексов в липидной плоты микроворсинки как membranesrepresent нуклеации ядро (NC) апатита в пределах Мпротив Аннексины и TNAP обладают также коллаген привязки возможности, которые могут быть полезны в размещении MVs вдоль волокон коллагена и в стимулировании распространения минерализации в ECM. Fetuin A и Остеопоэтин (OPN)17, известны как ингибиторы формирования апатита, которая может замедлить распространение минерализации на коллагеновых эшафот. Зарождения и распространения являются различные события, бывший до последнего, и оба могут быть актуальными для процесса патологических минерализации.

Чтобы узнать, как химический состав кальция фосфат комплексов могут изменить физиологических минерализации и эктопической кальцификации, это необходимо для идентификации минералов, производимые клеток. Апатиты группа кальция и фосфатов, содержащие минералы с общего кристалл блок клеток формулой Ca10(PO4)6X2, где X = Cl, F, OH. Они классифицируются следующим образом18: fluorapatite (ФА) Ca6F10(PO4)2, хлорапатитом (CA) Ca10(PO4)6Cl2 и гидроксиапатита (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.

Выбор остеобластов клеточных линий, чтобы побудить минеральные образования имеет решающее значение, поскольку в каждой ячейке строки экспонатов собственный профиль минерализации. В настоящем докладе, мы сравнили нуклеации минералов на две отдельных клеток человека модели минерализации: osteoblastic hFOB 1.19 клетки и клетки остеосаркома Saos-2. Остеосаркома, полученных клетки обычно используются как osteoblastic модели и Saos-2 клетки сохранили наиболее зрелой osteoblastic характер19 пока недифференцированные человеческого плода hFOB клетки широко используются как модель для нормальной osteoblastic дифференциация20. Их минерализации профили были проанализированы различными методами: пятнать ализарин красный-S (AR-S), ультрафиолетового (УФ) света визуализации, передачи электронной микроскопии (ТЕА) изображений, энергии энергодисперсионный рентгеновский микроанализ (EDX) количественный и Ион сопоставление. Преимущество ТЕА-EDX над альтернативные методы, используемые в предыдущих исследованиях является, что она дает количественные и качественные результаты замены иона в апатита кристаллов4,5,21. Общая цель использования ТЕА-EDX состояла в том, чтобы найти простой способ для создания образов и количественной оценки распределения ионов Ca, F и Cl в различных минералов из различных типов клеток на различных этапах процесса минерализации. Этот метод успешно используется, например, для контроля взаимодействия цинка наночастиц с сосуществующих химических веществ и их совокупное воздействие на водные организмы22. В другом исследовании, медные фотокатализатор на титановые материалы в водном растворе широко характеризуется с помощью индуктивно связанной плазмы оптической эмиссионной спектрометрии (ICP-OES), N2 physisorption (BET), Дифракционные, UV-vis DRS, FT-IR, Раман спектроскопия, ТЕА-EDX и фотоэлектрохимические измерения23. Нашей целью было сравнить происхождение и свойства везикулы и минералов в двух клеточных линий, чтобы понять механизм, который управляет минерализации при костной дифференциации.

Figure 1
Рисунок 1 . Схема из первоначальных шагов минерализации в костных клеток, синтез белков внеклеточного матрикса (ECM) и выпуска Матричные везикулы (МВС) от мембраны. МВС накопления кальция через действия кальция связывания белков, Аннексины и фосфат, через действие неорганического фосфата транспортера (Пит) следуют активности тканей неспецифической щелочной фосфатазы (TNAP), который dephosphorylates PPя Pя, способствуя апатита зародышеобразования. Затем MVs распадаться и отпустите апатитов внеклеточных среды. Минерализация поддерживается постоянной поставке P,я и Ca2 + в внеклеточной средний4,5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. клетки культуры и лечение

