Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Analyse av mineraler produsert av hFOB 1,19 og Saos-2 celler ved hjelp av overføring elektronmikroskop med energi dispersiv X-ray Microanalysis

Published: June 24, 2018 doi: 10.3791/57423
Automatic Translation
1, 1, 2,3,4,5,6, 2,3,4,5,6, 1, 1
1Laboratory of Lipid Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences, 2Université de Lyon, 3Université Lyon 1, 4L'insitut National des Sciences Appliquées (INSA) de Lyon, 5Ecole Supérieure de Chimie Physique Electronique (CPE) Lyon, 6Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Unité Mixte de Recherche (UMR), L'institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires (ICBMS)

Summary

Vi presenterer en protokoll for å sammenligne tilstanden til mineraler i blemmer utgitt av to menneskelig bein linjer: hFOB 1,19 og Saos-2. Deres mineralisering profiler ble analysert av Alizarin Red-S (AR-S) flekker, ultrafiolett (UV) lys visualisering, overføring elektronmikroskop (TEM) bildebehandling og energi dispersiv X-ray microanalysis (EDX).

Abstract

Denne videoen viser bruk av overføring elektronmikroskop med energi dispersiv X-ray microanalysis (TEM-EDX) å sammenligne tilstanden av mineraler i blemmer utgitt av to menneskelig bein linjer: hFOB 1,19 og Saos-2. Disse linjer, etter behandling med askorbinsyre (AA) og β-glycerophosphate (β-GP), gjennomgå komplett osteogenic transdifferentiation fra spredning til mineralisering og produsere matrix blemmer (MVs) som utløser apatitt nucleation i den ekstracellulær matrix (EFM).

Basert på Alizarin Red-S (AR-S) flekker og analyse av sammensetningen av mineraler i celle lysates med ultrafiolett (UV) lys eller blemmer med TEM imaging etterfulgt av EDX kvantifisering og ion kartlegging, kan vi antyde at osteosarcoma Saos-2 og osteoblastic hFOB 1,19 celler avsløre distinkte mineralisering profiler. SAOS-2 celler mineralize mer effektivt enn hFOB 1,19 celler og produsere større mineralforekomster som vises ikke under UV lys, men som ligner på hydroxyapatite (HA) ved at de har flere Ca og F erstatninger.

Resultatene disse teknikkene tillater oss å konkludere med at prosessen med mineralisering varierer avhengig celle. Vi foreslår at på cellenivå, opprinnelse og egenskaper av blemmer forhåndsbestemme av mineraler.

Introduction

Ben er en type bindevev består av to deler: organisk (celler og kollagen fibrene) og mineral (kalsium og fosfat forbindelser). Mineral hovedkomponentene i bein er direkte oversatt: apatitter1. Ulike typer mineralisering kompetente celler i bein (osteoblasts), tenner (odontoblasts) og brusk (chondrocytes) regulere forbokstaven skritt av mineralisering av produserer proteiner av den ekstracellulære matrisen (ECM) og slippe matrise blemmer (MVs) (figur 1). MVs er 100-300 nm diameter blemmer som akkumuleres kalsium og fosfat tilrettelegge apatitt nucleation og deretter binde kollagen2,3. Deretter nedbryte MVs for å løslate direkte oversatt: apatitter til ekstracellulære medium. De direkte oversatt: apatitter fortsette å vokse i kontakt med kollagen fibrene og danne bein matrix. Mineraliseringen er påført konstante tilførselen av Pjeg og Ca2 + i ekstracellulære medium. Noen nylig publiserte data støtte vår modell4,5. Myke vev ikke mineralize under fysiologiske forhold. Ektopisk forkalkninger kan imidlertid oppstå under patologiske tilstander som vaskulær forkalkninger3. Vaskulære celler som kjøper osteoblast fenotypen kan produsere MVs som induserer nucleation av direkte oversatt: apatitter og starte mineralisering i mediale og intimal lagene på veggen av blod fartøy. Siden ektopisk forkalkninger ligne normal endochondral mineralisering3, forstå molekylære mekanismer av mineralisering av osseous celler og chondrocytes bør gi noen hint om ektopisk forkalkning av mykt vev som er dannet.

Utvikling av skjelettet vev er regulert av ulike enzymer, vekstfaktorer, og arrangører og hemmere av mineralisering. Handlingen antagonistiske vev-uspesifikke alkalisk fosfatase (TNAP) (figur 1) og ectonucleotide pyrophosphatase/fosfodiesterase jeg (NPP1), sammen med ankyrin (ANK), styrer uorganiske pyrophosphate (PPjeg) konsentrasjon 6. PPjeg, en potent hemmer av HA formasjon, er hydrolyzed av TNAP; NPP1 hydrolyzes nucleotide triphosphates å danne PPjeg mens ANK eksporterer PPjeg fra cellen til ECM. Pi/PPT forholdet kan regulere apatitt formasjon7,8 med mulige patologisk konsekvenser9.

MV membranen er beriket i ion transport proteiner som letter første nedbør av kalsium og fosfat inne MVs under nucleation prosessen (figur 1). Den fosfat transporter 1 (PiT) bidrar til å innlemme Pjeg generert i perivesicular plass i MVs10,11. Annexins kan være involvert i bindingen og transport av Ca2 + og Biofysiske prosessen som starter mineralisering i MV lumen12,13. Vi ønsker hypotesen foreslått tidligere mineralisering innen Intracytoplasmatisk blemmer av interne nucleation av apatitt inne MV før sin forplantning i ECM14,15. In vitro modellering bekreftet induksjon av Ca2 +/Pjeg komplekser formasjon i proteoliposomes laget av PS og AnxA516. Dette kan tyde på at opphopning av Ca2 +, Pjeg, AnxA5 og PS komplekser i lipid flåter av microvilli-lignende membranesrepresent nucleation kjernen (NC) i apatitt Mvs Annexins og TNAP har kollagen-bindende kapasitet som kan være nyttig i å plassere MVs langs kollagenfibre og stimulere utbredelsen av mineralisering i ECM. Fetuin A og osteopontin (OPN)17, kalles hemmere av apatitt formasjon som kan forsinke spredning av mineralisering på collagenous skafottet. Begge kan være relevante for prosessen med patologisk mineralisering nucleation og overføring er forskjellige arrangementer, tidligere foran sistnevnte.

For å oppdage hvordan kjemien i kalsium fosfat komplekser kan endre fysiologiske mineralisering og ektopisk forkalkninger, er det nødvendig å identifisere mineraler produsert av cellene. Direkte oversatt: apatitter er en gruppe av kalsium og fosfat som inneholder mineraler med generelle krystall enheten cellen formelen Ca10(PO4)6X2, der X = Cl, F, OH. De er klassifisert som følger18: fluorapatite (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 og hydroxyapatite (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.

Valget av osteoblast linjer å skape mineral er viktig, siden hver celle linje viser en tydelig profil av mineralisering. I denne rapporten vi sammenlignet nucleation av mineraler av to valgte human celle modeller av mineralisering: osteoblastic hFOB 1,19 cellene og osteosarcoma Saos-2. Osteosarcoma-avledet celler brukes ofte som osteoblastic og Saos-2 celler har bevart de fleste eldre osteoblastic karakter19 mens udifferensierte menneskelige føtal hFOB celler er mye brukt som modell for vanlig osteoblastic differensiering20. Deres mineralisering profiler ble analysert av ulike metoder: Alizarin rød-S (AR-S) flekker, ultrafiolett (UV) lys visualisering, overføring elektronmikroskop (TEM) bildebehandling, energi dispersiv X-ray microanalysis (EDX) kvantifisering og ion tilordning. Fordelen med TEM-EDX over alternative teknikker som brukes i tidligere studier er at det gir kvantitative og kvalitative resultatene av ion erstatning i apatitt krystaller4,5,21. Det overordnede målet med å bruke TEM-EDX var å finne en enkel metode for bildebehandling og kvantifisering av fordelingen av Ca, F og Cl ioner i ulike mineraler fra forskjellige celler i forskjellige stadier av mineralisering. Denne metoden har blitt brukt, for eksempel for overvåking samspillet av sink nanopartikler coexisting kjemikalier og deres kombinerte effekten vannlevende organismer22. I en annen studie, en kobber photocatalyst på Titan materialer i vandig løsningen var mye preget med Induktivt kombinert plasma optisk utslipp massespektrometri (ICP-OES), N2 physisorption (innsats), XRD, UV-vis DRS, FT-IR, Raman spektroskopi og TEM-EDX photoelectrochemical målinger23. Vårt mål var å sammenligne opprinnelse og egenskaper av blemmer og mineraler i to linjer å forstå mekanismen som styrer mineralisering under osseous differensiering.

