Summary
선물이 두 인간의 뼈 세포 선으로 발표 하는 소포에 미네랄의 상태를 비교 하는 프로토콜: hFOB 1.19와 Saos-2. 그들의 강화 프로 파일에 의해 알리자린 레드-S (아칸소-S) 얼룩, 자외선 (UV) 빛 시각화, 전송 전자 현미경 (TEM) 이미징 및 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis (EDX)을 분석 했다.
Abstract
이 비디오 전송 전자 현미경 검사 법의 사용 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis을 소포 두 인간의 뼈 세포 라인에 의해 발표에서 미네랄의 상태를 비교할 (가장 EDX) 선물: hFOB 1.19와 Saos-2. Ascorbic 산 (AA)와 β-glycerophosphate (β-GP), 치료 후 이러한 셀 라인 강화를 확산에서 완전 한 osteogenic transdifferentiation를 받아야 매트릭스 소포 (MVs)에서 인회석 nucleation 트리거하는 생산 하 고는 세포 외 매트릭스 (ECM)입니다.
알리자린 레드-S (아칸소-S) 얼룩 및 미네랄 자외선 (UV)를 사용 하 여 세포 lysates 또는 소포 편 이미징 EDX 정량 및 이온 매핑을 사용 하 여 구성의 분석을 바탕으로, 우리가 그 다리를 유추할 수 Saos-2 그리고 osteoblastic hFOB 1.19 셀 별개 강화 프로필 공개. Saos-2 셀 hFOB 1.19 셀 보다 더 효율적으로 형성할 고 생산 자외선 아래 표시 되지 않습니다 하지만 비슷합니다 hydroxyapatite (HA) 들은 더 많은 Ca와 F 대체에 큰 무기물 예금.
이러한 기술을 사용 하 여 얻은 결과 수 결론 강화 작용 과정 세포 유형에 따라 다릅니다. 우리는, 세포 수준에서 기원과 vesicles의 속성 미리 미네랄의 종류를 제안 합니다.
Introduction
뼈는 두 부분으로 구성 된 결합 조직: 유기 (세포와 콜라겐 섬유)과 미네랄 (칼슘, 인산 화합물). 뼈에 주요 미네랄 구성 요소는 apatites1. 다른 종류의 강화 유능한 세포 뼈 (osteoblasts), 치아 (odontoblasts)와 연골 (chondrocytes) 규제 강화의 초기 단계는 세포 외 기질 (ECM)의 단백질을 생산 하 고 매트릭스를 발표 하 여 소포 (MVs) (그림 1). MVs는 100-300 nm 직경 소포 칼슘과 인회석 nucleation 촉진 인산 축적 하 고 그 후 콜라겐2,3를 바인딩할. 다음, MVs extracellular 매체에 apatites를 풀어 분해. apatites 계속 콜라겐 섬유 접촉 성장과 뼈 매트릭스를 형성 합니다. 강화 작용은 P나 및 캘리포니아2 + 세포 외 매체에서의 일정 한 공급에 의해 지속 됩니다. 최근 게시 된 데이터 지원 우리의 모델4,5. 부드러운 조직 생리 적인 조건 하에서 형성할 하지 않습니다. 그러나, 소성 석 회화는 혈관 석 회화3같은 병 적인 조건 하에서 발생할 수 있습니다. 혈관 세포 osteoblast 형 취득 apatites의 nucleation 유발 하 고 혈관 벽의 중간과 내 층에서 강화 작용을 시작 하는 MVs를 생성할 수 있습니다. 소성 석 회화부터 정상적인 endochondral 강화3, 뼈가 있는 세포의 강화 작용의 분자 메커니즘을 이해와 chondrocytes는 부드러운 조직의 소성 석 회화에 몇 가지 단서를 제공 한다 형성.
골격 조직 개발은 다양 한 효소, 성장 요인, 발기인 또는 강화 작용의 억제제에 의해 통제 된다. 반목 행동 조직-특이 현상 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (TNAP) (그림 1)와 ectonucleotide pyrophosphatase/포스의 난 (NPP1), 함께 ankyrin (ANK), 제어 (PPi) 무기 파이 인산 농도 6. PP나, 하 대형의 강력한 억제제 TNAP;에 의해 분해 되 NPP1 hydrolyzes 뉴클레오티드 PP나 ANK ECM에 PP나 를 셀에서 수출 하는 동안 형성 된. Pi/PPi 비율 인회석 형성7,8 병 적인 결과9를 조절할 수 있습니다.
MV 막 nucleation 프로세스 (그림 1) 중 칼슘과 인산 염 MVs 안쪽의 초기 강수량을 용이 하 게 이온 수송 단백질 농축입니다. 인산 염 운송업 자 1 (구 덩이) P나 MVs10,11perivesicular 공간에 생성을 통합 하는 데 도움이 됩니다. Annexins는 MV 루멘12,13강화 작용을 시작 하는 생물 과정에서 바인딩 및 캘리포니아2 + 의 전송에 관련 될 수 있습니다. 우리는 가설, 이전, ECM14,15에서 전파 하기 전에 뮤직 비디오 안에 인회석의 내부 nucleation의 intracytoplasmic 소포 내에서 강화에 대 한 제안 부탁. 생체 외에서 모델링 캘리포니아2 +/P나 단지 형성 PS 및 AnxA516에서 만든 proteoliposomes에서의 유도를 확인 했다. 이 그 축적을 나타낼 수 있습니다의 캘리포니아2 +, P나, microvilli 같은 membranesrepresent M대 Annexins와 TNAP는 인회석의 nucleation 코어 (NC)의 지질 뗏목에서 AnxA5 및 PS 단지 또한 콜라겐 바인딩 보유 강화는 ECM에서의 전파를 자극, 그리고 콜라겐 섬유를 따라 MVs에 도움이 될 수 있는 용량 Fetuin A와 osteopontin (OPN)17, collagenous 비 계에 강화 작용의 전파를 저하 시킬 수 있습니다 인회석 형성 억제제로 알려져 있습니다. Nucleation 및 전파는 고유한 이벤트, 후자, 앞 전 고 모두 병 적인 강화 작용의 과정에 대 한 관련성이 있을 수 있습니다.
어떻게 칼슘 인산 염 복합물의 화학 생리 강화 및 소성 석 회화 변경 될 수 있습니다 발견, 그것은 세포에 의해 생산 하는 광물을 식별 하는 데 필요한. Apatites 칼슘 및 인산 염 무기물 일반 크리스탈 단위 셀 수식 Ca10(PO4)6X2를 포함 하는 그룹, 어디 X = Cl, F, 오하이오. 그들은18를 다음과 같이 분류 된다: fluorapatite (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 , hydroxyapatite (HA) Ca10(포4 )6(OH)2.
광물의 형성을 유발 하 osteoblast 셀 라인의 선택은 각 셀 라인 강화 작용의 독특한 프로필을 전시 하기 때문에 중요 한. 이 보고서에서 우리는 강화 작용의 두 가지 선택 된 인간 세포 모델에 의해 미네랄의 nucleation 비교: osteoblastic hFOB 1.19 셀과 다리 Saos-2 셀. Osteosarcoma 파생 셀 osteoblastic 모형으로 상용 되 고 Saos-2 셀 가장 성숙한 osteoblastic 문자19 보존 undifferentiated 인간의 태아 hFOB 세포는 정상 osteoblastic 모델로 널리 사용 감 별 법20. 다른 방법으로 그들의 강화 프로 파일 분석 했다: 알리자린 레드-S (아칸소-S) 얼룩, 자외선 (UV) 빛 시각화, 전송 전자 현미경 (TEM) 이미징, 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis (EDX) 정량, 및 이온 매핑. 이전 연구에서 사용 되는 대체 기술 가장 EDX의 이점을 준다는 것 이온 교체의 양적 및 질적 결과 인회석 결정4,,521입니다. 가장 EDX를 사용 하 여 전반적인 목표 이미징 및 강화 프로세스의 고유 단계 동안 다른 종류의 세포에서 다양 한 미네랄에서 Ca, F 및 Cl 이온의 분포의 정량화에 대 한 간단한 방법을 찾으려고 했다. 이 메서드는 성공적으로 사용 되었습니다, 예를 들어 공존 화학 물질과 아연 나노 입자 및 수생 생물22에 그들의 결합된 효과의 상호 작용을 모니터링. 또 다른 연구에서는 구리 촉매 용액에서 티타늄 소재에 광범위 하 게 유도 결합된 플라즈마 광 방출 분 광 분석 (ICP OES), N2 physisorption (내기)에 의해 특징 이었다 XRD, UV에 대 한 DRS FT-적외선, 라만 분광학, 편-EDX, 및 화학적 측정23. 우리의 목표는 근원 및 소포 및 미네랄 뼈가 있는 차별화 동안 강화 작용을 제어 하는 메커니즘을 이해 하 두 셀 라인의 속성을 비교 했다.
그림 1 . 뼈가 있는 세포 외 기질 (ECM) 단백질의 종합 및 막에서 매트릭스 소포 (MVs)의 출시에에서 강화의 초기 단계의 계획. MVs 칼슘 묶는 단백질, annexins 및 인산, 무기 인산 염 운송업 자 (구 덩이)의 행동을 통해 조직의 일반적인 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (TNAP), dephosphorylates는의 활동에 의해 다음의 행동을 통해 칼슘 축적 PP나 를 P나, 따라서 인회석 nucleation 촉진. 그런 다음, MVs 분해 하 고 extracellular 매체에 apatites를 출시. 강화 작용은 P나 및 캘리포니아2 + extracellular 매체4,5에서 일정 한 공급에 의해 지속 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Protocol
1. 세포 배양 및 치료
- 층 류 두건 아래 모든 필요한 자료를 넣고 아래 자외선 소독. 문화 미디어는: 1:1 혼합물 햄의 F12 및 DMEM 미디어 2.5 m L-글루타민 보충 100 U/mL 페니실린와 100 U/mL 스, 0.3 mg/mL G418 10% 소 태아 혈 청 (FBS) (v/v) 인간 태아 hFOB 1.19 SV40 큰 T 항 원 페에 대 한 osteoblasts, 그리고 맥 코이 5A 매체 1.5 m L-글루타민 보충과 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스 15 %FBS (v/v) 인간의 다리 Saos-2 셀.
- 5% CO2 의 분위기에서 34 ° C에서 hFOB 1.19 셀과 5%의 분위기 속에서 37 ° C에서 Saos-2 셀 문화 공동2. 층 류 두건에 인큐베이터에서 세포 배양, 어느 hFOB 1.19 또는 Saos-2 셀을 전송 하 고 매체 FBS와 신선한 문화 매체의 10 mL에 변경 합니다.
- 자극 (휴식 셀) 없이 셀을 품 어 또는 50 µ g/mL Ascorbic 산 (AA) 7.5 m m β-Glycerophosphate (β-GP), 초순 앞부분에서 준비와 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 필터링 된 다음 그들을 자극 합니다. 문화 매체의 표면에 플라스틱 microcentrifuge 관에서는 자극 제를 추가 합니다. 부드럽게 문화 요리를 저 어 하 고 7 일 동안 품 어.
2입니다. 칼슘 미네랄의 탐지
- 인산 염 버퍼 식 염 수와 세포 배양을 세척 (PBS: 125 mM NaCl, 5mm KCl, 10mm 나2HPO4, 1mm KH2포4, pH 7.0).
- 추가 2% (g:100 mL)의 5 mL PBS, pH 5.0에에서 아칸소-S 및 미네랄 얼룩을 30 분 동안 접시를 품 어.
- PBS로 3 회 세척. 신중 하 게, 접시 벽에 PBS를 추가 미네랄을 파괴 하지 않으려고.
- 칼슘 미네랄 거꾸로 가벼운 현미경을 관찰 하 고 이미지.
3입니다. UV 빛에서 프로브의 시각화
- 세포 lysates 콜라 소화 프로토콜24에 따르면 셀 문화, 휴식 또는 7 일에 대 한 자극을 처리 합니다.
- 세포 배양에서 매체를 수집 하 고 PBS로 세포 세척.
- 0.25 M 자당, 0.12 M NaCl, 0.01 M KCl, 그리고 0.02 M Tris HCl 버퍼, pH 7.45, 3 h 37 ° C에서의 솔루션에 500 U/mL 콜라의 3 mL로 세포를 소화.
- 기계적으로 긁어 셀, 플라스틱 microcentrifuge 튜브에 그들을 전송 고 통과 그들 10 번 1 mL 40 U 주사기 0.5 × 16 바늘.
- 5 분 동안 500 × g에서 샘플 원심
- 삭제는 상쾌한 고 합성 연골 림프 (SCL, 100 m m NaCl, 12.7 m m KCl, 0.57 m m MgCl2, 1.83 m m NaHCO3, 0.57 m m NaH2포4, 5.5 m m D-포도 당, 자당 63mm, 16.5 mM Hepes, pH 7.4)의 500 µ L에 셀 펠 릿을 중단.
- 주걱으로 UV transilluminator에 병에서 hydroxyapatite (HA), fluorapatite (FA) 및 chlorapatite (CA) 분말을 전송 및 컨트롤 사용.
- 플라스틱 팁 플라스틱 튜브에서 세포 lysates 전송 하 고 신중 하 게 UV transilluminator에 놓습니다.
- 받아 아래 보이는 이미지 자외선 빛.
4. 가장 EDX에 대 한 조사 준비
- 미네랄의 부정적인 얼룩이 지기에 대 한 준비
- 이온된 수의 500 µ L에서 합성으로 생성된 하, CA 및 FA 미네랄25 의 2.5 mg을 일시 중단 하 고 1 시간에 5% CO2 의 분위기 속에서 37 ° C에서 품 어.
- 가지고 Formvar/탄소 300 그물눈 니켈 격자 상자에서 정전기 방지 겸 도자기 다 잘 접시에 놓고 10 µ L HA, CA 및 FA 정지의 격자에 드롭.
- 건조 실 온에서 30 분에 대 한 샘플.
- 휴식의 준비 26 포함을 위한 세포를 자극 하 고
- 세포 배양에서 매체를 수집 하 고 생리 둔감 (PD) 매체 (125 m m NaCl, KCL, 10mm NaHCO35mm, 1mm KH2포4, 10 m m 포도 당, 20 mM HEPES, pH 7.4)와 셀을 세척.
- 3% (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL)도 100 m m 나트륨 인산 염 버퍼, pH 7.2, 연기 후드 실 온에서 1 h의 혼합물의 5 mL와 함께 셀을 수정 합니다.
- 100mm 나트륨 인산 염 버퍼의 5 mL로 세포 세척 하 고 부드럽게 세척 후 버퍼를 제거.
- 어두운 방에서 100 m m 나트륨 인산 염 버퍼, pH 7.2, 연기 후드 실 온에서 20 분에에서 1% (g:100 mL) 오스뮴 tetroxide의 2 mL과 샘플을 후 위.
- 오스뮴 tetroxide를 제거 하 고 그것을 활용.
- 100mm 나트륨 인산 염 버퍼의 5 mL로 세포 세척.
- 그런 다음 실 온에서 등급된 에탄올 솔루션 시리즈의 5 mL aliquots에서 샘플을 탈수: 90% (vol.) 20 분, 75% (vol.) 15 분, 50% (vol.) 10 분, 25% (vol.) 5 분. 마지막으로 두 번 절대 에탄올을 사용 하 고 30 분 및 12 h 품 어.
- 기계적으로 플라스틱 문화 접시에서 세포를 긁어, 플라스틱 microcentrifuge 튜브에 수집 하 고 1 분 130 x g에서 샘플 원심.
- supernatants 제거 하 고 셀 LR 화이트 수 지와 볼륨 비율 1: 2의 절대 에탄올의 혼합물의 1 mL에 중단.
- 사용 하기 전에 유리 튜브의 내용을 잘 혼합 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.
- 샘플 1 분 130 x g에서 원심
- supernatants를 제거 하 고 LR 화이트 수 지와 절대 에탄올의 1:1 혼합물의 1 mL를 사용 하 여 이전 단계를 반복 합니다.
- 잘 혼합 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.
- 샘플 1 분 130 x g에서 원심
- supernatants 제거 합니다.
- 마지막으로, 샘플에 순수한 LR 화이트 수 지의 1 mL를 두 번 추가 하 고 플라스틱 튜브에 실 온에서 1 h에 품 어.
- 500 µ L 각 샘플의 젤라틴 캡슐에 넣으십시오.
참고: 샘플 수 지 라벨을 파괴 하지 않는다 그래야 종이 연필의 작은 시트를 사용 하 여 레이블이 지정 됩니다. - 젤라틴 캡슐, microcentrifuge 플라스틱 튜브에 넣어 닫고 스윙 아웃으로 터에서 1 분 130 x g에서 원심.
- 진공 펌프를 사용 하 여 플라스틱 튜브에서 캡슐을 제거 합니다.
- 오븐에 샘플을 이동 하 고 48 h 56 ° C에서 유해.
- 홀더에 장착 하 고 피라미드를 트리밍 하 여 블록을 준비 합니다.
- 소유자는 ultramicrotome, 다이아몬드 울트라 45 ° 칼 첨부 고 이온된 수; 그것을 채울합니다 부수적 기포에서 잎을 청소 하는 기억.
- 다음 섹션 (700 Å) 이온된 물 목욕에 다이아몬드 칼을 사용 하 여 잘라.
- Ni 그리드 소 속눈썹 및 장소 Formvar/탄소 300의 반짝이 면에 메쉬를 사용 하 여 스크랩을 설정 하 고 그들을 건조.
- 증기 두건 아래 어둠 속에서 절대 에탄올에 2.5% (vol.) 의해 uranyl 아세테이트를 준비 합니다. Uranyl 아세테이트 리드 컨테이너에 유지 하 고는 토사를 데리 러 하지 않는 것을 기억.
- 어두운 방에서 합성 apatites 및 에탄올 증기 두건에서 실 온에서 20 분에 2.5% (vol.) 의해 uranyl 아세테이트와 셀 샘플 격자를 counterstain.
- 다음 이온된 수에서 50% 에탄올에 격자 (vol.)에 의해 세척 하 고 24 시간 실 온에서 건조. 마지막으로, 상자에 격자를 넣어.
5. 가장 EDX 분석
- 전송 전자 현미경 (TEM)에 의해 가장 이미징 갖춘 전체 범위 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis (EDX) 시스템 11 메가 픽셀 카메라
- 미네랄과 세포의 관찰에 대 한 베릴륨 홀더를 준비 합니다. 정전기 방지 도구를 사용 합니다.
- 나사의 쌍을 제거 하 고 베릴륨 플레이트 들어올린 보유자의 나머지에서 베릴륨 세탁기.
- 그리드, 반짝이 면을, 소유자에 탑재 합니다.
- 조심 스럽게 베릴륨 세탁기와 베릴륨 접시 놓고 단단히 죔 나사를 나사.
- 진공 챔버에 홀더를 넣고 진공 펌프를 켭니다.
- 진공 달성 되 면 부드럽게 이미징 챔버에 홀더를 삽입 하 고 광선을 켭니다.
- 형광 모니터에는 현미경의 조리개 매개 변수를 설정 합니다. 이미지 난시 교정; 설정 확대/축소, 초점, 및 프레임; 50, 배율 TEM 이미지를 하는 고 000 X.
- 이미징 및 x 선 스펙트럼 및 구성 분석을 위한 microanalysis 줄기
- 스캐닝 전송 전자 현미경 (줄기) 이미징 챔버에 에너지 흩어진 엑스레이 (EDX) 검출기를 삽입 합니다.
- 초점 모드에서 이미지의 선명도 조정 합니다.
- 15, 확대 줄기 이미지를 000 X.
- X 선 microanalysis에 대 한 샘플에서 점을 선택 하 고 스펙트럼을 수집 합니다.
- 모든 원자 량 (100%)로 샘플에서 주기율표의 모든 요소에 대 한 요약 및 선택 된 요소의 콘텐츠를 나타내는 데이터를 가져옵니다: Ca, F, Cl, 및 (원자 %)으로 P. 그런 다음, 각 샘플에 대 한 Ca, F 또는 Cl p의 비율을 계산 합니다.
- 이온 매핑
- 칼슘, 불 소, 염소, 이온 매핑을 만들고 샘플에서 선택 된 요소의 EDX 지도 수행 인 등의 요소를 선택 합니다.
- 분석 된 요소의 지역화를 지정 하 여 데이터를 가져올: Ca, F, Cl, 및 P (원자 %)로 계산 하는 각 샘플에 대 한 Ca, F 또는 P와 Cl의 (%)에서 공동 지역화 하 고.
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Representative Results
가장 EDX 체 외에 이미징 매트릭스 소포 (MVs) 셀 mineralizing 발표와 M대 강화 작용의 과정을 다르게 진행할 수 있습니다이 기술을 사용 하 여 얻은 결과 입증 하 여 생산 하는 미네랄의 수 에 셀의 다양 한 종류. 두 셀 라인 같은 osteoblastic transdifferentiation 치료를 받은 아직 자극된 Saos-2 셀 mineralized hFOB 보다 더 효율적으로 1.19 osteoblasts 아칸소-S에 의해 입증으로 얼룩 (그림 2). 이 hFOB 1.19 셀20에 비해 Saos-2 셀19 의 더 성숙한 osteoblast 형 때문일 수도 있습니다. 만든 UV transilluminator를 사용 하 여 샘플의 시각화 그것 취소만 fluorapatites UV 빛 (그림 3)에서 관찰 될 수 있다. 가장 이미지 표시 자극된 Saos-2 셀 Saos-2 셀 (그림 4, 왼쪽과 가운데 패널) 휴식 또는 자극된 hFOB 셀에 비해 미네랄을 포함 하는 더 많은 소포를 생산. 합성 apatites 있다 (그림 4, 오른쪽 패널)의 다른 형태. 가장 이미지 보였다 vesicles의 존재 hFOB 휴식 아래 1.19 Saos-2 세포 자극 조건 (그림 5, 왼쪽 패널). EDX 이온 지도에 빨간색 포인트 칼슘, 녹색 포인트 표시 인, 블루 포인트 불 소 분포 (그림 5, 중간 패널)을 가리킵니다. 조건 하에서 자극, 소포 Saos-2 셀에 의해 생산과 불 인 소포 hFOB 1.19 셀 (그림 5, 오른쪽 패널)에 의해 제작 사이에서 칼슘과 인 배포판 간의 강한 중복이입니다.
그림 2 . HFOB 1.19 (위 패널)를 제작한 아칸소-S (레드)의 얼룩 및 Saos-2 (하단 패널) 셀 (R)를 휴식 또는 AA와 β-GP (S)의 7 일 후. 바: 25 µ m입니다. 전형적인 결과 n = 3이 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 표시 (위 패널) UV (중간 패널) 빛 시각화 합성 HA, CA 및 FA 미네랄 및 미네랄의 hFOB 1.19 (하단 왼쪽된 패널)에 의해 생산 및 Saos-2 (하단 오른쪽 패널) 세포 (R)를 휴식 또는 AA와 β-GP (S)의 7 일 후 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 소포 및 무기물의 가장 이미지 hFOB 1.19 (왼쪽된 패널)에 의해 생산 및 Saos-2 (중간 패널) 셀 (R)를 휴식 또는 AA와 β-GP (S)의 7 일 후. 합성 HA, CA, FA 미네랄 컨트롤 (오른쪽 패널)로 표시 됩니다. 바: 화이트 500 nm 블랙 250 nm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 가장 이미지 (왼쪽된 패널) hFOB 1.19 Saos-2의 세포 (R)를 휴식 또는 AA와 β-GP (S)의 7 일 후. Cl (노란색), F (파란색)와 EDX (중간 패널)에서 P (녹색) 이온 Ca (빨간색)에 대 한 지도. 요소 (오른쪽 패널)의 공동 지역화: 칼슘 (Ca), 인 (F)에 불 소 또는 염소 (Cl) 인 하 인을 EDX 지도에 따라 계량 했다. 바: 500 nm. 두 셀 라인에 대 한 3 개의 독립적인 실험을 수행 했다. 각 variant (휴식과 자극)에서 10 사진을 찍은 다음 그들의 6에 2에서 추가 요소 공동 지역화의 계산에 대 한 선정 됐다. 한 전형적인 결과 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
현재 신문에서 우리에 대 한 아칸소-얼룩, fluorapatite의 UV 빛 식별 프로토콜을 설명 하 고 가장 EDX 체 외에 이미징 MVs 셀 mineralizing 발표와 미네랄의 MVs. 에 의해 생산 그것은 몇 가지 일반적인 문제 해결 단계에 따라 위에서 언급 한 모든 메서드를 해결 수 있습니다. 최적의 결과 얻으려면 몇 가지 중요 한 단계는 신중 하 게 수행 되어야 한다. 첫째, 그것은 AA (산 성) 인 β-GP (알칼리 성) 인 문화 매체의 pH 7.4를 유지 하기 위해 다음 추가 좋습니다. 둘째, 아칸소-S 얼룩, 후 얼룩진된 칼슘 예금은 매우 깨지기 쉬운 고 셀 PBS 추가 시 결정의 파괴를 방지 하기 위해 매우 세 심하게 세척 되어야 한다. 셋째, 항상 리드 컨테이너에서 uranyl 아세테이트를 유지 하 고 희석된 일부만 고정 사용 해야 하기 때문에 앙금을 선택 하지 마십시오. 넷째, AA와 uranyl 아세테이트는 빛에 민감한 및 어두운 방에 처리 한다 기억 하십시오. 다섯째, LR 화이트 절대 에탄올 혼합 샘플에 추가 되기 전에 잘 혼합 한다. 여섯째, 젤라틴 캡슐에 샘플 수 지 라벨을 파괴 하지 않는다 그래야 종이 연필의 작은 시트를 사용 하 여 표시 해야 지. 일곱 번째, 다이아몬드 나이프의 블레이드는 어떤 공기 방울에서 신중 하 게 청소 되어야 한다. 8, 샘플 배치 되어야 합니다 신중 하 게 격자의 반짝이 면에 Formvar/탄소 필름 위치. 9, 올바르게는 x 선 microanalysis와 이온에 매핑 인회석 인식 가능한 문제를 제한 하려면 가장 이미지에서 수행 하는 지점 위치.
제시 프로토콜 우리의 실험 설계에 가장 유리한 입증, 비록 그것이 다른 목표에 맞게 수정 가능 합니다. 다른 기술에서와 마찬가지로 또한 한계가 있다. FTIR, 같은 추가 기술은 확인 하거나 검사 요소8,,1226의 취득된 비율의 존재 확인에 적용 되어야 한다. 여기에 제시 된 가장 EDX 메서드는 마이크로 라만-기반 매핑 및 chemometric 방법의 조합은 다양 한 실버 나노 (AgNPs) 배포의 이미징 비슷합니다 기존 방법에 관하여 상당한 개선 미네랄과21그들의 분자 상호 작용 메커니즘의 표면. 라만 기반 이미징 (매크로 및 마이크로 규모) 두 가지 미네랄 모델에 테스트 되었습니다. 라 지도 n 의 600-900 스펙트럼 = 각 샘플/제어 Vespucci 소프트웨어에 의해 분석 되었다 및 ICP OES, AFM, SEM EDX 등 다른 방법을 통해 결과 확인 되었다. 우리의 가장 EDX 지도 구성 n = 30 프레임 및 n = 6 스펙트럼 각 샘플/제어 했다 또한 Microanalysis 스위트 소프트웨어에 의해 분석 하 고 결과 FTIR, FM, TEM, SPM 및 3D 지형 AFM4 등 다른 방법을 통해 확인 되었다 , 5. 라 기반 영상 처럼 제안 된 가장 EDX microanalysis만 최소 샘플 준비 필요, 슈퍼 민감한, 비-침략 적, 고 비용, 그리고 인간의 환경에 관련 된 다른 시스템을 확장할 수 있습니다.
제시 기법 연구의 넓은 분야에서 미래에 사용할 수 있습니다. 그것은 서로 다른 자연 및 합성 apatites의 조사에 대 한 수정할 수 있습니다. 그것은 또한 생물 실험의 프로토콜에 맞게 조정 될 수 있습니다 그리고 화학 조사. 또한, 미네랄 뿐만 아니라 그들의 이온 조성 및 대체에 변화 뿐만 아니라 형태를 시각화 하기 위해 주기율표에서 모든 요소를 분석할 수 있습니다. Apatites에서 이온 교환27생물 의학 응용 프로그램 대 한 알려진된 절차입니다. Ca, F 및 Cl 이온 또는 생리 적 및 병 적인 강화 사이 터 닝 포인트, Pi/PPi 수 있습니다 광물 형성 동안는 HA에 Zn, Mn, Mg, Sr 금속 이온 대체를 제어 하는 한 가능한 생리 적 요인 비율7. 제대로 적용 경우이 기술은 연속에서 동일한 세포, 나노미터 또는 무기물의 여러 요소의 매핑을 여러 번 수행 하면.
최근 몇 년 동안, 많은 진행 뼈 강화 작용28,29,30,31,,3233의 메커니즘에 관한 되었다. 우리는 다른 셀 라인 소포 및 광물 형성의 고유 단면도 있을 수 있습니다 깨달았다. 이와 관련, 우리는 두 개의 인간 세포 라인을 선택: 받아야 osteoblastic hFOB 1.19와 다리 Saos-2, 강화 작용을 확산에서 osteogenic transdifferentiation를 완료 하 고 ECM 34 에서 인회석 nucleation 트리거하는 MVs를 생산 , 35.
아칸소-S 칼슘 예금의 얼룩 자극된 Saos-2 셀 hFOB 1.19 osteoblasts 다르게 mineralized 밝혔다. 이 hFOB 1.19 세포에 의해 생성 한 그들을 달리 UV 빛에서 감지 되지 않은 Saos-2 셀에 의해 무기물의 생산와 상관 했다. 우리의 가장 EDX 데이터 Saos-2 세포의 소포에서 생산 하는 미네랄 칼슘과 인 배포판에 겹치기 때문에 합성 하 게 유사 했다 밝혔다. 대조적으로, hFOB 1.19 셀에서 소포에 불 소 및 인 배포판에 중복 표시 apatites 뿐만 아니라 무기물의 다른 종류의 형성.
결론적으로, 우리의 연구 결과 소포 세포 레벨5,25에서 특히 미네랄 nucleation의 주요 결정 하는 나타냅니다. 또한 우리의 데이터는 MVs 셀4외부 뿐만 아니라 내부 강화를 시작할 수 있습니다 microvesicles의 특수 한 형식으로 간주 될 수 있는 이전 이론와 일치 하 여. 보다 효율적으로 형성할 Saos-2 셀에서 발표 하는 소포와 소포 편 EDX microanalytical 메서드를 사용 하 여 hFOB 1.19 셀에서 발표의 비교 가설 MVs 미네랄 가득 vesicles 지원 합니다. 이것은 오픈 질문 여부 MVs의 존재 인회석 nucleation, 그리고 어떻게이 생리 병 적인 강화 작용을 변경할 수 있습니다 유도 하는 데 필요한.
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Disclosures
저자 들은 전혀 상충 선언 합니다.
Acknowledgments
MK 및 요청 수동 작업을 수행 하는 파운드 그림을 준비 하 고 만든 영화. ASK 쓴 원고, 파운드 쓴 스크립트와 MK 준비 테이블. SM, RB 및 SP는 비판적으로 테이블, 스크립트 및 원고 읽기. 저자 ultramicrotomy와 그녀의 훌륭한 지원에 대 한 한 나 Chomontowska로 Szymon Suski와 헨리크 Bilski 가장 EDX 분석 그들의 훌륭한 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 저자는 전문 영어 교정 패트릭 나무와 지시를 기록 하기 위한 바바라 Sobiak 박사 감사 하 고 싶습니다.
이 일 파운드 및 2016/23/N/NZ1/02449 MK, EU FP7 프로젝트 BIOIMAGINE에 국립 과학 센터, 폴란드 2016/23/N/NZ4/03313에서 교부 금에 의해 물어, 과학 및 고 등 교육의 폴란드어 사역에서 N N401 140639 그랜트에 의해 지원 되었다 : 바이오 이미징 연구 혁신 및 교육, 조지아 No. 264173, 그리고 법정 자금의 Nencki 연구소의 실험 생물학, 아카데미 과학의 폴란드어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Ham’s DMEM/F12 media mixture | PAA | E15-813 | 1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372) |
| McCoy’s 5A medium | PAA | E82312-0025 | for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85) |
| Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin) | Sigma | P0781-100ML | 100 U/mL each |
| G-418 | Sigma | 68168 | 0.3 mg/mL |
| FBS | Gibco | 10270 | 10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2 |
| AA | Sigma | A-5960 | 50 µg/mL |
| ß-GP | Sigma | G9422-100G | 7.5 mM |
| Bio-Gel HTP Gel | Bio-Rad | 130-0420 | for HA |
| FA | synthesized by us | ||
| CA | synthesized by us | ||
| Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture | Sigma | S7907/S8282 | 0.1 M, pH 7.2 |
| PBS | pH 7.0, prepared by us | ||
| AR-S in PBS | Sigma | A5533-25G | 0.5 g/100 mL, pH 5.0 |
| Collagenase type IA | Sigma | C2674 | 500 U/mL |
| SCL buffer | prepared by us | ||
| Deionized wather | produced by us | ||
| Ethanol | POCh | BA6480111 | absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90% |
| Uranyl acetate in 50% ethanol | Polysciences Inc. | 21447-25 | 0.25 g/10 mL |
| PD medium | pH 7.4, prepared by us | ||
| Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde) | Sigma | 158127/G-6257 | 3%:1% |
| Post-fixation OsO4 | Sigma | 75633 | 1% |
| LR White resin in ethanol | Polysciences Inc. | 17411-MUNC 500g | 1:2, 1:1, 100% |
| Acetone | CHEMPUR | 111024800 | pure |
| Tool | |||
| Cryogenic vials | Corning Inc. | 430487 | 1.2 mL |
| Plastic Petri culture dishes | Falcon | 353003 | 100 mm |
| Plastic tubes | Falcon | 352096 and 352070 | 15 and 50 mL |
| Serological pipettes | Falcon and VWR | 357521 and 612-3700 | 1 and 10 mL |
| Plastic microcentrifuge tubes | Sigma | Z688312 and Z628034 | 1.5 mL black and 2 mL transparent |
| Plastic tips | VWR | 613-0364, 613-0239 and 613-1050 | 0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue |
| Plastic racks | Light Labs | A-7055-Z, A-7053-C | green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes |
| Laminar Hera Save | Thermo Scientific Co. | KS12 | HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822) |
| Incubators Hera Cell | Thermo Scientific Co. | 150 | 34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2 |
| Fume hood | POLON | WCS-2 | for TEM stainings |
| Glass bottles | SIMAX | 1632414501050 and 1632414501100 | 50 and 100 mL |
| Quartz glass tubes | SIMAX | 638422010100 | Ø 10 mm, L 100 mm |
| Pump | IBS Integra Biosciences | VACUSAFE comfort | for vacuum |
| Oven | Memmert | UNE 400 | 56°C |
| Porcelain multi-well plate | Rosenthal technik | 229/12 | 12 wells |
| Glass beakers | SIMAX | 632417010025 | 25 mL |
| Glass bottles | Pocord | DIN22 | 10 mL |
| Plastic box | Agar Scientific Ltd. | for darkness | |
| Snap Fit Gelatin Capsules | Agar Scientific Ltd. | G3741 | size 1 |
| Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box | Agar Scientific Ltd. | S162N3 | film on the shiny side |
| Silicon cell scraper | Sigma | SIAL0010-100EA | size 1.8/25 cm |
| Syringe with needle | BogMark | 007 | syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16 |
| Syringe | Chirana | CH005L | 5 mL |
| Centrifuge | MPW Medical Instruments | MPW-350R | 130 x g and 500 x g |
| UV transluminator | UVP | M-20 | for visible and UV light |
| Ultramicrotome | LKB | NOVA | 700Å sections |
| Block holder | LKB | E6711 | round shape |
| Diamond knife | DiATOME | Ultra 45° | size 3 |
| Eyelash holder | bovine, prepared by us | ||
| Forceps | ROTH | 2855.1 | antistatic for grids |
| Spatulas set | ROTH | E286.1 | antistatic for powders |
| Imaging | |||
| Inverted Light Microscope | Zeiss with Canon | AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9 | Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters |
| Transmission Electron Microscope | TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus | JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera | magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX |
| Camera body and lenses | Nikon | Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D |
for movie recordings |
| Microphone | MXL Mics | Tempo | for voice recordings |
References
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