  1. Положите все необходимые материалы под капотом ламинарного потока и стерилизовать их под УФ светом. Средства массовой информации культуры являются: 1:1 смесь ветчины F12 и DMEM СМИ с 2,5 мм L-глютамин дополнена 100 ед/мл пенициллин, 100 ед/мл стрептомицина, 0,3 мг/мл G418 и 10% плода Bovine сыворотки (ФБС) (v/v) для человеческого плода hFOB 1.19 SV40 большой T антигена transfected остеобласты и средний Маккоя 5а с 1,5 мм L-глютамин 100 ед/мл пенициллин, 100 ед/мл стрептомицина и 15% FBS (v/v) для клеток человека остеосаркома Saos-2.
  2. Культура клетки hFOB 1.19 в 34 ° C в атмосферу 5% CO2 и Saos-2 клетки при 37 ° C в атмосферу 5% CO2. Передача культур клеток, либо hFOB 1.19 или Saos-2 клетки, от инкубатора для Ламинарный шкаф и изменения среды до 10 мл свежей питательной среды с FBS.
  3. Инкубировать клетки без стимуляторов (отдых клетки) или стимулировать их с 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (AA) следуют 7,5 мм β-Глицерофосфат (β-GP), подготовленных ранее в сверхчистой воды и фильтруют через 0,22 мкм шприц фильтры. Добавьте стимуляторов из трубы пластиковые microcentrifuge на поверхность питательной среды. Аккуратно перемешать культуры блюдо и инкубировать в течение 7 дней.

2. Определение минералов кальция

  1. Мыть клеточных культур с фосфатного буфера физиологический (PBS: 125 мм NaCl, 5 мм KCl, 10 мм Na2HPO4, 1 мм х2PO4, pH 7.0).
  2. Добавьте 5 мл 2% (g:100 мл) AR-S в PBS, pH 5,0 и инкубировать пластины для 30 минут, чтобы пятно минералов.
  3. Вымойте 3 раза с PBS. Тщательно добавить PBS на стене блюдо, не пытаться уничтожить минералов.
  4. Соблюдать минералов кальция под Перевернутый световой микроскоп и принимать изображения.

3. Визуализация зондов под УФ света

  1. Для lysates клетки лечить культур клеток, отдыхает или стимулировали за 7 дней, согласно протоколу пищеварение коллагеназы24.
  2. Собирать средства от клеточных культур и вымыть клетки с PBS.
  3. Дайджест клетки с 3 мл 500 коллагеназы ед/мл в растворе 0,25 М сахарозы, 0,12 М NaCl, 0,01 М KCl и 0,02 М трис-HCl буфере, рН 7.45, при 37 ° C в течение 3 ч.
  4. Механически очистите клетки, их передачу microcentrifuge пластиковые трубы и передавать их 10 раз через 1 мл 40 U шприц с иглой 0.5 × 16.
  5. Центрифугуйте образцы на 500 g × 5 мин.
  6. Отменить супернатант и приостановить Пелле клеток в 500 мкл синтетических хряща лимфы (SCL, 100 мм NaCl, 12,7 мм KCl, 0,57 MgCl2, 1,83 мм NaHCO3, 0,57 NaH2PO4, 5.5 мм D-глюкоза, сахароза 63 мм, 16,5 мм Hepes, рН 7,4).
  7. Передача гидроксиапатита (га), fluorapatite (ФА) и хлорапатитом (CA) порошков из бутылки на УФ transilluminator с помощью шпателя и использовать в качестве элементов управления.
  8. Передача lysates клетки из пластиковых труб с наконечники и тщательно место на transilluminator УФ.
  9. Возьмите изображения под видимой и УФ света.

4. Подготовка зонды для ТЕА EDX

  1. Подготовка минералов для отрицательных пятнать
    1. Приостановить 2,5 мг синтетическим HA, CA и FA минералы25 500 мкл деионизированной воды и инкубировать при 37 ° C в атмосферу 5% CO2 на 1 ч.
    2. Возьмите Formvar/углерода 300 Mesh Ni сетки из коробки с Антистатический пинцет, место на нескольких хорошо тарелка и падение 10 мкл HA, CA и FA суспензий на сетках.
    3. Сухие образцы для 30 мин при комнатной температуре.
  2. Подготовка отдыхает и стимулировал клетки для встраивания 26
    1. Собирать среднего от клеточных культур и вымыть клетки с физиологической десенсибилизации (PD) средний (125 мм NaCl, 5 KCL, 10 мм NaHCO3, 1 мм х2PO4, глюкоза 10 мм, 20 мм HEPES, рН 7,4).
    2. Исправьте клетки с 5 мл смеси 3% (g:100 мл) paraformaldehyde/1% (g:100 мл) глютаральдегид в буфере натрия фосфат 100 мм, pH 7.2, за 1 ч при комнатной температуре под зонт.
    3. Вымыть клетки с 5 мл 100 мм натрия фосфат буфера и аккуратно удалить буфер после стирки.
    4. В темной комнате постфиксная образцы с 2 мл 1% (g:100 мл) осмия тетраоксид в буфере натрия фосфат 100 мм, pH 7.2, для 20 мин при комнатной температуре под зонт.
    5. Удаление осмия тетраоксид и использовать его.
    6. Вымойте клетки с 5 мл, натрия фосфат буфера 100 мм.
    7. Затем, обезвоживает образцы в 5 мл аликвоты градуированных этанола раствор серии при комнатной температуре: 25% (об.) за 5 мин, 50% (об.) за 10 мин, 75% (об.) за 15 мин, 90% (об.) за 20 мин. Наконец, используйте абсолютного этанола дважды и Инкубируйте 30 мин и 12 ч.
    8. Механически скрести клетки от пластиковых культуры Петри, собирать в пробирки пластиковые microcentrifuge и Центрифугуйте образцы на 130 x г за 1 мин.
    9. Удаление supernatants и приостановить клеток в 1 мл смеси LR белой смолы и абсолютного этанола в том соотношении 1:2.
    10. Хорошо перемешайте содержимое стеклянных трубок перед использованием и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.
    11. Центрифугуйте образцы на 130 x г за 1 мин.
    12. Удаление supernatants и повторите предыдущий шаг, используя 1 мл раствора 1:1 смесь LR белой смолы и абсолютного этанола.
    13. Хорошо перемешайте и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.
    14. Центрифугуйте образцы на 130 x г за 1 мин.
    15. Удаление supernatants.
    16. Наконец добавить 1 мл чистого белого LR смолы в образцы дважды и инкубировать 1 час при комнатной температуре в пластиковых тубах.
    17. Поместите 500 мкл каждого образца в желатиновых капсулах.
      Примечание: Образцы помечены с помощью небольшой лист бумаги и карандаш, чтобы смола не уничтожить этикетки.
    18. Закройте желатиновых капсул, поместите их в пластиковый microcentrifuge трубы и центрифуги на 130 x г за 1 мин в ротор.
    19. Удаление капсулы из пластиковых трубок с помощью вакуумного насоса.
    20. Перемещение образцов в печь и полимеризоваться в 56 ° C в течение 48 часов.
    21. Подготовьте блоки, монтируя их в держатель и обрезки их пирамиды.
    22. Вставьте держатель ultramicrotome, прикрепить Алмазный нож Ultra 45° и заполнить его с дейонизированной водой; не забудьте очистить лезвие от случайных пузырьков.
    23. Затем вырежьте разделов (700 Å) с использованием алмазный нож на деионизованной воде ванны.
    24. Установите обрезки с помощью бычьего ресниц и место, где их на блестящей стороне 300 Formvar/углерода сетки сетка Ni и высушите их.
    25. Подготовьте ацетат уранила 2,5% (об.) в абсолютного этанола в темноте под вытяжного шкафа. Держите уранила ацетат в контейнере свинца и не забудьте забрать в отложениях.
    26. В темной комнате counterstain сетки синтетических апатитов и образцы клетки с 2,5% (об.) уранила ацетат в этиловом спирте в течение 20 минут при комнатной температуре под зонт.
    27. Для очистки сетки в 50% этанола (vol.), затем в деионизированной воде и сушат при комнатной температуре в течение 24 ч. Наконец Положите сетки в поле.