Figure 1
Figur 1 . Ordningen av de første trinnene av mineralisering i osseous celler syntesen av ekstracellulær matrix (EFM) proteiner og utgivelsen av matrix blemmer (MVs) fra membranen. MVs samle kalsium handlingen av kalsium bindende proteiner, annexins og fosfat, gjennom handling av en uorganisk fosfat transporter (PiT) etterfulgt av aktiviteten til vev ikke-spesifikk alkalisk fosfatase (TNAP), som dephosphorylates PPjeg Pjeg, og dermed tilrettelegge apatitt nucleation. Deretter MVs oppløsning og slipp direkte oversatt: apatitter til ekstracellulære medium. Mineraliseringen er påført konstante tilførselen av Pjeg og Ca2 + i ekstracellulære middels4,5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle kultur og behandling

  1. Sett alle nødvendige materialer under laminær strømning panseret og sperre under UV-lys. Kultur medier: en 1:1 blanding av Ham er F12 og DMEM medier med 2,5 L-glutamin supplert med 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 0,3 mg/mL G418 og 10% fosterets Bovine Serum (FBS) (v/v) for menneskelige fosteret hFOB 1,19 SV40 store T antigen transfekterte osteoblasts og McCoys 5A medium med 1,5 mM L-glutamin supplert med 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin og 15% FBS (v/v) for menneskelig osteosarcoma Saos-2 celler.
  2. Kultur hFOB 1,19 cellene på 34 ° C i en atmosfære av 5% CO2 og Saos-2 på 37 ° C i en atmosfære av 5% CO2. Overføre cellekulturer, enten hFOB 1,19 eller Saos-2 celler, fra inkubator til laminær strømning panseret og endre mediet til 10 mL av fersk kultur medium med FBS.
  3. Inkuber celler uten stimulators (hvile celler) eller stimulere dem med 50 µg/mL askorbinsyre (AA) etterfulgt av 7,5 mM β-Glycerophosphate (β-GP), utarbeidet tidligere i ultrapure vann og filtrert gjennom 0.22 µm sprøyte filtre. Legg stimulators fra plast microcentrifuge rør på overflaten av kultur medium. Forsiktig rør kultur parabol og ruge i 7 dager.

2. påvisning av kalsium mineraler

  1. Vask cellekulturer med fosfat Buffer saltvann (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7.0).
  2. Legge til 5 mL på 2% (g:100 mL) AR-S i PBS, pH 5.0 og Inkuber platene i 30 min stain mineraler.
  3. Vask 3 ganger med PBS. Forsiktig legge til PBS parabolen veggen, prøv å ikke ødelegge mineraler.
  4. Observere kalsium mineraler under en invertert lys mikroskop og ta bilder.

3. visualisering av sonder under UV-lys

  1. For celle lysates, behandle cellekulturer, enten hviler eller stimulert for 7 dager, ifølge collagenase fordøyelsen protokollen24.
  2. Samle mediet fra cellekulturer og vask cellene med PBS.
  3. Fordøye cellene med 3 mL 500 U/mL collagenase i en løsning av 0,25 M sukrose, 0,12 M NaCl, 0,01 M KCl og 0.02 M Tris-HCl buffer, pH 7.45, på 37 ° C 3 h.
  4. Mekanisk skrape cellene, overføre dem til plast microcentrifuge rør og sende dem 10 ganger gjennom en 1 mL 40 U sprøyte med 0,5 × 16 p.
  5. Sentrifuge prøvene på 500 × g i 5 min.
  6. Forkast nedbryting og avbryte celle pellet 500 µL av syntetiske brusk lymfe (SCL, 100 mM NaCl, 12.7 mM KCl, 0.57 mM MgCl2, 1.83 mM NaHCO3, 0.57 mM NaH2PO4, 5,5 D-glukose, 63 mM sukrose, 16,5 mM Hepes, pH 7.4).
  7. Overføre hydroxyapatite (HA), fluorapatite (FA) og chlorapatite (CA) pulver fra flaskene på UV-transilluminator med en slikkepott og bruke som kontroller.
  8. Overføre celle lysates fra plast rør med plast tips og Legg nøye på UV-transilluminator.
  9. Ta bilder under synlig og UV lys.

4. forberedelse av sonder for TEM-EDX

  1. Utarbeidelse av mineraler for negative flekker
    1. Avbryte 2,5 mg syntetisk HA, CA og FA mineraler25 500 µL deionisert vann og ruge på 37 ° C i en atmosfære av 5% CO2 1t.
    2. Ta Formvar/karbon 300 Mesh Ni rutenett i boksen med antistatiske tang, plassere på en porselen flere godt tallerken og slippe 10 µL HA, CA og FA hjuloppheng på rutenettet.
    3. Tørr prøvene i 30 min ved romtemperatur.
  2. Utarbeidelse av hvile og stimuleres celler for innebygging 26
    1. Samle medium fra cellekulturer og vask cellene med fysiologiske Desensitization (PD) medium (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10 mM NaHCO3, 1 mM KH2PO410 mM glukose, 20 mM HEPES, pH 7.4).
    2. Fastsette cellene med 5 mL av en blanding av 3% (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL) glutaraldehyde i 100 mM natrium fosfatbuffer, pH 7.2, 1t ved romtemperatur under avtrekksvifte.
    3. Vask cellene med 5 mL til 100 mM natrium fosfat-bufferen og fjerner bufferen etter vask.
    4. Den mørke rommet, postfix prøvene med 2 mL 1% (g:100 mL) osmium tetroxide i 100 mM natrium fosfatbuffer, pH 7.2, for 20 min ved romtemperatur under avtrekksvifte.
    5. Fjern osmium tetroxide og bruke den.
    6. Vask cellene med 5 mL til 100 mM natrium fosfat-bufferen.
    7. Deretter tørke eksemplene i 5 mL dele en gradert etanol løsning serie ved romtemperatur: 25% (av vol.) i 5 minutter, 50% (av vol.) for 10 min, 75% (av vol.) i 15 min, 90% (av vol.) for 20 min. Til slutt bruker absolutt etanol to ganger og ruge for 30 min og 12 h.
    8. Mekanisk skrape cellene fra plast Petri kultur rettene, samle inn i plast microcentrifuge rør og sentrifuge prøvene 130 x g for 1 min.
    9. Fjerne supernatants og suspendere cellene i 1 mL av en blanding av LR hvitt harpiks og absolutt etanol i Volumforholdet 1:2.
    10. Bland godt innholdet i BILLEDRØR før bruk og ruge i 30 min ved romtemperatur.
    11. Sentrifuge prøvene 130 x g for 1 min.
    12. Gjenta forrige trinn bruker 1 mL av en 1:1 blanding av LR hvitt harpiks og absolutt etanol fjerne supernatants.
    13. Bland godt og ruge i 30 min ved romtemperatur.
    14. Sentrifuge prøvene 130 x g for 1 min.
    15. Fjerne supernatants.
    16. Endelig legge til 1 mL av ren LR hvitt harpiks prøvene to ganger og ruge 1t ved romtemperatur i plast rør.
    17. Plass 500 µL av hvert utvalg i gelatin kapsler.
      Merk: Prøvene er merket med en liten ark og en blyant slik at harpiks ikke ødelegge etikettene.
    18. Lukk gelatin kapsler, sette dem i plast microcentrifuge rør og sentrifuge 130 x g i 1 min i en swing-out rotor.
    19. Fjern kapsler fra plast rør ved hjelp av en vakuumpumpe.
    20. Flytt prøvene til ovnen og danner på 56 ° C i 48 timer.
    21. Klargjør blokkene ved å montere dem inn i holderen og trimming dem til pyramiden.
    22. Holderen inn i ultramicrotome, koble diamant Ultra 45° kniven og fylle den med deionisert vann. Husk å rengjøre bladet fra tilfeldige luftbobler.
    23. Deretter kuttet seksjoner (700 Å) med diamantkniven på deionisert vannbad.
    24. Angi rester benytter bovine øyenvippe og plassere dem på den blanke siden av Formvar/karbon 300 mesh Ni rutenett og tørkes.
    25. Forberede 2,5% (av bind) uranyl acetate på absolutt etanol i mørket under en avtrekksvifte. Hold uranyl acetate i ledelsen beholder og husk ikke å plukke opp sediment.
    26. Den mørke rommet, counterstain nett syntetiske direkte oversatt: apatitter og celle prøver med 2,5% (av bind) uranyl acetate på etanol for 20 min ved romtemperatur under avtrekksvifte.
    27. Vaske rutenettene i 50% etanol (ved vol.), deretter i deionisert vann og tørk ved romtemperatur for 24 timer. Til slutt satte rutenettene i boksen.

5. TEM-EDX analyse

  1. TEM bildebehandling av transmission elektron mikroskop (TEM) utstyrt med komplett utvalg energi dispersiv X-ray microanalysis (EDX) System og 11 Megapixel kamera
    1. Forberede en beryllium holder observasjon av mineraler og celler. Bruke antistatiske verktøy.
    2. Fjern to skruene og løft beryllium plate og beryllium skive fra resten av kuleholderen.
    3. Montere nettet, blanke siden, på holderen.
    4. Forsiktig plassere beryllium vaskemaskin og beryllium plate og skru festeskruene tett.
    5. Sett holderen inn i vakuum kammeret og aktivere vakuumpumpe.
    6. Når et vakuum er oppnådd, forsiktig holderen inn tenkelig kammeret og slå på bjelken.
    7. På fluorescerende skjermen, sette aperture parametre på mikroskopet. Utføre astigmatisme bildekorrigering; Angi zoom, fokus og rammen. og ta TEM bilder ved en forstørrelse på 50, 000 X.
  2. STEM bildebehandling og X-ray microanalysis for spectral og kompositoriske analyse
    1. Energi dispersiv X-ray (EDX) detektoren inn skanning overføring elektronmikroskop (STEM) tenkelig kammeret.
    2. Justere skarpheten på bildet i fokus modus.
    3. Tar STEM bilder på en forstørrelse 15 000 X.
    4. Velge et punkt i utvalget for X-ray microanalysis og samle spectra.
    5. Hente data ved å summere alle atomic vekter for alle elementer i periodesystemet i utvalget (som 100%) og viser innholdet i utvalgte elementer: Ca, F, Cl og P (som atomic %). Deretter beregne forholdstall på Ca, F eller Cl p for hvert utvalg.
  3. Ion kartlegging
    1. Velg elementer som kalsium, fluor, klor og fosfor ion kartlegging og utføre EDX kart av de valgte elementene i prøvene.
    2. Hente data ved å angi lokaliseringen av analysert elementer: Ca, F, Cl og P (som atomic %) og beregne den co lokaliseringen (i %) av Ca, F eller Cl med P for hvert utvalg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TEM-EDX tillater i vitro avbilding av matrix blemmer (MVs) utgitt av mineralizing celler og mineraler produsert av Mvs resultatene ved hjelp av denne teknikken viser at prosessen med mineralisering kan fortsette annerledes i ulike typer celler. De to linjene fikk samme osteoblastic transdifferentiation behandling, men stimulert Saos-2-celler mineralized mer effektivt enn hFOB 1,19 osteoblasts, noe som gjenspeiles av AR-S flekker (figur 2). Dette kan skyldes mer moden osteoblast fenotypen Saos-2 celler19 i forhold til hFOB 1,19 celler20. Visualisering av prøver ved å bruke en UV transilluminator gjort det klart at bare fluorapatites observert under UV-lys (Figur 3). TEM bilder indikerte at stimulert Saos-2-celler produserer mer blemmer som inneholder mineraler forhold til stimulert hFOB celler eller hvile Saos-2-celler (Figur 4, venstre og den midterste paneler). Syntetisk direkte oversatt: apatitter har forskjellige typer mineraler (Figur 4, høyre panel). TEM bildene viste tilstedeværelse av blemmer i hFOB 1,19 og Saos-2 celler under hvile og stimuleres forhold (figur 5, venstre panel). På EDX ion kart, røde punkter angir kalsium, grønne punkter Vis fosfor og blå poeng pek fluor-distribusjoner (figur 5, midtre panelet). Under stimulert forhold er det en sterk overlapping mellom kalsium og fosfor distribusjoner i blemmer produsert av Saos-2 celler og mellom fluor og fosfor i blemmer produsert av hFOB 1,19 celler (figur 5, høyre panel).

Figure 2
Figur 2 . AR-S farging av mineraler (rød) produsert av hFOB 1,19 (øvre panel) og Saos-2 (nedre panelet) celler enten hviler (R) eller etter 7 dager etter stimulering med AA og β-GP (S). Bar: 25 µm. Et vanlig resultat med n = 3 presenteres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Synlig (øvre panel) og UV (midten panel) lys visualisering av syntetiske HA, CA og FA mineraler og mineraler produsert av hFOB 1,19 (nedre venstre panel) og Saos-2 (nedre høyre panel) celler enten hviler (R) eller etter 7 dager etter stimulering med AA og β-GP (S) . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 4
Figur 4 . TEM bilder av blemmer og mineraler produsert av hFOB 1,19 (venstre panel) og Saos-2 (midten panel) celler enten hviler (R) eller etter 7 dager etter stimulering med AA og β-GP (S). Syntetisk HA, CA og FA mineraler vises som kontroller (høyre panel). Bar: hvit 500 nm, svart 250 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 5
Figur 5 . TEM bilder (venstre panel) av hFOB 1,19 og Saos-2 celler enten hviler (R) eller etter 7 dager etter stimulering med AA og β-GP (S). Ion kart for Ca (rød), Cl (gul), F (blå) og P (grønn) fra EDX (midten panel). Co lokalisering av elementer (høyre panel): kalsium til fosfor (Ca), fluor til fosfor (F) eller klor til fosfor (Cl) ble kvantifisert basert på EDX kartene. Bar: 500 nm. Tre uavhengige eksperimenter for begge linjer ble utført. Ti bilder fra hver variant (hvile og stimulert) ble tatt, og fra 2 til 6 av dem ble valgt for videre beregning av elementet co lokalisering. En typisk resultere er forevist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dagens papir, vi beskrev protokollene for AR-S flekker, UV lys identifikasjon av fluorapatite og TEM-EDX i vitro imaging MVs utgitt av mineralizing celler og mineraler produsert av MVs. Det er mulig å løse alle metodene ovenfor ved å følge noen felles feilsøkingstrinn. For å oppnå optimale resultater, skal flere viktige trinn utføres nøye. Først er det bedre å legge AA (som er surt) etterfulgt av β-GP (som er alkalisk) Hvis du vil beholde pH 7.4 i kultur medium. Andre, etter AR-S flekker, farget kalsium innskudd er svært skjøre og cellene skal vaskes med stor forsiktighet for å hindre ødeleggelse av krystallene ved å legge til PBS. Tredje, alltid holde uranyl acetate i ledelsen beholder og ikke plukke opp sediment fordi bare utvannet brøken skal brukes til å feste. Fjerde, husk at AA og uranyl acetate lysfølsom og skal håndteres i mørke rom. Femte, blandingen av LR hvit med absolutt etanol skal blandes godt før legges til prøvene. Sjette bør eksemplene i gelatin kapsler være merket med en liten ark og en blyant slik at harpiks ikke ødelegge etikettene. Syvende, blad av diamantkniven bør være omhyggelig renset fra eventuelle luftbobler. Åttende, prøver plasseres forsiktig på den blanke siden av rutenettet hvor Formvar/karbon filmen ligger. Niende plasser riktig punktet på som X-ray microanalysis og ion tilordningen utføres på TEM bilde å begrense mulige problemer med apatitt anerkjennelse.

Selv presentert protokollen viste seg for å være mest gunstig i våre eksperimentell design, er det mulig å endre det til å passe forskjellige mål. Som med alle andre teknikk, har dette også sine begrensninger. Flere teknikker, som FTIR, bør brukes for å bekrefte eller bekrefte eksistensen av innhentet forholdet mellom undersøkt elementer8,12,26. Metoden TEM-EDX presenteres her er en betydelig forbedring når det gjelder eksisterende metoden, som er en kombinasjon av mikro-Raman-baserte kartlegging og chemometric metoder og ligner avbilding av silver nanopartikler (AgNPs) distribusjon til ulike overflater av mineral og mekanismen av deres molekylære interaksjoner21. Raman-basert bildebehandling har blitt testet på to mineral modeller (makro og mikro-størrelse). Raman kart laget av n = 600-900 spectra for hver prøve/kontroll ble analysert av Vespucci programvare og resultatene ble bekreftet via andre metoder som ICP-OES, AFM og SEM-EDX. Våre TEM-EDX kart bestående av n = 30 rammer og n = 6 spectra for hver prøve/kontroll ble også analysert av Microanalysis Suite, og resultatene var bekreftet via andre metoder som FTIR, FM, TEM, SPM og 3D topografiske AFM4 , 5. den foreslåtte TEM-EDX-microanalysis, som Raman-basert avbildning, krever bare minimum eksempel forberedelse, super følsom, ikke-invasiv og kostnadseffektiv og utvides til andre systemer som er relevante for det menneskelige miljøet.

Presentert teknikken kan brukes i et bredt felt av forskning i fremtiden. Det kan endres for etterforskningen av forskjellige naturlige og syntetiske direkte oversatt: apatitter. Det kan også justeres for å passe protokoller av eksperimenter med biologiske og kjemiske sonder. Videre kan alle elementene fra periodesystemet analyseres for å visualisere ikke bare morfologi av mineraler, men også endringer i deres ion sammensetning og erstatninger. Ionebytte i direkte oversatt: apatitter er en kjent prosedyre for biomedisinsk programmet27. En mulig fysiologiske faktor som styrer den Ca, F og Cl ioner Sr, Mg, Mn og Zn metall ion erstatning i HA under mineral-formasjonen, som er et vendepunkt mellom fysiologiske og patologiske mineralisering, kan Pjeg/PPi forholdet7. Hvis brukt riktig, gir denne teknikk utfører tilordningen av flere elementer av samme mobilnettet, vesicula eller mineral område flere ganger på rad.

I de siste årene gjort mye fremgang om mekanismer av bein mineralisering28,29,30,31,32,33. Vi innså at forskjellige linjer kan ha forskjellige profiler av blemmer og mineral formasjon. I denne forbindelse, valgte vi to humane cellelinjer: osteoblastic hFOB 1,19 og osteosarcoma Saos-2, som gjennomgår fullføre osteogenic transdifferentiation fra spredning til mineralisering og lage MVs som utløser apatitt nucleation i ECM 34 , 35.

AR-S farging av kalsium innskudd avslørte at stimulert Saos-2-celler mineralized annerledes enn hFOB 1,19 osteoblasts. Dette var korrelert med Minerallproduksjonen av Saos-2-celler som var undetectable under UV-lys i motsetning til de som produseres av hFOB 1,19 celler. Våre TEM-EDX data viste at mineraler produsert i blemmer av Saos-2 celler var lik syntetiske HA på grunn av overlappingen i kalsium og fosfor distribusjoner. Derimot angitt overlappingen i fluor og fosfor distribusjoner i blemmer fra hFOB 1,19 celler dannelsen av andre typer mineraler i tillegg til direkte oversatt: apatitter.

Avslutningsvis viser våre funn at blemmer er viktige determinanter av mineral nucleation, spesielt på mobilnettet nivå5,25. Videre er våre data med en tidligere teori at MVs kan betraktes som en spesialisert form for microvesicles som kan starte mineralisering innenfor og utenfor cellen4. Sammenligning av blemmer løslatt fra Saos-2 celler, som mineralize mer effektivt, og blemmer løslatt fra hFOB 1,19 celler ved hjelp av metoden TEM-EDX microanalytical støtter hypotesen at MVs er mineral-fylte blemmer. Dette etterlater åpne spørsmålet om tilstedeværelsen av MVs er nødvendig å indusere apatitt nucleation, og hvordan dette kan endre fysiologisk til patologisk mineralisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

MK og ASK utført manuell operasjoner og LB forberedt tegninger og laget filmen. ASK skrev manuskriptet, LB skrev manuset og MK forberedt tabellen. SM, RB og SP lese kritisk tabellen, skriptet og manuskriptet. Forfatterne vil gjerne takke Hanna Chomontowska for henne utmerket hjelp med ultramicrotomy samt Szymon Suski og Henryk Bilski for deres gode hjelp med TEM-EDX analyse. Forfatterne vil gjerne takke Dr. Patrick engelskspråklig korreksjon og Barbara Sobiak for opptak instruksjonene.

Dette arbeidet ble støttet av grant N N401 140639 fra polsk departementet for vitenskap og høyere utdanning til ASK, av tilskudd fra National Science Centre, Polen 2016/23/N/NZ4/03313 LB og 2016/23/N/NZ1/02449 til MK, EU FP7 prosjektet BIOIMAGINE : BIO-IMAGing forskning innovasjon og utdanning, GA nr. 264173, og av lovbestemte midlene av den Nencki Institutt for eksperimentell biologi, polske vitenskapsakademi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture PAA E15-813 1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium PAA E82312-0025 for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin) Sigma P0781-100ML 100 U/mL each
G-418 Sigma 68168 0.3 mg/mL
FBS Gibco 10270 10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA Sigma A-5960 50 µg/mL
ß-GP Sigma G9422-100G 7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel Bio-Rad 130-0420 for HA
FA synthesized by us
CA synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture Sigma S7907/S8282 0.1 M, pH 7.2
PBS pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS Sigma A5533-25G 0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA Sigma C2674 500 U/mL
SCL buffer prepared by us
Deionized wather produced by us
Ethanol POCh BA6480111 absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol Polysciences Inc. 21447-25 0.25 g/10 mL
PD medium pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde) Sigma 158127/G-6257 3%:1%
Post-fixation OsO4 Sigma 75633 1%
LR White resin in ethanol Polysciences Inc. 17411-MUNC 500g 1:2, 1:1, 100%
Acetone CHEMPUR 111024800 pure
Tool
Cryogenic vials Corning Inc. 430487 1.2 mL
Plastic Petri culture dishes Falcon 353003 100 mm
Plastic tubes Falcon 352096 and 352070 15 and 50 mL
Serological pipettes Falcon and VWR 357521 and 612-3700 1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes Sigma Z688312 and Z628034 1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips VWR 613-0364, 613-0239 and 613-1050 0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks Light Labs A-7055-Z, A-7053-C green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save Thermo Scientific Co. KS12 HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell Thermo Scientific Co. 150 34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood POLON WCS-2 for TEM stainings
Glass bottles SIMAX 1632414501050 and 1632414501100 50 and 100 mL
Quartz glass tubes SIMAX 638422010100 Ø 10 mm, L 100 mm
Pump IBS Integra Biosciences VACUSAFE comfort for vacuum
Oven Memmert UNE 400 56°C
Porcelain multi-well plate Rosenthal technik 229/12 12 wells
Glass beakers SIMAX 632417010025 25 mL
Glass bottles Pocord DIN22 10 mL
Plastic box Agar Scientific Ltd. for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules Agar Scientific Ltd. G3741 size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box Agar Scientific Ltd. S162N3 film on the shiny side
Silicon cell scraper Sigma SIAL0010-100EA size 1.8/25 cm
Syringe with needle BogMark 007 syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe Chirana CH005L 5 mL
Centrifuge MPW Medical Instruments MPW-350R 130 x g and 500 x g
UV transluminator UVP M-20 for visible and UV light
Ultramicrotome LKB NOVA 700Å sections
Block holder LKB E6711 round shape
Diamond knife DiATOME Ultra 45° size 3
Eyelash holder bovine, prepared by us
Forceps ROTH 2855.1 antistatic for grids
Spatulas set ROTH E286.1 antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope Zeiss with Canon AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9 Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses Nikon Nikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D 		for movie recordings
Microphone MXL Mics Tempo for voice recordings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
  2. Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
  3. Anderson, H. C. Matrix vesicles and calcification. Curr Rheumatol. 5 (3), 222-226 (2003).
  4. Bolean, M., Simão, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Millán, J. L., Ciancaglini, P. Biophysical aspects of biomineralization. Biophys Rev. 9 (5), 747-760 (2017).
  5. Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Simão, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Millán, J. L., Buchet, R. Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 532-546 (2018).
  6. Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (14), 9445-9449 (2002).
  7. Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study. Bone. 38 (6), 811-817 (2006).
  8. Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles. Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).
  9. Terkeltaub, R. A. Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology. Am. J. Phys. 281 (1), 1-11 (2001).
  10. Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification. Bone. 27 (1), 69-74 (2000).
  11. Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Millán, J. L. Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice. J. Bone Miner. Res. 31 (6), 1275-1286 (2016).
  12. Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells. J. Proteome. 74 (7), 1123-1134 (2011).
  13. Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis. J. Biol. Chem. 278 (6), 3762-3769 (2003).
  14. Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis. Autophagy. 10 (11), 1965-1977 (2014).
  15. Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 14170-14175 (2012).
  16. Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine. J. Biol. Chem. 282 (36), 26035-26045 (2007).
  17. Jahnen-Dechent, W., Schäfer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification. J. Mol. Med. (Berl). 86 (4), 379-389 (2008).
  18. Suchanek, W., Yoshimura, M. Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants. J. Miner. Res. 13 (1), 94-117 (1998).
  19. Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts. Anticancer Res. 24 (6), 3743-3748 (2004).
  20. Yen, M. -L., Chien, C. -C., Chiu, I. -M., Huang, H. -I., Chen, Y. -C., Hu, H. -I., Yen, B. L. Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors. Stem Cells. 25 (1), 125-131 (2007).
  21. Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces. Environ Sci Technol. , (2018).
  22. Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO. Chemosphere. 196, 566-574 (2018).
  23. Tasbihi, M., Kočì, K., Troppová, I., Edelmannová, M., Reli, M., Čapek, L., Schomäcker, R. Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts. Environ Sci Pollut Res Int. , (2017).
  24. Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells. J. Bone Miner. Res. 23 (11), 1798-1805 (2008).
  25. Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization. J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).
  26. Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. Matrix vesicles originate from apical membranę microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells. J. Cell. Biochem. 106 (1), 127-138 (2009).
  27. Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. Ion exchanges in apatites for biomedical application. J. Mater. Sci. Mater. Med. 16 (5), 405-409 (2005).
  28. Kraus, D. Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel® spreadsheet software. Med. Writ. 23 (1), 25-28 (2014).
  29. Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).
  30. Bonucci, E. Bone mineralization. Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).
  31. Veis, A., Dorvee, J. R. Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices. Calcif. Tissue Int. 93 (4), 307-315 (2013).
  32. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. J. Struct. Biol. 183 (2), 258-269 (2013).
  33. Alliston, T. Biological regulation of bone quality. Curr. Osteoporos. Rep. 12 (3), 366-375 (2014).
  34. Wang, W., Kirsch, T. Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization. J. Cell Biol. 157 (6), 1061-1069 (2002).
  35. Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes. Exp. Cell Res. 305 (1), 156-165 (2005).

Tags

Kjemi problemet 136 mineraler blemmer osteoblasts osteosarcoma UV lys TEM-EDX
Analyse av mineraler produsert av hFOB 1,19 og Saos-2 celler ved hjelp av overføring elektronmikroskop med energi dispersiv X-ray Microanalysis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek,… More

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter