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Chemistry

ऊर्जा फैलाव एक्स-रे Microanalysis के साथ संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर hFOB १.१९ और Saos-2 कोशिकाओं द्वारा उत्पादित खनिजों का विश्लेषण

Published: June 24, 2018 doi: 10.3791/57423
Automatic Translation
1, 1, 2,3,4,5,6, 2,3,4,5,6, 1, 1
1Laboratory of Lipid Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences, 2Université de Lyon, 3Université Lyon 1, 4L'insitut National des Sciences Appliquées (INSA) de Lyon, 5Ecole Supérieure de Chimie Physique Electronique (CPE) Lyon, 6Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Unité Mixte de Recherche (UMR), L'institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires (ICBMS)

Summary

hFOB १.१९ और Saos-2: हम दो मानव हड्डी सेल लाइनों द्वारा जारी बुलबुले में खनिजों की स्थिति की तुलना करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । उनके mineralization प्रोफाइल Alizarin लाल-एस (ए. एस.) धुंधला, पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश दृश्य, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) इमेजिंग और ऊर्जा प्रसारक एक्स-रे microanalysis (EDX) द्वारा विश्लेषण किया गया ।

Abstract

hFOB १.१९ और Saos-2: यह वीडियो ऊर्जा फैलाव एक्स-रे microanalysis (उनि-EDX) के साथ संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग दो मानव हड्डी सेल लाइनों द्वारा जारी बुलबुले में खनिजों की स्थिति की तुलना करने के लिए प्रस्तुत करता है । इन सेल लाइनों, ascorbic एसिड (ए. ए.) और β-glycerophosphate (β-जीपी) के साथ उपचार के बाद, mineralization के लिए प्रसार से पूरा osteogenic transdifferentiation गुजरना और मैट्रिक्स बुलबुले (MVs) है कि ट्रिगर में एपेटाइट nucleation का उत्पादन extracellular मैट्रिक्स (ECM) ।

Alizarin लाल एस पर आधारित (AR-s) धुंधला और कोशिका lysates में पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश का उपयोग कर या बुलबुले में EDX quantitation और आयन मानचित्रण के बाद उनि इमेजिंग का प्रयोग करते हुए खनिजों की संरचना का विश्लेषण, हम अनुमान कर सकते है कि ऑस्टियो Saos-2 और osteoblastic hFOB १.१९ कोशिकाओं अलग mineralization प्रोफाइल प्रकट करते हैं । Saos-2 कोशिकाओं hFOB १.१९ कोशिकाओं से अधिक कुशलता से mineralize और बड़े खनिज जमा है कि यूवी प्रकाश के तहत दिखाई नहीं दे रहे हैं, लेकिन hydroxyapatite के समान है (हा) में है कि वे और अधिक सीए और एफ प्रतिस्थापन है ।

इन तकनीकों का उपयोग कर प्राप्त परिणाम हमें समाप्त करने के लिए कि mineralization की प्रक्रिया अलग सेल प्रकार के आधार पर अनुमति देते हैं । हम प्रस्ताव है कि, सेलुलर स्तर पर, मूल और बुलबुले के गुण खनिजों के प्रकार का निर्धारण ।

Introduction

अस्थि संयोजी ऊतक दो भागों से बना का एक प्रकार है: कार्बनिक (कोशिकाओं और कोलेजन फाइबर) और खनिज (कैल्शियम और फॉस्फेट यौगिकों) । हड्डियों में मुख्य खनिज अवयव१apatites होते हैं. अस्थियों में mineralization-सक्षम कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार (osteoblasts), दाँतों में (odontoblasts) और उपास्थि (chondrocytes) में mineralization मैट्रिक्स (extracellular) के प्रोटीन का उत्पादन करके ECM के आरंभिक चरणों को विनियमित करना और मैट्रिक्स जारी करना बुलबुले (MVs) (चित्रा 1) । MVs 100-300 एनएम व्यास बुलबुले कि कैल्शियम और फॉस्फेट जमा एपेटाइट nucleation की सुविधा और बाद में कोलेजन2,3को बांध रहे हैं । उसके बाद, MVs extracellular माध्यम को apatites जारी करने के लिए विखंडित । apatites कोलेजन फाइबर के साथ संपर्क में वृद्धि और अस्थि मैट्रिक्स के रूप में जारी है । mineralization extracellular माध्यम में Pi और Ca2 + की निरंतर आपूर्ति के द्वारा निरंतर किया जाता है । कुछ हाल ही में प्रकाशित डेटा हमारे मॉडल4,5समर्थन करते हैं । कोमल ऊतकों शारीरिक स्थितियों के तहत mineralize नहीं है । हालांकि, अस्थानिक पत्थराना रोग स्थितियों जैसे संवहनी पत्थराना3के तहत हो सकता है । संवहनी कोशिकाओं है कि osteoblast phenotype प्राप्त MVs का उत्पादन कर सकते है कि nucleation apatites के प्रेरित और औसत दर्जे का और mineralization की दीवार की परतों में intimal आरंभ रक्त वाहिकाओं । चूंकि अस्थानिक पत्थराना सामांय endochondral mineralization3के समान है, mineralization कोशिकाओं और osseous के chondrocytes के आणविक तंत्र को समझने कोमल ऊतकों के अस्थानिक पत्थराना पर कुछ सुराग प्रदान करना चाहिए कि कर रहे है गठित.

कंकाल के ऊतकों के विकास के विभिंन एंजाइमों द्वारा विनियमित है, विकास कारकों, और प्रवर्तकों या mineralization के अवरोधकों । ऊतक के विरोधी कार्रवाई-गैर-विशिष्ट alkaline फॉस्फेट (TNAP) (चित्रा 1) और ectonucleotide pyrophosphatase/फोस्फोडाईस्टेरेज मैं (NPP1), ankyrin (ांक) के साथ एक साथ, नियंत्रण अकार्बनिक pyrophosphate (पीपीमैं) एकाग्रता 6. पीपीमैं, हा गठन के एक शक्तिशाली अवरोधक, TNAP द्वारा hydrolyzed है; NPP1 hydrolyzes न्यूक्लियोटाइड triphosphates को फार्म पीपीi के दौरान ांक निर्यात पीपीi को सेल से ECM । Pi/पीपीआई अनुपात एपेटाइट गठन7,8 संभावित रोग परिणाम9के साथ विनियमित कर सकते हैं ।

एमवी झिल्ली nucleation प्रक्रिया (चित्रा 1) के दौरान MVs के अंदर कैल्शियम और फॉस्फेट की प्रारंभिक वर्षा की सुविधा है कि आयन परिवहन प्रोटीन में समृद्ध है. फॉस्फेट ट्रांसपोर्टर 1 (गड्ढे)मैं MVs10,11में perivesicular अंतरिक्ष में उत्पन्न पी को शामिल करने में मदद करता है. Annexins में शामिल किया जा सकता है बाध्यकारी और परिवहन के Ca2 + और में शुरू होता है कि mineralization में है कि एमवी12,13लुमेन । हम परिकल्पना एहसान, पहले का सुझाव दिया, के भीतर mineralization के लिए एपेटाइट के आंतरिक nucleation के बुलबुले के अंदर ECM14,15में इसके प्रचार से पहले intracytoplasmic । इन विट्रो मॉडलिंग में सीए की प्रेरण2 +/Pमैं proteoliposomes में परिसरों पी एस और16AnxA5 से बने निर्माण की पुष्टि की । यह संकेत हो सकता है कि सीए के संचय2 +, पीमैं, AnxA5 और पुनश्च परिसरों microvilli की लिपिड बेड़ी में membranesrepresent की तरह nucleation कोर (नेकां) एपेटाइट के भीतर एमबनाम Annexins और TNAP भी कोलेजन के अधिकारी-बाध्यकारी क्षमता है कि कोलेजन फाइबर के साथ MVs रखने में सहायक हो सकता है और, ECM में mineralization के प्रसार उत्तेजक में । Fetuin एक और osteopontin (OPN)17, एपेटाइट गठन के अवरोधकों के रूप में जाना जाता है कि नीचे कोलेजन पाड़ पर mineralization के प्रसार को धीमा कर सकते हैं । Nucleation और प्रचार अलग घटनाओं रहे हैं, पूर्व पूर्ववर्ती उत्तरार्द्ध, और दोनों रोग mineralization की प्रक्रिया के लिए प्रासंगिक हो सकता है ।

खोजने के लिए कैसे कैल्शियम फॉस्फेट परिसरों के रसायन विज्ञान शारीरिक mineralization और अस्थानिक पत्थराना बदल सकते हैं, यह कोशिकाओं द्वारा उत्पादित खनिजों की पहचान करने के लिए आवश्यक है. Apatites सामान्य क्रिस्टल इकाई सेल फॉर्मूला सीए10(पीओ4)6एक्स2, जहां एक्स = सीएल, एफ, ओह के साथ कैल्शियम और फॉस्फेट युक्त खनिजों का एक समूह है । वे निम्नानुसार वर्गीकृत कर रहे हैं18: fluorapatite (एफए) सीए10(पीओ4)6एफ2, chlorapatite (सीए) सीए10(पीओ4)6सीएल2 और hydroxyapatite (हा) सीए10(पीओ4 )6(OH)2.

osteoblast सेल लाइनों का चुनाव खनिज गठन प्रेरित करने के लिए महत्वपूर्ण है, के बाद से प्रत्येक सेल लाइन mineralization का एक विशिष्ट प्रोफ़ाइल प्रदर्शित करता है । इस रिपोर्ट में, हम mineralization के दो चयनित मानव कोशिका मॉडल: osteoblastic hFOB १.१९ कोशिकाओं और ऑस्टियो Saos-2 कोशिकाओं द्वारा खनिजों के nucleation की तुलना में । ऑस्टियो-व्युत्पन्न कोशिकाओं आमतौर पर osteoblastic मॉडल और Saos-2 कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया जाता है सबसे परिपक्व osteoblastic चरित्र19 संरक्षित है, जबकि विभेदित मानव भ्रूण hFOB कोशिकाओं को व्यापक रूप से सामान्य osteoblastic के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं विभेद20. Alizarin लाल-s (AR-s) धुंधला, पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश दृश्य, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) इमेजिंग, ऊर्जा फैलाव एक्स-रे microanalysis (EDX) quantitation, और आयन: उनके mineralization प्रोफाइल अलग तरीकों से विश्लेषण किया गया मैपिंग. पिछले अध्ययनों में प्रयुक्त वैकल्पिक तकनीकों पर उनि-EDX का लाभ यह है कि यह एपेटाइट क्रिस्टल में आयन प्रतिस्थापन की मात्रात्मक और गुणात्मक परिणाम देता है4,5,21. उनि-EDX का उपयोग करने के समग्र लक्ष्य को इमेजिंग और mineralization प्रक्रिया के विभिन्न चरणों के दौरान कोशिकाओं के विभिंन प्रकार से विभिंन खनिजों में सीए, एफ और सीएल आयनों के वितरण के ठहराव के लिए एक सरल तरीका मिल गया था । इस विधि का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, उदाहरण के लिए, एक साथ रसायन और जलीय जीवों पर उनके संयुक्त प्रभाव के साथ जिंक नैनोकणों की बातचीत की निगरानी के लिए22। एक अंय अध्ययन में, टाइटेनियम सामग्री पर एक तांबे photocatalyst जलीय समाधान में बड़े पैमाने पर inductively युग्मित प्लाज्मा ऑप्टिकल उत्सर्जन स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-OES), N2 physisorption (बेट), XRD, यूवी की तुलना डीआरएस, एफटी-IR, रमन के माध्यम से की विशेषता थी स्पेक्ट्रोस्कोपी, उनि-EDX, व photoelectrochemical माप23. हमारा उद्देश्य मूल और दो सेल लाइनों में बुलबुले और खनिजों के गुणों की तुलना तंत्र है कि नियंत्रण osseous भेदभाव के दौरान mineralization समझ गया था ।

Figure 1
चित्रा 1 . osseous कोशिकाओं में mineralization के प्रारंभिक चरणों की योजना extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन और झिल्ली से मैट्रिक्स बुलबुले (MVs) के रिलीज के संश्लेषण को शामिल। MVs कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन की कार्रवाई के माध्यम से कैल्शियम जमा, annexins और फॉस्फेट, एक अकार्बनिक फॉस्फेट ट्रांसपोर्टर की कार्रवाई के माध्यम से (गड्ढे) ऊतक गैर विशिष्ट alkaline फॉस्फेट (TNAP) की गतिविधि के बाद, जो dephosphorylates पीपीमैं पीमैं, जिससे एपेटाइट nucleation सुविधा । फिर, MVs विखंडित और extracellular माध्यम apatites जारी । mineralization extracellular मीडियम4,5में Pi और Ca2 + की लगातार आपूर्ति के द्वारा निरंतर है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Protocol

1. सेल संस्कृति और उपचार

  1. लामिना प्रवाह हूड के तहत सभी आवश्यक सामग्री रखो और उंहें यूवी प्रकाश के तहत निष्फल । संस्कृति मीडिया रहे हैं: है हैम F12 और DMEM मीडिया के २.५ mM L-glutamine १०० U/एमएल पेनिसिलिन के साथ पूरक के साथ एक 1:1 मिश्रण, १०० यू/एमएल streptomycin, ०.३ मिलीग्राम/एमएल G418 और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) (v/v/मानव भ्रूण hFOB के लिए १.१९ SV40 बड़ी टी प्रतिजन transfected osteoblasts, और McCoy ए 5 ए के साथ १.५ मिमी L-glutamine के साथ पूरक १०० u/एमएल पेनिसिलिन, १०० u/एमएल streptomycin और 15% FBS (वी/वी) मानव ऑस्टियो Saos-2 कोशिकाओं के लिए ।
  2. संस्कृति hFOB १.१९ कोशिकाओं के वातावरण में ३४ ° c पर 5% co2 और Saos-2 कोशिकाओं के एक वातावरण में ३७ ° c 5% co2. स्थानांतरण सेल संस्कृतियों, या तो hFOB १.१९ या Saos-2 कोशिकाओं, लामिना प्रवाह हूड के लिए मशीन से और FBS के साथ ताजा संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर के माध्यम से बदल जाते हैं ।
  3. उत्तेजितकों के बिना गर्मी कोशिकाओं (कोशिकाओं को आराम) या उंहें ५० µ जी/एमएल Ascorbic एसिड के साथ उत्तेजित (ए. ए.) ७.५ mM β-Glycerophosphate (β-जीपी) द्वारा पीछा किया, ultrapure पानी में पहले तैयार है और ०.२२ µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड । संस्कृति माध्यम की सतह पर प्लास्टिक microcentrifuge ट्यूबों से उत्तेजितकों जोड़ें । धीरे संस्कृति पकवान और 7 दिनों के लिए मशीन हलचल ।

2. कैल्शियम खनिज का पता लगाने

  1. फॉस्फेट बफर खारा के साथ सेल संस्कृतियों धो (पंजाब: १२५ mm NaCl, 5 मिमी KCl, 10 मिमी ना2HPO4, 1 मिमी KH2पीओ4, पीएच ७.०) ।
  2. पंजाब में 2% (g:100 एमएल) एआर-एस के 5 मिलीलीटर जोड़ें, ५.० पीएच और खनिज दाग के लिए 30 मिनट के लिए प्लेटें ।
  3. पंजाबियों के साथ 3 बार धोएं । ध्यान से पंजाबियों को डिश वॉल से जोड़ने, खनिजों को नष्ट नहीं करने की कोशिश करो ।
  4. एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कैल्शियम खनिज का निरीक्षण करें और छवियों को ले लो ।

3. यूवी प्रकाश के तहत जांच के दृश्य

  1. सेल lysates के लिए, कोशिका संस्कृतियों का इलाज, या तो आराम या 7 दिनों के लिए उत्तेजित, collagenase पाचन प्रोटोकॉल24के अनुसार ।
  2. सेल संस्कृतियों से मध्यम इकट्ठा और पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
  3. 3 एच के लिए ०.०२ डिग्री सेल्सियस पर ०.२५ मीटर सुक्रोज, ०.१२ मीटर NaCl, ०.०१ एम KCl, और ७.४५ एम Tris-एचसीएल बफर, पीएच ३७, के समाधान में ५०० U/एमएल collagenase के 3 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को पचाने ।
  4. यांत्रिक कोशिकाओं परिमार्जन, उंहें प्लास्टिक microcentrifuge ट्यूबों के लिए स्थानांतरण, और उंहें पारित 10 बार एक 1 मिलीलीटर ४० यू ०.५ × 16 सुई के साथ सिरिंज के माध्यम से ।
  5. 5 मिनट के लिए ५०० × g पर नमूने केंद्रापसारक ।
  6. supernatant त्यागें और ५०० µ में सेल गोली निलंबित सिंथेटिक उपास्थि लसीका के एल (SCL, १०० मिमी NaCl, १२.७ मिमी KCl, ०.५७ मिमी MgCl2, १.८३ मिमी NaHCO3, ०.५७ मिमी णः2पीओ4, ५.५ मिमी डी-ग्लूकोज, ६३ मिमी सुक्रोज, १६.५ मिमी Hepes, पीएच ७.४) ।
  7. एक रंग और नियंत्रण के रूप में उपयोग के साथ यूवी transilluminator पर बोतलों से hydroxyapatite (हा), fluorapatite (एफए) और chlorapatite (सीए) पाउडर स्थानांतरण ।
  8. प्लास्टिक ट्यूबों के साथ प्लास्टिक की नलियों से सेल lysates को ट्रान्सफर करें और यूवी transilluminator पर ध्यान से रखें ।
  9. दृश्य और यूवी प्रकाश के तहत छवियों को ले लो ।

4. उनि-EDX के लिए जांच की तैयारी

  1. नकारात्मक दाग के लिए खनिजों की तैयारी
    1. निलंबित २.५ सिंथेटिक का उत्पादन किया हा, सीए और एफए खनिजों के ५०० µ l में25 से कम जल और मशीन के एक वातावरण में ३७ ° c 5% CO2 के लिए 1 एच ।
    2. antistatic संदंश के साथ बॉक्स से Formvar/कार्बन ३०० मेष नी ग्रिड ले लो, एक चीनी मिट्टी के बरतन बहु पर जगह अच्छी तरह से प्लेट और ड्रॉप 10 µ एल के l ग्रिड पर, CA और एफए निलंबन ।
    3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए नमूने सूखी ।
  2. 26 embedding के लिए आराम और उत्तेजित कोशिकाओं की तैयारी
    1. सेल संस्कृतियों से मध्यम इकट्ठा और शारीरिक संवेदीकरण (पीडी) मध्यम (१२५ mm NaCl, 5 मिमी KCL, 10 मिमी NaHCO3, 1 मिमी KH2पीओ4, 10 मिमी ग्लूकोज, 20 मिमी HEPES, पीएच ७.४) के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    2. 3% (g:100 एमएल) paraformaldehyde/1% (g:100 एमएल) के मिश्रण के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को ठीक करें १०० mM सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच ७.२ में, धुएं हुड के तहत कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ।
    3. १०० mM सोडियम फॉस्फेट बफर की 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो और धीरे धोने के बाद बफर निकालें ।
    4. अंधेरे कमरे में, धुएं डाकू के तहत कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए १०० मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच ७.२ में 2 मिलीलीटर 1% (g:100 मिलीलीटर) आज़मियम tetroxide के साथ नमूनों पोस्टफिक्स ।
    5. आज़मियम tetroxide निकालें और इसका उपयोग करें ।
    6. १०० mM सोडियम फॉस्फेट बफर की 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    7. फिर, कमरे के तापमान पर एक वर्गीकृत इथेनॉल समाधान श्रृंखला के 5 मिलीलीटर aliquots में नमूनों निर्जलीकरण: 25% (vol. द्वारा) के लिए 5 मिनट, ५०% (vol.) के लिए 10 मिनट, ७५% (vol. द्वारा) 15 मिनट के लिए, ९०% (vol.) के लिए 20 मिनट के लिए । अंत में दो बार निरपेक्ष इथेनॉल का उपयोग करें और 30 मिनट और 12 एच के लिए मशीन ।
    8. यांत्रिक रूप से प्लास्टिक पेट्री संस्कृति व्यंजन से कोशिकाओं परिमार्जन, प्लास्टिक microcentrifuge ट्यूबों में इकट्ठा और 1 मिनट के लिए १३० x g पर नमूने केंद्रापसारक ।
    9. supernatants निकालें और 1:2 की मात्रा अनुपात में LR सफेद राल और निरपेक्ष इथेनॉल का एक मिश्रण के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित ।
    10. अच्छी तरह से मिश्रण से पहले कांच ट्यूबों की सामग्री का उपयोग करें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    11. 1 मिनट के लिए १३० x g पर नमूने केंद्रापसारक ।
    12. supernatants निकालें और LR सफेद राल और निरपेक्ष इथेनॉल का एक 1:1 मिश्रण के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर पिछले कदम दोहराने ।
    13. अच्छी तरह से मिश्रण और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए गर्मी ।
    14. 1 मिनट के लिए १३० x g पर नमूने केंद्रापसारक ।
    15. supernatants निकालें ।
    16. अंत में, दो बार नमूने के लिए शुद्ध LR सफेद राल के 1 मिलीलीटर जोड़ें और प्लास्टिक ट्यूबों में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
    17. जगह जिलेटिन कैप्सूल में प्रत्येक नमूने के ५०० µ एल ।
      नोट: नमूने कागज की एक छोटी सी चादर और एक पेंसिल का उपयोग कर लेबल कर रहे है ताकि राल लेबल को नष्ट नहीं करता है ।
    18. जिलेटिन कैप्सूल बंद करें, उंहें प्लास्टिक microcentrifuge ट्यूबों में डाल दिया है और एक स्विंग आउट रोटर में 1 मिनट के लिए १३० x g पर केंद्रापसारक ।
    19. प्लास्टिक ट्यूबों से कैप्सूल निकालें एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर ।
    20. नमूनों को ओवन में ले जाएं और ४८ h के लिए ५६ ° c पर polymerize ।
    21. उंहें धारक में बढ़ते और पिरामिड के लिए उंहें trimming द्वारा ब्लॉक तैयार करते हैं ।
    22. ultramicrotome में धारक रखो, हीरा अल्ट्रा ४५ ° चाकू देते है और यह जल के साथ भरें; आकस्मिक हवा बुलबुले से ब्लेड साफ करने के लिए याद रखें ।
    23. फिर वर्गों में कटौती (७०० Å) पर हीरा चाकू का उपयोग कर जल स्नान ।
    24. गोजातीय बरौनी का उपयोग कर स्क्रैप सेट करें और उन्हें Formvar/कार्बन ३०० मेष नी ग्रिड के चमकदार पक्ष पर रखें और उन्हें सुखाएं ।
    25. २.५% (vol. द्वारा) uranyl एक धुएं हुड के नीचे अंधेरे में निरपेक्ष इथेनॉल में एसीटेट तैयार करें । एक सीसा कंटेनर में uranyl एसीटेट रखें और तलछट लेने के लिए नहीं याद है ।
    26. अंधेरे कमरे में, counterstain सिंथेटिक apatites और सेल नमूनों के ग्रिड के साथ २.५% (vol.) uranyl एसीटेट के लिए इथेनॉल में 20 मिनट के लिए धुएं डाकू के तहत कमरे के तापमान पर ।
    27. ५०% इथेनॉल में ग्रिड धो (vol.), तो पानी में और शुष्क कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए । अंत में, ग्रिड बॉक्स में डाल दिया ।

५. उनि-EDX विश्लेषण

  1. एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप द्वारा उनि इमेजिंग (उनि) पूर्ण रेंज ऊर्जा फैलाव एक्स-रे microanalysis (EDX) प्रणाली और 11 मेगापिक्सेल कैमरा से सुसज्जित
    1. खनिजों और कोशिकाओं के अवलोकन के लिए एक बेरिलियम धारक तैयार करते हैं । antistatic उपकरणों का उपयोग करें ।
    2. शिकंजा की जोड़ी निकालें और बेरिलियम प्लेट और बेरिलियम वॉशर दूर बनाए रखने के आराम से उठा ।
    3. ग्रिड माउंट, चमकदार ओर, धारक पर ।
    4. ध्यान से बेरिलियम वॉशर और बेरिलियम प्लेट जगह और जकड़ना शिकंजा कसकर पेंच ।
    5. वैक्यूम चैंबर में धारक रखो और वैक्यूम पंप पर बारी ।
    6. एक बार एक वैक्यूम हासिल की है, धीरे इमेजिंग चैंबर में धारक डालें और बीम पर बारी ।
    7. फ्लोरोसेंट मॉनिटर पर, माइक्रोस्कोप के एपर्चर मापदंडों सेट । छवि दृष्टिवैषंय सुधार करते हैं; ज़ूम, फ़ोकस, और फ़्रेम सेट करें; और 50, 000X के एक आवर्धन पर उनि छवियों ले लो ।
  2. वर्णक्रमीय और रचनात्मक विश्लेषण के लिए स्टेम इमेजिंग और एक्स-रे microanalysis
    1. स्कैनिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (स्टेम) इमेजिंग चैंबर में ऊर्जा फैलाव एक्स-रे (EDX) डिटेक्टर डालें ।
    2. फोकस मोड में छवि के तेज समायोजित करें ।
    3. 15, 000X के एक आवर्धन पर स्टेम छवियों ले लो ।
    4. एक्स-रे microanalysis के लिए नमूने में एक बिंदु का चयन करें और स्पेक्ट्रा इकट्ठा ।
    5. नमूने में आवर्त सारणी के सभी तत्वों के लिए सभी परमाणु भार संक्षेप द्वारा डेटा प्राप्त (के रूप में १००%) और चयनित तत्वों की सामग्री वाचक: सीए, एफ, सीएल, और पी (परमाणु%) । उसके बाद, प्रत्येक नमूने के लिए P करने के लिए Ca, F या Cl के अनुपात की गणना ।
  3. आयन मानचित्रण
    1. चुनें तत्वों जैसे कैल्शियम, फ्लोरीन, क्लोरीन और फास्फोरस के लिए आयन मानचित्रण बनाने के लिए और नमूनों में चयनित तत्वों के EDX नक्शे प्रदर्शन करते हैं ।
    2. विश्लेषण तत्वों के स्थानीयकरण का संकेत द्वारा डेटा प्राप्त करें: सीए, एफ, सीएल, और पी (परमाणु%) के रूप में और सह स्थानीयकरण की गणना (% में सीए, एफ या पी के साथ सीएल प्रत्येक नमूने के लिए ।

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Representative Results

उनि-EDX में इन विट्रो मैट्रिक्स के इमेजिंग के लिए अनुमति देता है (MVs) mineralizing कोशिकाओं द्वारा जारी की और एमबनाम द्वारा उत्पादित खनिजों की इस तकनीक का उपयोग कर प्राप्त परिणाम प्रदर्शित करता है कि mineralization की प्रक्रिया को अलग ढंग से आगे बढ़ सकता है कोशिकाओं के विभिंन प्रकार में । दो सेल लाइनों एक ही osteoblastic transdifferentiation उपचार प्राप्त किया, फिर भी Saos-2 hFOB १.१९ osteoblasts से अधिक कुशलता से खनिज कोशिकाओं को उत्तेजित, के रूप में AR-S धुंधला (चित्रा 2) द्वारा सबूत । यह अधिक परिपक्व osteoblast phenotype Saos-2 कोशिकाओं के19 hFOB १.१९ कोशिकाओं की तुलना में20के कारण हो सकता है । एक यूवी transilluminator का उपयोग कर नमूनों के दृश्य यह स्पष्ट है कि केवल fluorapatites यूवी प्रकाश (चित्रा 3) के तहत मनाया जा सकता है बनाया है । उनि चित्र संकेत दिया है कि उत्तेजित Saos-2 कोशिकाओं और अधिक बुलबुले युक्त hFOB कोशिकाओं के लिए या आराम Saos-2 कोशिकाओं (चित्रा 4, बाएँ और मध्य पैनलों) के साथ की तुलना में खनिजों का उत्पादन । सिंथेटिक apatites खनिजों के विभिंन रूपों (चित्रा 4, सही पैनल) है । उनि छवियों hFOB १.१९ में बुलबुले की उपस्थिति और Saos-2 कोशिकाओं आराम और उत्तेजित शर्तों के तहत दिखाया (5 चित्रा, बाएं पैनल) । EDX आयन के नक्शे पर, लाल अंक कैल्शियम इंगित करता है, हरे अंक फास्फोरस और नीले अंक दिखाने के फ्लोरीन वितरण (चित्रा 5, मध्य पैनल) को इंगित करते हैं । उत्तेजित शर्तों के तहत, वहां एक मजबूत Saos-2 कोशिकाओं द्वारा उत्पादित बुलबुले में और फ्लोरीन और फास्फोरस के बीच hFOB १.१९ कोशिकाओं (चित्रा 5, दाहिने पैनल) द्वारा उत्पादित बुलबुले में कैल्शियम और फास्फोरस वितरण के बीच ओवरलैप है ।

Figure 2
चित्रा 2 . AR-खनिज के धुंधला (लाल) hFOB १.१९ (ऊपरी पैनल) और Saos-2 (नीचे पैनल) कोशिकाओं या तो आराम (आर) या ए. ए. और β-जीपी (एस के साथ उत्तेजना के 7 दिनों के बाद) द्वारा उत्पादित । बार: 25 µm । n = 3 के साथ एक विशिष्ट परिणाम प्रस्तुत किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . दृश्यमान (ऊपरी पैनल) और यूवी (मध्य पैनल) सिंथेटिक हा के प्रकाश दृश्य, सीए और एफए खनिज और hFOB द्वारा उत्पादित खनिजों की १.१९ (नीचे बाएं पैनल) और Saos-2 (नीचे सही पैनल) या तो आराम (आर) या एक के बाद के साथ उत्तेजना के 7 दिनों के बाद ए. ए. और β-जीपी (एस) . कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 4
चित्र 4 . hFOB १.१९ द्वारा उत्पादित बुलबुले और खनिजों के उनि छवियों (बाएँ पैनल) और Saos-2 (मध्य पैनल) कोशिकाओं या तो आराम (आर) या ए. ए. और β-जीपी (ओं) के साथ उत्तेजना के 7 दिनों के बाद. सिंथेटिक हा, सीए और एफए खनिज नियंत्रण (सही पैनल) के रूप में दिखाया जाता है । बार: सफेद ५०० एनएम, काले २५० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 5
चित्रा 5 . hFOB १.१९ और Saos-2 कोशिकाओं या तो आराम (आर) या ए. ए. और β-जीपी (एस के साथ उत्तेजना के 7 दिनों के बाद) के उनि छवियों (बाएँ पैनल). EDX (मध्य पैनल) से सीए (लाल), सीएल (पीला), एफ (नीला) और पी (ग्रीन) के लिए आयन मैप्स । तत्वों के सह स्थानीयकरण (दाएँ पैनल): फास्फोरस के लिए कैल्शियम (सीए), फ्लोरीन करने के लिए फास्फोरस (एफ), या फास्फोरस के लिए क्लोरीन (सीएल) EDX नक्शे पर आधारित quantified था । बार: ५०० एनएम । दोनों सेल लाइनों के लिए तीन स्वतंत्र प्रयोगों प्रदर्शन किया गया । प्रत्येक संस्करण से दस तस्वीरें (आराम और उत्तेजित) लिया गया है, तो उनमें से 2 से 6 तत्व सह स्थानीयकरण के आगे की गणना के लिए चुना गया । एक ठेठ परिणाम प्रस्तुत किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

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Discussion

वर्तमान समाचार पत्र में, हम एआर के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन एस धुंधला, fluorapatite और उनि के यूवी प्रकाश पहचान-EDX इन विट्रो MVs के mineralizing कोशिकाओं और MVs द्वारा उत्पादित खनिजों के द्वारा जारी की इमेजिंग। यह कुछ सामांय समस्या निवारण चरणों का पालन करके उपर्युक्त सभी विधियों का पता करने के लिए संभव है । इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, कई महत्वपूर्ण चरणों का सावधानीपूर्वक प्रदर्शन किया जाना चाहिए । सबसे पहले, यह ए. ए. जोड़ने के लिए बेहतर है (जो अंलीय है) β-जीपी के बाद (जो क्षारीय है) के लिए संस्कृति माध्यम के पीएच ७.४ के संरक्षण । दूसरा, के बाद AR-S धुंधला, दाग कैल्शियम जमा बहुत नाजुक है और कोशिकाओं को बहुत ध्यान से धोया जाना चाहिए के लिए पंजाबियों को जोड़ने पर क्रिस्टल के विनाश को रोकने के । तीसरा, हमेशा एक सीसा कंटेनर में uranyl एसीटेट रखने के लिए और तलछट लेने नहीं है क्योंकि केवल पतला अंश निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । चौथा, याद रखें कि एए और uranyl एसीटेट हल्के संवेदनशील होते हैं और इन्हें डार्क रूम में हैंडल किया जाना चाहिए । पांचवां, पूर्ण इथेनॉल के साथ LR सफेद के मिश्रण को नमूनों में जोड़ा जा रहा है पहले अच्छी तरह से मिलाया जाना चाहिए । छठे, जिलेटिन कैप्सूल में नमूनों कागज की एक छोटी सी चादर और एक पेंसिल का उपयोग कर लेबल होना चाहिए ताकि राल लेबल को नष्ट नहीं करता है । सातवें, हीरे चाकू के ब्लेड सावधानी से किसी भी हवा के बुलबुले से साफ किया जाना चाहिए । आठवें, नमूनों ग्रिड जहां Formvar/कार्बन फिल्म स्थित है के चमकदार पक्ष पर सावधानी से रखा जाना चाहिए । नवीं, स्थिति सही ढंग से जिस पर एक्स-रे microanalysis और आयन मानचित्रण उनि छवि पर किया जाता है एपेटाइट मांयता के साथ संभावित समस्याओं को सीमित है ।

हालांकि प्रस्तुत प्रोटोकॉल हमारे प्रयोगात्मक डिजाइन में सबसे अनुकूल साबित हुआ, यह संभव है इसे संशोधित करने के लिए विभिंन लक्ष्यों को फिट । किसी भी अंय तकनीक के साथ के रूप में, यह एक भी अपनी सीमाएं हैं । अतिरिक्त तकनीक, जैसे स्विचेज, की पुष्टि करने के लिए लागू किया जाना चाहिए या जांच तत्वों के प्राप्त अनुपात के अस्तित्व को सत्यापित8,12,26। यहां प्रस्तुत की गई उनि-EDX विधि मौजूदा पद्धति के संबंध में उल्लेखनीय सुधार है, जो सूक्ष्म रमण आधारित मानचित्रण और chemometric विधियों का संयोजन है और विभिन्न को सिल्वर नैनोकणों (AgNPs) वितरण इमेजिंग के समान है खनिज की सतहों और उनके आणविक बातचीत के तंत्र21. रमन आधारित इमेजिंग दो खनिज मॉडलों पर परीक्षण किया गया है (स्थूल और सूक्ष्म आकार) । रमन नक्शे के बने n = 600-900 स्पेक्ट्रा प्रत्येक नमूने के लिए/Vespucci सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण किया गया और परिणाम आईसीपी जैसे अंय तरीकों के माध्यम से पुष्टि की गई-OES, AFM, और SEM-EDX । हमारे उनि-EDX नक्शे शामिल n = 30 फ्रेम और n = 6 स्पेक्ट्रा प्रत्येक नमूने के लिए भी Microanalysis suite सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण किया गया है, और परिणाम जैसे स्विचेज, एफएम, उनि, एसपीएम और 3 डी स्थलाकृतिक AFM4 के रूप में अन्य तरीकों के माध्यम से पुष्टि की गई , 5. रमण आधारित इमेजिंग की तरह प्रस्तावित उनि-EDX microanalysis, केवल न्यूनतम नमूना तैयारी की आवश्यकता है, सुपर संवेदनशील, गैर इनवेसिव, और लागत प्रभावी है, और मानव पर्यावरण के लिए प्रासंगिक अन्य प्रणालियों के लिए बढ़ाया जा सकता है.

प्रस्तुत तकनीक भविष्य में अनुसंधान के एक व्यापक क्षेत्र में इस्तेमाल किया जा सकता है । यह अलग प्राकृतिक और सिंथेटिक apatites की जांच के लिए संशोधित किया जा सकता है । यह भी जैविक और रासायनिक जांच के साथ प्रयोग के प्रोटोकॉल फिट समायोजित किया जा सकता है । इसके अलावा, आवधिक तालिका से सभी तत्वों को न केवल खनिजों की आकृति विज्ञान कल्पना करने के लिए, लेकिन यह भी उनके आयन संरचना और प्रतिस्थापन में परिवर्तन का विश्लेषण किया जा सकता है । apatites में आयन एक्सचेंज बायोमेडिकल27आवेदन के लिए एक ज्ञात प्रक्रिया है । एक संभव शारीरिक कारक है कि नियंत्रण Ca, एफ और सीएल आयनों या Sr, एमजी, Mn और Zn खनिज गठन के दौरान हा में धातु आयन प्रतिस्थापन, जो शारीरिक और रोग mineralization के बीच एक मोड़ है, हो सकता है पीमैं/PPमैं अनुपात7. यदि ठीक से लागू किया, इस तकनीक को एक ही सेलुलर, vesicular या खनिज क्षेत्र के कई तत्वों की मानचित्रण प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है एक पंक्ति में अनेक बार ।

हाल के वर्षों में, बहुत प्रगति अस्थि mineralization28,29,30,31,३२,३३के तंत्र के विषय में किया गया था । हमने महसूस किया कि अलग सेल लाइनों बुलबुले और खनिज गठन के विशिष्ट प्रोफाइल हो सकता है । इस संबंध में, हमने दो मानव कोशिका रेखाओं का चयन किया है: osteoblastic hFOB १.१९ और ऑस्टियो Saos-2, जो कि जखीरे से osteogenic तक पूरी transdifferentiation mineralization से गुजरती हैं और MVs का उत्पादन करती हैं जो एपेटाइट nucleation में ECM ३४ , ३५.

एआर-एस कैल्शियम जमा के दाग से पता चला कि उत्तेजित Saos-2 hFOB १.१९ osteoblasts से अलग खनिज कोशिकाओं । यह Saos-2 कोशिकाओं है कि hFOB १.१९ कोशिकाओं द्वारा उत्पादित उन के विपरीत में यूवी प्रकाश के तहत undetectable थे द्वारा खनिजों के उत्पादन के साथ संबंधित था । हमारे उनि-EDX डेटा से पता चला कि Saos-2 कोशिकाओं के बुलबुले में उत्पादित खनिजों के सिंथेटिक हा कैल्शियम और फास्फोरस वितरण में ओवरलैप के कारण के समान थे । इसके विपरीत, फ्लोरीन और hFOB १.१९ कोशिकाओं से बुलबुले में फास्फोरस वितरण में ओवरलैप apatites के अलावा खनिजों के अंय प्रकार के गठन का संकेत दिया ।

अंत में, हमारे निष्कर्षों संकेत मिलता है कि बुलबुले खनिज nucleation के प्रमुख निर्धारकों, विशेष रूप से सेलुलर स्तर5,25पर हैं । इसके अलावा हमारे डेटा एक पहले सिद्धांत के साथ समझौते में है कि MVs microvesicles के एक विशेष रूप है कि अंदर mineralization शुरू कर रहे है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल के बाहर4के रूप में माना जा सकता है । Saos-2 कोशिकाओं है, जो और अधिक कुशलता से mineralize से जारी बुलबुले की तुलना, और hFOB १.१९ उनि-EDX microanalytical विधि का उपयोग कर कोशिकाओं से जारी बुलबुले की परिकल्पना है कि MVs खनिज भर रहे है बुलबुले का समर्थन करता है । यह सवाल है कि क्या MVs की उपस्थिति एपेटाइट nucleation प्रेरित करने के लिए आवश्यक है खुला पत्ते, और कैसे यह रोग mineralization के लिए शारीरिक बदल सकता है ।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

एमके और पूछो मैनुअल संचालन और पौंड तैयार चित्र प्रदर्शन किया और फिल्म बना दिया । पूछने पर पांडुलिपि लिखी, पौंड की पटकथा लिखी और मनोज ने टेबुल तैयार किया । एसएम, आरबी और एसपी गंभीर ने टेबुल, लिपि और पांडुलिपि पढ़ी । लेखक ultramicrotomy के साथ उसे उत्कृष्ट सहायता के लिए हैना Chomontowska धंयवाद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Szymon Suski और Henryk Bilski के साथ उनके उत्कृष्ट सहायता के लिए उनि-EDX विश्लेषण । लेखक के निर्देश रिकॉर्डिंग के लिए पेशेवर अंग्रेजी भाषा सुधार और बारबरा Sobiak के लिए डॉ पैट्रिक पेड़ों शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

यह काम अनुदान एन N401 १४०६३९ द्वारा विज्ञान और उच्च शिक्षा के पोलिश मंत्रालय से, पूछने के लिए राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, पोलैंड 2016/23/n/NZ4/03313 to LB और 2016/23/n/NZ1/02449 से एमके, EU FP7 परियोजना की कल्पना : अनुसंधान नवाचार और शिक्षा में जैव इमेजिंग, GA No. २६४१७३, और प्रायोगिक जीवविज्ञान के Nencki संस्थान के सांविधिक कोष द्वारा, पोलिश विज्ञान अकादमी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture PAA E15-813 1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium PAA E82312-0025 for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin) Sigma P0781-100ML 100 U/mL each
G-418 Sigma 68168 0.3 mg/mL
FBS Gibco 10270 10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA Sigma A-5960 50 µg/mL
ß-GP Sigma G9422-100G 7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel Bio-Rad 130-0420 for HA
FA synthesized by us
CA synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture Sigma S7907/S8282 0.1 M, pH 7.2
PBS pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS Sigma A5533-25G 0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA Sigma C2674 500 U/mL
SCL buffer prepared by us
Deionized wather produced by us
Ethanol POCh BA6480111 absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol Polysciences Inc. 21447-25 0.25 g/10 mL
PD medium pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde) Sigma 158127/G-6257 3%:1%
Post-fixation OsO4 Sigma 75633 1%
LR White resin in ethanol Polysciences Inc. 17411-MUNC 500g 1:2, 1:1, 100%
Acetone CHEMPUR 111024800 pure
Tool
Cryogenic vials Corning Inc. 430487 1.2 mL
Plastic Petri culture dishes Falcon 353003 100 mm
Plastic tubes Falcon 352096 and 352070 15 and 50 mL
Serological pipettes Falcon and VWR 357521 and 612-3700 1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes Sigma Z688312 and Z628034 1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips VWR 613-0364, 613-0239 and 613-1050 0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks Light Labs A-7055-Z, A-7053-C green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save Thermo Scientific Co. KS12 HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell Thermo Scientific Co. 150 34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood POLON WCS-2 for TEM stainings
Glass bottles SIMAX 1632414501050 and 1632414501100 50 and 100 mL
Quartz glass tubes SIMAX 638422010100 Ø 10 mm, L 100 mm
Pump IBS Integra Biosciences VACUSAFE comfort for vacuum
Oven Memmert UNE 400 56°C
Porcelain multi-well plate Rosenthal technik 229/12 12 wells
Glass beakers SIMAX 632417010025 25 mL
Glass bottles Pocord DIN22 10 mL
Plastic box Agar Scientific Ltd. for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules Agar Scientific Ltd. G3741 size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box Agar Scientific Ltd. S162N3 film on the shiny side
Silicon cell scraper Sigma SIAL0010-100EA size 1.8/25 cm
Syringe with needle BogMark 007 syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe Chirana CH005L 5 mL
Centrifuge MPW Medical Instruments MPW-350R 130 x g and 500 x g
UV transluminator UVP M-20 for visible and UV light
Ultramicrotome LKB NOVA 700Å sections
Block holder LKB E6711 round shape
Diamond knife DiATOME Ultra 45° size 3
Eyelash holder bovine, prepared by us
Forceps ROTH 2855.1 antistatic for grids
Spatulas set ROTH E286.1 antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope Zeiss with Canon AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9 Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses Nikon Nikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D 		for movie recordings
Microphone MXL Mics Tempo for voice recordings

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रसायन विज्ञान अंक १३६ खनिज बुलबुले osteoblasts ऑस्टियो यूवी प्रकाश उनि-EDX
ऊर्जा फैलाव एक्स-रे Microanalysis के साथ संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर hFOB १.१९ और Saos-2 कोशिकाओं द्वारा उत्पादित खनिजों का विश्लेषण
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