5. ТЕА EDX анализ

  1. ТЕА изображений, просвечивающий электронный микроскоп (ТЕА) оснащены полный диапазон энергии энергодисперсионный рентгеновский микроанализ (EDX) системы и 11 мегапиксельной камерой
    1. Подготовьте бериллия держатель для наблюдения клеток и минералов. Антистатические средства используйте.
    2. Удаление пары винтов и поднимите пластину бериллия и бериллия шайбы от остальной части фиксатор.
    3. Смонтируйте сетки, блестящей стороной вверх, на держателе.
    4. Тщательно место бериллия Стиральная машина и плита бериллия и плотно завинтите винты крепления.
    5. Поместите держатель в вакуумной камере и включите вакуумный насос.
    6. Как только достигнуто вакуума аккуратно вставьте держатель в тепловизионной камеры и включите луча.
    7. На флуоресцентные монитора установите параметры диафрагмы микроскопа. Коррекции астигматизма изображения; Установите зум, фокус и рамы; и принимать ТЕА изображения в масштабе 50, 000 X.
  2. СТЕБЕЛЬ изображений и рентгеновского микроанализа для анализа спектральных и композиционные
    1. Вставьте энергии дисперсионных детектор рентгеновского (EDX) в зале сканирования электронной микроскопии (STEM) передачи изображений.
    2. Отрегулируйте резкость изображения в режиме focus.
    3. Возьмите стволовых изображений с увеличением 15, 000 X.
    4. Выберите точку в образце для рентгеновского микроанализа и собирать спектров.
    5. Получение данных путем суммирования всех атомных масс для всех элементов таблицы Менделеева в примере (как 100%) и показывая содержимое отдельных элементов: Ca, F, Cl и P (как атомная %). Затем рассчитайте коэффициенты Ca, F или Cl до P для каждого образца.
  3. Ион сопоставление
    1. Выберите элементы, такие как кальций, фтор, хлор и фосфора Ион сопоставления и выполнить EDX карт выбранных элементов в образцах.
    2. Получение данных, указав локализации анализируемых элементов: Ca, F, Cl и P (как атомная %) и рассчитать Сопредседатель локализации (в %) ЦС, F или Cl с P для каждого образца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ТЕА-EDX позволяет для обработки изображений в vitro Матричные везикулы (МВС) выпущенный минерализация клетки и полезных ископаемых, выпускаемые Мпротив результаты, полученные с помощью этой методики продемонстрировать, что процесс минерализации может проходить по-разному в различных типах клеток. Два клеточных линий получил же osteoblastic transdifferentiation лечения, но стимулировали Saos-2 клетки более эффективно, чем hFOB минерализованных 1.19 остеобластов, что подтверждается AR-S окрашивание (рис. 2). Это может быть более зрелым остеобластов фенотипа Saos-2 клетки19 по сравнению с hFOB 1.19 клетки20. Визуализация образцов с помощью УФ transilluminator сделал ясно, что только fluorapatites можно наблюдать под УФ света (рис. 3). ТЕА изображений указывается, что стимулировало Saos-2 клетки производят больше везикулы, содержащие минералы, по сравнению с стимулировали hFOB клеток или с отдыха клеток Saos-2 (Рисунок 4, левой и средней панели). Синтетических апатитов имеют различные формы минералов (рис. 4, правая панель). ТЕА изображений показал наличие пузырьков в hFOB 1.19 и Saos-2 клетки под отдыхает и стимулировали условий (рис. 5, левая панель). На картах Ион EDX красные точки обозначают кальция, зеленые точки фосфора и голубой точки указывают на фтор дистрибутивов (рис. 5, средняя группа). Стимулируется условиях существует сильный совпадения распределений кальция и фосфора в везикулы, Saos-2 клетками и между фтора и фосфора в везикулы, производимые hFOB 1.19 клеток (рис. 5, правая панель).

Figure 2
Рисунок 2 . AR-S окраски минералов (красный) производится hFOB 1.19 (Верхняя панель) и Saos-2 (Нижняя панель) клетки, либо отдыхает (R) или после 7 дней стимуляции с АА и β-GP (S). Бар: 25 мкм. Типичный результат с n = 3 представлен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Visible (Верхняя панель) и УФ (средняя группа) света визуализации синтетических HA, CA и FA минералов и ископаемых производится hFOB 1.19 (нижней левой панели) и Saos-2 (внизу справа) клетки, либо отдыхает (R) или после стимуляции с АА и β-GP (S) на 7 дней . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 4
Рисунок 4 . Изображения ТЕА везикулы и минералов, производимые hFOB 1.19 (левая панель) и Saos-2 (средняя группа) клетки, либо отдыхает (R) или после 7 дней стимуляции с АА и β-GP (S). Синтетические минералы HA, CA и FA отображаются как элементы управления (правая панель). Бар: белая 500 Нм, черный 250 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 5
Рисунок 5 . Изображения (левая панель) ТЕА hFOB 1.19 и Saos-2 клетки, либо отдыхает (R) или после 7 дней стимуляции с АА и β-GP (S). Ион карты для Ca (красный), Cl (желтый), F (синий) и P (зеленый) от EDX (средняя группа). Совместное локализация элементов (правая панель): кальция и фосфора (Ca), фтор для фосфора (F), или хлора фосфор (Cl) была количественно оценена, основанные на картах EDX. Бар: 500 Нм. Были проведены три независимые эксперименты для обеих линий клетки. Десять фотографий с каждого варианта (отдыхает и стимулировали) были приняты, а затем от 2 до 6 из них были отобраны для дальнейшего вычисления элемента совместно локализации. Представлен один типичный результат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В текущем документе мы описали протоколы для окрашивания, УФ света идентификации fluorapatite AR-S и ТЕА-EDX в vitro изображений МВС, выпущенное минерализация клетки и минералов производимых MVs. Это позволяет решить все методы, упомянутые выше, после некоторых общих неполадок. Чтобы получить оптимальные результаты, некоторые важные шаги должны выполняться тщательно. Во-первых это лучше добавить что AA (которая является кислой) следуют β-GP (который является щелочной) для сохранения рН 7,4 питательной среды. Во-вторых после окрашивания AR-S, окрашенных известковые отложения являются очень хрупкими и клетки должны быть вымыты с большой осторожностью, чтобы предотвратить разрушение кристаллов при добавлении PBS. В-третьих всегда держите уранила ацетат в контейнере свинца и не забрать отложений, потому что только разбавленным фракции должны использоваться для фиксации. В-четвертых Помните, что АА и уранила ацетат светочувствительных и должны быть обработаны в темной комнате. В-пятых смесь белого LR с абсолютного этанола должна быть смешанной хорошо перед добавлением к образцам. В-шестых образцы в желатиновых капсулах должны быть помечены, используя небольшой лист бумаги и карандаш, чтобы смола не уничтожить этикетки. В-седьмых лезвие Алмазный нож следует тщательно очистить от любых воздушных пузырьков. В-восьмых образцы следует осторожно на блестящей стороне сетки где находится фильм Formvar/углерода. В-девятых правильно Расположите точку, на котором рентгеновского микроанализа и Ион сопоставление выполняется на ТЕА изображение, чтобы ограничить возможные проблемы с признанием апатита.

Хотя представленные протокол оказался наиболее выгодные в нашем экспериментальный дизайн, можно изменить его для различных целей. Как и в любой другой технике, это одно также имеет свои ограничения. Дополнительные методы, такие как FTIR, должны применяться для подтверждения или проверки существования полученные соотношения рассмотрены элементы8,12,26. Метод ТЕА-EDX, представленные здесь является существенное улучшение в отношении существующих метод, который представляет собой сочетание методов на основе микро Раман сопоставления и chemometric и похож на изображений распределение наночастиц серебра (AgNPs) в различные поверхности минеральных и механизм их молекулярных взаимодействий21. На основе романа изображений был протестирован на двух полезных моделей (макро - и микро размера). Раман карты из n = 600-900 спектры для каждого образца/управления были проанализированы Vespucci программного обеспечения и результаты были подтверждены посредством других методов, таких как ICP-OES, АСМ и SEM-EDX. Наши ТЕА-EDX карты состоит из n = 30 кадров и n = 6 спектры для каждого образца/управления были также проанализированы микроанализ Suite программного обеспечения, и результаты были подтверждены посредством других методов, таких как FTIR, FM, ТЕА, Взвесей и 3D Топографическая AFM4 , 5. Предлагаемый ТЕА-EDX микроанализ, как на основе Раман изображений, требует только минимальной пробоподготовки, супер чувствительной, неинвазивная и экономически эффективным и может быть распространена на другие системы, имеющих отношение к окружающей человека среды.

Представлена методика может использоваться в широком поле исследований в будущем. Он может быть изменен для расследования различных природных и синтетических апатитов. Он может также быть подогнать протоколы экспериментов с биологической и химической зонды. Кроме того все элементы из периодической таблицы могут быть проанализированы для того, чтобы визуализировать не только морфология минералов, но и изменения в их ионный состав и замен. Ионный обмен в Апатиты является известной процедуры для биомедицинских приложений27. Один из возможных физиологических фактор, который управляет ионы Ca, F и Cl или Sr и Mg, Mn, Zn замены иона металла в HA во время минеральные образования, который является поворотным пунктом между физиологических и патологических минерализации, может быть Pi/PPi Коэффициент7. Если применяется правильно, эта техника позволяет для выполнения сопоставления нескольких элементов того же сотовой, везикулярной или полезных ископаемых региона несколько раз подряд.

В последние годы был достигнут значительный прогресс, касающиеся механизмов кости минерализации28,29,30,,3132,33. Мы поняли, что различные клеточные линии могут иметь различные профили везикулы и минеральные образования. В этой связи мы выбрали две линии клеток человека: osteoblastic hFOB 1.19 и остеосаркома Saos-2, которые проходят полный Остеогенные transdifferentiation от распространения к минерализации и производят MVs, которые вызывают нуклеации апатита в ECM 34 , 35.

AR-S окрашивание отложения кальция показали, что стимулируется клетки Saos-2 по-разному чем hFOB 1.19 остеобластов минерализованные. Это было связано с производства полезных ископаемых на Saos-2 клетки, которые были обнаруживается под УФ света в отличие от тех производятся клетками hFOB 1.19. Наши ТЕА-EDX данные показали, что минералы, производимых в везикулы клеток Saos-2 были похожи на синтетических га из-за дублирования в дистрибутивов кальция и фосфора. В противоположность этому перекрытие дистрибутивов фтора и фосфора в пузырьки из клеток hFOB 1.19 указал формирования других видов полезных ископаемых, помимо Апатиты.

В заключение наши результаты показывают, что везикулы являются ключевыми факторами, определяющими минеральных нуклеации, особенно на клеточном уровне5,25. Кроме того наши данные согласуются с ранее теория, что MVs может рассматриваться как специализированная форма микровезикулы, имеют возможность начать минерализации внутри, так и за пределами ячейки4. Сравнение везикулы, освобождены от Saos-2 клетки, которые минерализации более эффективно, и везикулы, освобождены от hFOB 1.19 клеток с помощью метода microanalytical ТЕА-EDX поддерживает гипотезой, предполагающей, что MVs заполнены минеральной везикулы. Это оставляет открытым вопрос, ли присутствие МВС требуется навести апатита нуклеации, и как это может изменить физиологических патологических минерализации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они имеют никакого конфликта интересов.

Acknowledgments

МК и ASK ручной операции и LB подготовлены чертежи и сделал фильм. ASK написал рукопись, LB написал сценарий и MK подготовил таблицу. SM, RB и SP критически прочитать таблицу, сценарий и рукописи. Авторы хотели бы поблагодарить Hanna Chomontowska за ее превосходную помощь с ultramicrotomy а также Шимон Suski и Henryk Bilski за их прекрасную помощь с ТЕА-EDX анализа. Авторы хотели бы поблагодарить д-р Патрик рощи для коррекции профессионального английского языка и Барбара Sobiak для записи инструкции.

Эта работа была поддержана грант N N401 140639 от польского министерства науки и высшего образования спросить, за счет субсидий из национального научного центра, Польша 2016/23/N/NZ4/03313 фунтов и 2016/23/N/NZ1/02449 в МК, BIOIMAGINE Проект РП7 ЕС : Био-изображений в исследования инноваций и образования, GA № 264173 и уставных фондов из Ненцки Института экспериментальной биологии, польской академии наук.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture PAA E15-813 1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium PAA E82312-0025 for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin) Sigma P0781-100ML 100 U/mL each
G-418 Sigma 68168 0.3 mg/mL
FBS Gibco 10270 10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA Sigma A-5960 50 µg/mL
ß-GP Sigma G9422-100G 7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel Bio-Rad 130-0420 for HA
FA synthesized by us
CA synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture Sigma S7907/S8282 0.1 M, pH 7.2
PBS pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS Sigma A5533-25G 0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA Sigma C2674 500 U/mL
SCL buffer prepared by us
Deionized wather produced by us
Ethanol POCh BA6480111 absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol Polysciences Inc. 21447-25 0.25 g/10 mL
PD medium pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde) Sigma 158127/G-6257 3%:1%
Post-fixation OsO4 Sigma 75633 1%
LR White resin in ethanol Polysciences Inc. 17411-MUNC 500g 1:2, 1:1, 100%
Acetone CHEMPUR 111024800 pure
Tool
Cryogenic vials Corning Inc. 430487 1.2 mL
Plastic Petri culture dishes Falcon 353003 100 mm
Plastic tubes Falcon 352096 and 352070 15 and 50 mL
Serological pipettes Falcon and VWR 357521 and 612-3700 1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes Sigma Z688312 and Z628034 1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips VWR 613-0364, 613-0239 and 613-1050 0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks Light Labs A-7055-Z, A-7053-C green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save Thermo Scientific Co. KS12 HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell Thermo Scientific Co. 150 34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood POLON WCS-2 for TEM stainings
Glass bottles SIMAX 1632414501050 and 1632414501100 50 and 100 mL
Quartz glass tubes SIMAX 638422010100 Ø 10 mm, L 100 mm
Pump IBS Integra Biosciences VACUSAFE comfort for vacuum
Oven Memmert UNE 400 56°C
Porcelain multi-well plate Rosenthal technik 229/12 12 wells
Glass beakers SIMAX 632417010025 25 mL
Glass bottles Pocord DIN22 10 mL
Plastic box Agar Scientific Ltd. for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules Agar Scientific Ltd. G3741 size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box Agar Scientific Ltd. S162N3 film on the shiny side
Silicon cell scraper Sigma SIAL0010-100EA size 1.8/25 cm
Syringe with needle BogMark 007 syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe Chirana CH005L 5 mL
Centrifuge MPW Medical Instruments MPW-350R 130 x g and 500 x g
UV transluminator UVP M-20 for visible and UV light
Ultramicrotome LKB NOVA 700Å sections
Block holder LKB E6711 round shape
Diamond knife DiATOME Ultra 45° size 3
Eyelash holder bovine, prepared by us
Forceps ROTH 2855.1 antistatic for grids
Spatulas set ROTH E286.1 antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope Zeiss with Canon AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9 Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses Nikon Nikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D
for movie recordings
Microphone MXL Mics Tempo for voice recordings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
  2. Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
  3. Anderson, H. C. Matrix vesicles and calcification. Curr Rheumatol. 5, (3), 222-226 (2003).
  4. Bolean, M., Simão, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Millán, J. L., Ciancaglini, P. Biophysical aspects of biomineralization. Biophys Rev. 9, (5), 747-760 (2017).
  5. Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Simão, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Millán, J. L., Buchet, R. Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models. Biochim Biophys Acta. 1862, (3), 532-546 (2018).
  6. Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, (14), 9445-9449 (2002).
  7. Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study. Bone. 38, (6), 811-817 (2006).
  8. Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles. Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).
  9. Terkeltaub, R. A. Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology. Am. J. Phys. 281, (1), 1-11 (2001).
  10. Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification. Bone. 27, (1), 69-74 (2000).
  11. Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Millán, J. L. Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice. J. Bone Miner. Res. 31, (6), 1275-1286 (2016).
  12. Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells. J. Proteome. 74, (7), 1123-1134 (2011).
  13. Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis. J. Biol. Chem. 278, (6), 3762-3769 (2003).
  14. Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis. Autophagy. 10, (11), 1965-1977 (2014).
  15. Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (35), 14170-14175 (2012).
  16. Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine. J. Biol. Chem. 282, (36), 26035-26045 (2007).
  17. Jahnen-Dechent, W., Schäfer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification. J. Mol. Med. (Berl). 86, (4), 379-389 (2008).
  18. Suchanek, W., Yoshimura, M. Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants. J. Miner. Res. 13, (1), 94-117 (1998).
  19. Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts. Anticancer Res. 24, (6), 3743-3748 (2004).
  20. Yen, M. -L., Chien, C. -C., Chiu, I. -M., Huang, H. -I., Chen, Y. -C., Hu, H. -I., Yen, B. L. Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors. Stem Cells. 25, (1), 125-131 (2007).
  21. Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces. Environ Sci Technol. (2018).
  22. Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO. Chemosphere. 196, 566-574 (2018).
  23. Tasbihi, M., Kočì, K., Troppová, I., Edelmannová, M., Reli, M., Čapek, L., Schomäcker, R. Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts. Environ Sci Pollut Res Int. (2017).
  24. Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells. J. Bone Miner. Res. 23, (11), 1798-1805 (2008).
  25. Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization. J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).
  26. Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. Matrix vesicles originate from apical membranę microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells. J. Cell. Biochem. 106, (1), 127-138 (2009).
  27. Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. Ion exchanges in apatites for biomedical application. J. Mater. Sci. Mater. Med. 16, (5), 405-409 (2005).
  28. Kraus, D. Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel® spreadsheet software. Med. Writ. 23, (1), 25-28 (2014).
  29. Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).
  30. Bonucci, E. Bone mineralization. Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).
  31. Veis, A., Dorvee, J. R. Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices. Calcif. Tissue Int. 93, (4), 307-315 (2013).
  32. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. J. Struct. Biol. 183, (2), 258-269 (2013).
  33. Alliston, T. Biological regulation of bone quality. Curr. Osteoporos. Rep. 12, (3), 366-375 (2014).
  34. Wang, W., Kirsch, T. Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization. J. Cell Biol. 157, (6), 1061-1069 (2002).
  35. Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes. Exp. Cell Res. 305, (1), 156-165 (2005).
Анализ минералов, производимые hFOB 1.19 и Saos-2 клетки с помощью просвечивающей электронной микроскопии с энергии энергодисперсионный рентгеновский микроанализ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).More

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter