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Chemistry

Análisis de minerales producidos por hFOB 1.19 y Saos-2 células usando la microscopia electrónica transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía

Published: June 24, 2018 doi: 10.3791/57423
Automatic Translation
1, 1, 2,3,4,5,6, 2,3,4,5,6, 1, 1
1Laboratory of Lipid Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences, 2Université de Lyon, 3Université Lyon 1, 4L'insitut National des Sciences Appliquées (INSA) de Lyon, 5Ecole Supérieure de Chimie Physique Electronique (CPE) Lyon, 6Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Unité Mixte de Recherche (UMR), L'institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires (ICBMS)

Summary

Presentamos un protocolo para comparar el estado de los minerales en vesículas por dos líneas de células de hueso humano: hFOB 1.19 y Saos-2. Sus perfiles de mineralización fueron analizados por alizarina rojo-S (AR-S) coloración, visualización luz de ultravioleta (UV), la proyección de imagen de microscopía electrónica (TEM) transmisión y microanálisis por energía dispersiva por rayos x (EDX).

Abstract

Este video presenta el uso de microscopía electrónica de transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía (TEM-EDX) para comparar el estado de los minerales en vesículas por dos líneas de células de hueso humano: hFOB 1.19 y Saos-2. Estas líneas celulares, después del tratamiento con ácido ascórbico (AA) y β-glicerofosfato (β-GP), experimentar transdifferentiation osteogénico completado de proliferación a la mineralización y producen vesículas de matriz (MVs) que provocan la nucleación de apatita en la matriz extracelular (ECM).

Basado en la tinción de rojo de alizarina-S (AR-S) y análisis de la composición de minerales en los lysates de la célula con luz ultravioleta (UV) o en vesículas usando proyección de imagen de TEM seguido por EDX cuantificación y mapeo de ion, podemos inferir que el osteosarcoma Saos-2 y osteoblástica las células hFOB 1.19 revelan perfiles de mineralización distinta. Las células SAOS-2 mineralizar más eficientemente que las células hFOB 1.19 y producen depósitos minerales más grandes que no son visibles bajo luz UV, pero son similares a la hidroxiapatita (HA) en que tienen sustituciones más Ca y F.

Los resultados obtenidos con estas técnicas nos permiten concluir que el proceso de mineralización es diferente dependiendo del tipo de célula. Proponemos que, a nivel celular, el origen y las propiedades de las vesículas predeterminan el tipo de minerales.

Introduction

El hueso es un tipo de tejido conectivo compuesto de dos partes: orgánica (células y fibras de colágeno) y minerales (compuestos de calcio y fosfato). Los principales componentes minerales en los huesos son apatitas1. Diferentes tipos de células competentes de mineralización en el hueso (osteoblastos), dientes (odontoblastos) y cartílago (condrocitos) regulan los pasos iniciales de mineralización produciendo proteínas de la matriz extracelular (ECM) y liberación de matriz vesículas (MVs) (figura 1). MVs son vesículas de 100 a 300 nm de diámetro que acumulan calcio y fosfato facilita la nucleación de apatita y posteriormente se unen al colágeno2,3. Entonces, MVs se desintegran para liberar apatitas al medio extracelular. Las apatitas continúan creciendo en contacto con las fibras de colágeno y forman la matriz ósea. La mineralización es sostenida por el suministro constante de P y Ca2 + en el medio extracelular. Algunos datos publicados recientemente apoyan nuestro modelo4,5. Los tejidos blandos no mineralizarse bajo condiciones fisiológicas. Sin embargo, la calcificación ectópica puede ocurrir en condiciones patológicas tales como calcificación vascular3. Las células vasculares que adquieren el fenotipo de osteoblastos pueden producir MVs que inducen la nucleación de apatitas e inician la mineralización en las capas íntimas y mediales de la pared de los vasos sanguíneos. Desde calcificación ectópica se asemejan a endocondral normal mineralización3, entender los mecanismos moleculares de la mineralización de las células óseas y condrocitos deben proporcionar algunas pistas sobre la calcificación ectópica de los tejidos blandos que son formado.

El desarrollo de tejidos esqueléticos está regulado por diversas enzimas, factores de crecimiento y promotores o inhibidores de la mineralización. La acción antagónica de la fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNAP) (figura 1) y ectonucleotide pirofosfatasa/fosfodiesterasa I (NPP1), junto con ankyrin (ANK), controla la concentración de pirofosfato inorgánico (PP) 6. PP, un potente inhibidor de la formación de HA, es hidrolizado por TNAP; NPP1 hidroliza trifosfatos de nucleótidos para formar PP mientras ANK las exportaciones de PP de la célula al ECM. La proporción Pi/PPi puede regular la formación de apatita7,8 con posibles consecuencias patológicas9.

La membrana de MV se enriquece en proteínas de transporte de iones que facilitan la precipitación inicial de calcio y fosfato en el MVs durante el proceso de nucleación (figura 1). El transportador de fosfato 1 (hoyo) ayuda a incorporar P genera en el espacio perivesicular en la MVs10,11. Anexinas pueden estar implicado en el atascamiento y el transporte de Ca2 + y en el proceso biofísico que inicia la mineralización en el MV lumen12,13. Privilegiamos la hipótesis, sugerida anteriormente, para la mineralización dentro de vesículas intracitoplasmáticas de nucleación interna de apatita dentro de la MV antes de su propagación en el ECM14,15. Modelado in vitro confirmaron la inducción de la Ca2 +/P complejos formación en proteoliposomes de PS y AnxA516. Esto puede indicar que la acumulación de Ca2 +, P, complejos AnxA5 y PS en las balsas lipídicas de las microvellosidades-como membranesrepresent el núcleo nucleación (NC) de apatita dentro de Mvs anexinas y TNAP también poseen colágeno vinculante capacidades que pueden ayudar en la colocación de MVs a lo largo de las fibras de colágeno y en estimular la propagación de la mineralización en el ECM. Fetuin A y17de la osteopontina (OPN), son conocidos como inhibidores de la formación de apatita que puede ralentizar la propagación de la mineralización en el andamio colagenosa. Nucleación y propagación son eventos distintos, el primero anterior a éste, y ambos pueden ser relevantes para el proceso de mineralización patológica.

Para descubrir cómo puede cambiar la química de complejos de fosfato de calcio calcificación ectópica y mineralización fisiológica, es necesario identificar los minerales producidos por las células. Apatitas son un grupo de calcio y fosfato que contiene minerales con el cristal general unidad celular fórmula Ca10(PO4)6X2, donde X = Cl, F, OH. Se clasifican de la siguiente manera18: Fluorapatito (FA) Ca10(PO4)6F2y chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 de hidroxiapatita (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.

La elección de las líneas celulares de osteoblastos para inducir la formación de minerales es crucial, puesto que cada línea celular exhibe un perfil distinto de mineralización. En este informe, en comparación con la nucleación de minerales por dos modelos de células humanas las de mineralización: células osteoblásticas hFOB 1.19 y células de osteosarcoma Saos-2. Las células derivadas de osteosarcoma se utilizan comúnmente como modelos osteoblásticos y células Saos-2 conservan la más madura de carácter osteoblástico19 mientras que las células indiferenciadas hFOB fetal humano son ampliamente utilizadas como modelo para osteoblástica normal diferenciación20. Sus perfiles de mineralización se analizaron mediante diferentes métodos: tinción rojo de alizarina-S (AR-S), ULTRAVIOLETA (UV) luz la visualización, la proyección de imagen de microscopía electrónica (TEM) transmisión, cuantificación de microanálisis (EDX) de rayos x dispersivo energía y ion asignación. La ventaja de TEM-EDX sobre alternativas técnicas utilizadas en estudios previos es que da resultados cuantitativos y cualitativos de la sustitución de iones en cristales de apatita4,5,21. El objetivo de utilizar las TEM-EDX era encontrar un método simple para la proyección de imagen y cuantificación de la distribución de los iones Ca, F y Cl en varios minerales de diferentes tipos de células en distintas etapas del proceso de mineralización. Este método ha sido utilizado con éxito, por ejemplo, para monitorear la interacción de las nanopartículas de zinc con productos químicos coexistentes y sus combinados efectos en organismos acuáticos22. En otro estudio, un fotocatalizador cobre en materiales de titanio en solución acuosa se caracterizó ampliamente por medio de espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES), N2 physisorption (BET), DRX, DRS de UV-vis, FT-IR, Raman Espectroscopia, TEM-EDX y fotoelectroquímicos medidas23. Nuestro objetivo fue comparar el origen y las propiedades de las vesículas y los minerales en dos líneas celulares para entender el mecanismo que controla la mineralización durante la diferenciación ósea.

Figure 1
Figura 1 . Esquema de los pasos iniciales de la mineralización en las células óseas que implican la síntesis de proteínas de matriz extracelular (ECM) y liberación de vesículas de la matriz (MVs) de la membrana. MVs acumulan calcio a través de la acción de proteínas calcio, anexinas y fosfato, a través de la acción de un transportador de fosfato inorgánico (PiT) seguido por la actividad de tejido no-fosfatasa alcalina específica (TNAP), que desfosforila PP a P, facilitando así el nucleation de la apatita. Entonces, MVs se desintegren y liberen apatitas al medio extracelular. La mineralización es sostenida por el suministro constante de P y Ca2 + en el medio extracelular4,5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

1. la cultura y el tratamiento de la célula

  1. Poner todos los materiales necesarios bajo la campana de flujo laminar y esterilización bajo luz UV. Los medios de cultivo son: una mezcla 1:1 del jamón de medios F12 y DMEM con 2,5 mM L-glutamina suplementada con 100 U/mL de penicilina, 100 estreptomicina U/mL 0.3 mg/mL G418 y 10% suero bovino Fetal (FBS) (v/v) para antígeno de T grande de SV40 feto humano hFOB 1.19 transfectadas osteoblastos y medio de McCoy 5A 1,5 mM L-glutamina suplementada con 100 U/mL de penicilina, 100 estreptomicina U/mL y 15% FBS (v/v) para las células de osteosarcoma humano Saos-2.
  2. La cultura hFOB 1.19 células a 34 ° C en una atmósfera de 5% CO2 y células Saos-2 a 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2. Cultivos de células, o células de 1.19 o Saos-2 hFOB, la transferencia desde la incubadora a la campana de flujo laminar y cambiar el medio a 10 mL de medio de cultivo fresco con FBS.
  3. Incube las células sin estimuladores (las células de reclinación) o estimular con 50 μg/mL de ácido ascórbico (AA) seguido por 7.5 mM β-glicerofosfato (β-GP), preparado en agua ultrapura y filtrada a través de filtros de la jeringuilla de 0,22 μm. Añadir los estimuladores de los tubos de microcentrífuga de plástico sobre la superficie del medio de cultivo. Suavemente Remueva la placa de cultivo e incubar durante 7 días.

2. detección de minerales de calcio

  1. Lavar los cultivos celulares con tampón fosfato salino (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM de Na2HPO4, 1 m m KH2PO4, pH 7.0).
  2. Añadir 5 mL de 2% (g:100 mL) AR-S en PBS, pH 5.0 e incubar las placas durante 30 min a los minerales de la mancha.
  3. Lavar 3 veces con PBS. Cuidadosamente añadir PBS a la pared del plato, tratar de no destruir los minerales.
  4. Observar minerales calcio bajo un microscopio de luz invertido y tomar imágenes.

3. visualización de sondas bajo luz UV

  1. Para lysates de la célula, tratamiento de cultivos celulares, ya sea descansando o estimulado por 7 días, según la colagenasa digestión protocolo24.
  2. Reunir el medio de cultivos celulares y lavan las células con PBS.
  3. Digerir las células con 3 mL de 500 colagenasa U/mL en una solución de 0.25 M sacarosa, 0.12 M de NaCl, 0.01 M KCl y 0.02 M Tris-HCl buffer, pH 7,45, a 37 ° C durante 3 horas.
  4. Mecánicamente raspar las células transferirlas a tubos de microcentrífuga de plástico y pasar 10 veces a través de una jeringa de U 1 mL 40 0,5 × 16 aguja.
  5. Centrifugar las muestras a 500 x g durante 5 minutos.
  6. Deseche el sobrenadante y suspender el sedimento celular en 500 μl de la linfa de cartílago sintético (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1,83 mM NaHCO3, 0,57 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glucosa, sacarosa de 63 mM, 16,5 mM Hepes, pH 7,4).
  7. Transferencia de la hidroxiapatita (HA), Fluorapatito (FA) y polvos chlorapatite (CA) de las botellas en el transiluminador de UV con una espátula y utilizar como controles.
  8. Transferir los lysates de la célula de los tubos de plástico con puntas de plástico y coloque cuidadosamente sobre el transiluminador de UV.
  9. Tomar imágenes en el visible y UV luz.

4. preparación de sondas de TEM-EDX

  1. Preparación de minerales para la tinción negativa
    1. Suspender 2,5 mg de sintéticamente producido HA, CA y FA minerales25 en 500 μl de agua desionizada e incubar a 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2 para 1 h.
    2. Toma rejillas de Formvar carbón 300 malla Ni de la caja con pinzas antiestáticas, coloque en un Platón de varios pocillos de porcelana y colocar 10 μl de las suspensiones HA, CA y FA en las rejillas.
    3. Secar las muestras durante 30 min a temperatura ambiente.
  2. Preparación de la reclinación y estimula las células para empotrar 26
    1. Recoger medio de los cultivos celulares y lavan las células con el medio fisiológico desensibilización (PD) (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10 mM NaHCO3, 1 mM KH2PO4, glucosa 10 mM, 20 mM HEPES, pH 7,4).
    2. Fijar las células con 5 mL de una mezcla de glutaraldehído de paraformaldehyde/1% (g:100 mL) (mL g:100) de 3% en tampón de fosfato de sodio de 100 mM, pH 7.2, por 1 h a temperatura ambiente bajo la campana.
    3. Lavar las células con 5 mL de tampón de fosfato de sodio 100 mM y retire suavemente el buffer después del lavado.
    4. En el cuarto oscuro, postfix las muestras con 2 mL de tetróxido de osmio 1% (g:100 mL) en tampón de fosfato de sodio de 100 mM, pH 7.2, por 20 min a temperatura ambiente bajo la campana.
    5. Retire el tetróxido de osmio y utilizarlo.
    6. Lavar las células con 5 mL de 100 mM de tampón fosfato de sodio.
    7. Entonces, deshidratan las muestras en alícuotas de 5 mL de una serie de solución de etanol gradual en la temperatura ambiente: 25% (vol.) por 5 min, 50% (por volumen) por 10 min, 75% (por volumen) durante 15 min., 90% (en volumen) por 20 min. Finalmente utilizar etanol absoluto dos veces e incubar durante 30 min y 12 h.
    8. Mecánicamente raspar las células de los platos de cultura de Petri plásticos, recoger en tubos de microcentrífuga de plástico y centrifugar las muestras a 130 x g durante 1 minuto.
    9. Eliminar el sobrenadante y suspender las células en 1 mL de una mezcla de la resina LR White y etanol absoluto en una proporción de volumen de 1:2.
    10. Mezclar bien el contenido de los tubos de vidrio antes de su uso e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
    11. Centrifugar las muestras a 130 x g durante 1 minuto.
    12. Eliminar el sobrenadante y repetir el paso anterior con 1 mL de una mezcla 1:1 de resina LR White y etanol absoluto.
    13. Mezclar bien e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
    14. Centrifugar las muestras a 130 x g durante 1 minuto.
    15. Eliminar el sobrenadante.
    16. Finalmente, añadir 1 mL de resina pura LR White a las muestras dos veces e incubar durante 1 h a temperatura ambiente en tubos de plástico.
    17. Coloque 500 μl de cada muestra en cápsulas de gelatina.
      Nota: Las muestras se etiquetan usando una pequeña hoja de papel y un lápiz para que la resina no destruya las etiquetas.
    18. Cierre de las cápsulas de gelatina, poner en los tubos de microcentrífuga de plástico y centrifugar a 130 x g durante 1 min en un rotor de salida.
    19. Retire las cápsulas de los tubos de plástico con una bomba de vacío.
    20. Mover las muestras en el horno y polimerizar a 56 ° C durante 48 h.
    21. Preparar los bloques de montaje en el soporte y ajuste a la pirámide.
    22. Poner el soporte en el ultramicrótomo, coloque el cuchillo del diamante Ultra 45° y llenar con agua desionizada; no olvide limpiar la lámina de burbujas incidentales.
    23. Luego cortar secciones (700 Å) usando el cuchillo del diamante en el baño de agua desionizada.
    24. Fijar los trozos utilizando pestañas bovina y el lugar en el lado brillante del carbón/Formvar 300 malla rejilla Ni y séquelos.
    25. Preparación de acetato de uranilo de 2.5% (por volumen) en etanol absoluto en la oscuridad bajo una campana de humos. Mantenga el acetato de uranilo en un recipiente de plomo y no olvide recoger el sedimento.
    26. En el cuarto oscuro, contratinción las rejillas de las apatitas sintéticas y muestras de células con acetato de uranilo de 2.5% (por volumen) de etanol por 20 min a temperatura ambiente bajo la campana.
    27. Lave las rejillas en etanol 50% (por volumen), luego en agua desionizada y secar a temperatura ambiente durante 24 h. Por último, poner las rejillas en la caja.

5. TEM-EDX análisis

  1. Proyección de imagen de TEM de un microscopio electrónico de transmisión (TEM) equipado con microanálisis de energía dispersiva de rayos x de gama completa (EDX) sistema y 11 megapíxeles cámara
    1. Preparar un soporte de berilio para la observación de células y minerales. Utilice herramientas antiestáticas.
    2. Quitar el par de tornillos y levante la placa de berilio y berilio arandela lejos del resto del retenedor.
    3. Monte el grid, el lado brillante hacia arriba, en el soporte.
    4. Con cuidado coloque la arandela de berilio y berilio placa y atornille firmemente los tornillos de fijación.
    5. Poner el soporte en la cámara de vacío y encienda la bomba de vacío.
    6. Una vez que se consigue un vacío, suavemente inserte el soporte en la cámara de proyección de imagen y gire en la viga.
    7. En la pantalla fluorescente, configure los parámetros de la abertura del microscopio. Realizar la corrección de astigmatismo la imagen; establecer el zoom, enfoque y marco; y tomar imágenes TEM en un aumento de 50, 000 X.
  2. Proyección de imagen de madre y microanálisis de rayos x para análisis espectral y composición
    1. Insertar el detector de energía dispersiva por rayos x (EDX) en la cámara imágenes de la microscopia electrónica (STEM) exploración de transmisión.
    2. Ajustar la nitidez de la imagen en el modo de enfoque.
    3. Tomar imágenes de la madre en un aumento de 15, 000 X.
    4. Seleccione un punto en la muestra para el microanálisis de rayos x y recoger los espectros.
    5. Obtener datos por la suma de los pesos atómicos de todos los elementos de la tabla periódica en la muestra (como 100%) y lo que significa el contenido de elementos seleccionados: Ca, Cl, F y P (% atómico). A continuación, calcular los ratios de Ca, F o Cl p para cada muestra.
  3. Asignación de ion
    1. Seleccionar elementos como el calcio, flúor, cloro y fósforo para hacer mapeo de ion y realizar mapas de EDX de los elementos seleccionados en las muestras.
    2. Obtener datos indicando la localización de los elementos analizados: Ca, Cl, F y P (% atómico) y calcular la co-localización (en %) de Ca, F o Cl p para cada muestra.

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Representative Results

TEM-EDX permite el en vitro la proyección de imagen de vesículas de la matriz (MVs) lanzadas por mineralización de las células y de los minerales producidos por Mfrente a los resultados obtenidos con esta técnica demuestran que el proceso de mineralización puede proceder de manera diferente en varios tipos de células. Las líneas dos celulares recibieron el mismo tratamiento de transdiferenciación osteoblástica, pero estimulada células Saos-2 más eficientemente que hFOB mineralización 1,19 osteoblastos, evidenciada por AR-S tinción (figura 2). Esto puede ser debido el fenotipo de osteoblastos más maduro de células Saos-219 en comparación con las células de hFOB 1.1920. La visualización de las muestras utilizando un transiluminador UV hizo claro que sólo fluorapatites se puede observar bajo luz ultravioleta (figura 3). Imágenes TEM indican que estimula las células Saos-2 producen más vesículas que contienen minerales en comparación con las células estimuladas hFOB o con reposo de células Saos-2 (figura 4, los paneles izquierdos y medios). Apatitas sintéticas tienen diversas formas de minerales (figura 4, panel derecho). Imágenes de TEM demostraron la presencia de vesículas en hFOB 1.19 y Saos-2 células en reposo y estimulado condiciones (figura 5, panel a la izquierda). En EDX ion mapas, puntos rojos indican calcio, puntos verdes muestran fósforo y puntos azules señalan las distribuciones de flúor (figura 5, panel central). Estimuladas en condiciones, hay una fuerte superposición entre las distribuciones de calcio y fósforo en vesículas de células Saos-2 y entre el flúor y el fósforo en las vesículas producidas por células hFOB 1.19 (figura 5, panel derecho).

Figure 2
Figura 2 . AR-S manchas de minerales (rojo) producción por hFOB 1.19 (panel superior) y células de Saos-2 (panel inferior) o reposo (R) o después de 7 días de estimulación con AA y β-GP (S). Bar: 25 μm. Un resultado típico con n = 3 se presenta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Visible (panel superior) y visualización de luz UV (panel central) de minerales HA, CA y FA sintéticos y minerales producida por hFOB 1.19 (panel izquierdo inferior) y células de Saos-2 (panel derecho inferior) o reposo (R) o después de 7 días de estimulación con AA y β-GP (S) . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 4
Figura 4 . TEM imágenes de vesículas y minerales producción por hFOB 1.19 (panel izquierdo) y Saos-2 (panel central) de las células o reposo (R) o después de 7 días de estimulación con AA y β-GP (S). Minerales sintéticos de HA, CA y FA se muestran como controles (panel derecho). Bar: blanco 500 nm, negro 250 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 5
Figura 5 . Imágenes de TEM (panel izquierdo) de hFOB 1.19 y Saos-2 células o reposo (R) o después de 7 días de estimulación con AA y β-GP (S). Mapas de ion para Ca (rojo), Cl (amarillo), F (azul) y P (verde) de EDX (panel central). Co-localización de elementos (panel derecho): calcio fósforo (Ca), flúor al fósforo (F), o cloro al fósforo (Cl) se cuantificó basado en los mapas EDX. Bar: 500 nm. Se realizaron tres experimentos independientes para ambas líneas celulares. Diez fotografías de cada variante (reposo y estimulado) se tomaron luego de 2 a 6 de ellos fueron seleccionados para otro cálculo de co-localización de elemento. Se presenta un resultado típico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

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Discussion

En el documento actual, describen los protocolos para AR-S coloración, identificación de luz UV de Fluorapatito y TEM-EDX en vitro la proyección de imagen de MVs por mineralización de las células y de los minerales producidos por MVs. Es posible tratar todos los métodos mencionados siguiendo algunos pasos de solución de problemas comunes. Para obtener resultados óptimos, deben realizarse varios pasos críticos cuidadosamente. En primer lugar, es mejor añadir AA (que es ácido) seguida por β-GP (que es alcalino) para conservar el pH 7.4 de medio de cultivo. En segundo lugar, después de AR-S coloración, los depósitos de calcio manchadas son muy frágiles y las células se deben lavar con mucho cuidado para evitar la destrucción de los cristales al añadir PBS. En tercer lugar, mantenga siempre el acetato de uranilo en un recipiente de plomo y no recoger el sedimento porque sólo la fracción diluida debe usarse para la fijación. En cuarto lugar, recuerda que AA y uranilo acetato son sensibles a la luz y debe ser tratada en el cuarto oscuro. En quinto lugar, la mezcla de blanco de LR con etanol absoluto debe mezclarse bien antes de ser añadido a las muestras. En sexto lugar, las muestras en cápsulas de gelatina deben ser etiquetado usando una pequeña hoja de papel y un lápiz para que la resina no destruya las etiquetas. Séptimo, la hoja de la cuchilla de diamante debe limpiarse cuidadosamente de posibles burbujas de aire. Octavo, las muestras deben colocarse con cautela en el lado brillante de la red donde se encuentra la película de carbón/Formvar. Noveno, colocar correctamente el punto en que microanálisis de la radiografía y el ion mapeo se realiza en la imagen TEM para limitar posibles problemas con el reconocimiento de la apatita.

Aunque el protocolo presentado resultó más favorable en nuestro diseño experimental, es posible modificarla para adaptarse a diferentes objetivos. Como con cualquier otra técnica, éste también tiene sus limitaciones. Técnicas adicionales, como FTIR, deben aplicarse para confirmar o verificar la existencia de la relación obtenida de los elementos examinados8,12,26. El método de TEM-EDX presentado aquí es una mejora significativa en relación con el método existente, que es una combinación de métodos de mapeo y quimiométricas basada en micro-Raman y es similar a la imagen de la distribución de nanopartículas de plata (AgNPs) a varios superficies de los minerales y el mecanismo de sus interacciones moleculares21. Proyección de imagen de Raman-base ha sido probado en dos modelos de minerales (macro y micro-medianos). Mapas de Raman de n = 600-900 espectros para cada muestra y control se analizaron mediante el software de Vespucci y los resultados fueron confirmados por otros métodos tales como ICP-OES, AFM y SEM-EDX. Nuestro TEM-EDX mapas con n = 30 fotogramas y n = 6 espectros para cada muestra y control también fueron analizados por el software Suite de microanálisis, y los resultados fueron confirmados por otros métodos tales como FTIR, FM, TEM, SPM y AFM topográfica 3D4 , 5. la propuesta microanálisis TEM-EDX, como proyección de imagen de Raman-basado, requiere sólo una muestra mínima preparación, es súper sensible, no invasiva y rentable y puede extenderse a otros sistemas relevantes para el medio ambiente humano.

La técnica presentada podría utilizarse en un amplio campo de investigación en el futuro. Puede ser modificada para la investigación de diferentes apatitas naturales y sintéticos. También se puede ajustar para adaptarse a los protocolos de los experimentos con biológicos y químicos sondas. Además, todos los elementos de la tabla periódica pueden ser analizados con el fin de visualizar no sólo la morfología de los minerales, sino también cambios en su composición de iones y sustituciones. Intercambio iónico en apatitas es un procedimiento conocido para aplicación biomédica27. Un posible factor fisiológico que controla los iones Ca, F y Cl o Sr, Mg, Mn y Zn reemplazo de iones metálicos en la ah durante la formación mineral, que es un punto de inflexión entre mineralización fisiológica y patológica, puede ser la Pi/PPi relación7. Si se aplica correctamente, esta técnica permite realizar la asignación de múltiples elementos de una misma región celular, vesicular o minerales varias veces en una fila.

En los últimos años, mucho se avanzó sobre los mecanismos de hueso mineralización28,29,30,31,32,33. Nos dimos cuenta de que diferentes líneas celulares pueden tener distintos perfiles de vesículas y de formación mineral. En este sentido, hemos seleccionado dos líneas celulares humanas: osteoblástica hFOB 1.19 y osteosarcoma Saos-2, que se someten a completar el transdifferentiation osteogénico de proliferación a la mineralización y producir MVs que provocan la nucleación de apatita en ECM 34 , 35.

AR-S manchas de depósitos de calcio revelaron que estimula las células Saos-2 mineralización diferentemente que hFOB 1.19 osteoblastos. Esto fue correlacionado con la producción de minerales de células Saos-2 que eran imperceptibles bajo luz UV a diferencia de los producidos por las células hFOB 1.19. Nuestros datos de TEM-EDX revelaron que los minerales producidos en vesículas de células Saos-2 fueron similares a los sintético HA debido a la superposición de las distribuciones de calcio y fósforo. En cambio, la superposición de las distribuciones de flúor y fósforo en las vesículas de las células hFOB 1.19 indica la formación de otros tipos de minerales además de apatitas.

En conclusión, nuestros resultados indican que las vesículas son determinantes clave de nucleación mineral, especialmente en el nivel celular5,25. Por otra parte nuestros datos están de acuerdo con una teoría anterior que MVs pueden considerarse como una forma especializada de microvesículas que son capaces de iniciar la mineralización dentro y fuera de la célula4. La comparación de las vesículas de células Saos-2, que mineralizarse más eficientemente, y vesículas de células hFOB 1.19 método TEM-EDX microanalíticos apoya la hipótesis de que MVs son vesículas llenas de mineral. Esto deja abierta la cuestión si es necesaria la presencia de MVs para inducir la nucleación de apatita, y cómo esto puede alterar fisiológico de mineralización patológica.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.

Acknowledgments

MK y pedir realizar operaciones manuales y LB había preparado dibujos e hizo la película. PREGUNTA escribió el manuscrito, LB escribió el guión y MK había preparado la mesa. SM, RB y SP leen críticamente la tabla, el script y el manuscrito. Los autores desean agradecer a Hanna Chomontowska por su excelente asistencia ultramicrotomía como Szymon Suski y Henryk Bilski por su excelente ayuda con análisis de TEM-EDX. Los autores desean dar las gracias a Dr. Patrick para corrección de inglés profesional y Barbara Sobiak para las instrucciones de la grabación.

Este trabajo fue financiado por beca N N401 140639 del Ministerio polaco de ciencia y educación superior para pedir, por subvenciones del Centro Nacional de ciencia, Polonia 2016/23/N/NZ4/03313 LB y 2016/23/N/NZ1/02449 a MK, UE FP7 proyecto BIOIMAGINE : BIO-proyección de imagen en investigación, innovación y educación, GA Nº 264173 y por los fondos legales del Instituto de Biología Experimental Nencki, Polaco Academia de Ciencias.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture PAA E15-813 1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium PAA E82312-0025 for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin) Sigma P0781-100ML 100 U/mL each
G-418 Sigma 68168 0.3 mg/mL
FBS Gibco 10270 10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA Sigma A-5960 50 µg/mL
ß-GP Sigma G9422-100G 7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel Bio-Rad 130-0420 for HA
FA synthesized by us
CA synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture Sigma S7907/S8282 0.1 M, pH 7.2
PBS pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS Sigma A5533-25G 0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA Sigma C2674 500 U/mL
SCL buffer prepared by us
Deionized wather produced by us
Ethanol POCh BA6480111 absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol Polysciences Inc. 21447-25 0.25 g/10 mL
PD medium pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde) Sigma 158127/G-6257 3%:1%
Post-fixation OsO4 Sigma 75633 1%
LR White resin in ethanol Polysciences Inc. 17411-MUNC 500g 1:2, 1:1, 100%
Acetone CHEMPUR 111024800 pure
Tool
Cryogenic vials Corning Inc. 430487 1.2 mL
Plastic Petri culture dishes Falcon 353003 100 mm
Plastic tubes Falcon 352096 and 352070 15 and 50 mL
Serological pipettes Falcon and VWR 357521 and 612-3700 1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes Sigma Z688312 and Z628034 1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips VWR 613-0364, 613-0239 and 613-1050 0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks Light Labs A-7055-Z, A-7053-C green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save Thermo Scientific Co. KS12 HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell Thermo Scientific Co. 150 34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood POLON WCS-2 for TEM stainings
Glass bottles SIMAX 1632414501050 and 1632414501100 50 and 100 mL
Quartz glass tubes SIMAX 638422010100 Ø 10 mm, L 100 mm
Pump IBS Integra Biosciences VACUSAFE comfort for vacuum
Oven Memmert UNE 400 56°C
Porcelain multi-well plate Rosenthal technik 229/12 12 wells
Glass beakers SIMAX 632417010025 25 mL
Glass bottles Pocord DIN22 10 mL
Plastic box Agar Scientific Ltd. for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules Agar Scientific Ltd. G3741 size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box Agar Scientific Ltd. S162N3 film on the shiny side
Silicon cell scraper Sigma SIAL0010-100EA size 1.8/25 cm
Syringe with needle BogMark 007 syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe Chirana CH005L 5 mL
Centrifuge MPW Medical Instruments MPW-350R 130 x g and 500 x g
UV transluminator UVP M-20 for visible and UV light
Ultramicrotome LKB NOVA 700Å sections
Block holder LKB E6711 round shape
Diamond knife DiATOME Ultra 45° size 3
Eyelash holder bovine, prepared by us
Forceps ROTH 2855.1 antistatic for grids
Spatulas set ROTH E286.1 antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope Zeiss with Canon AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9 Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses Nikon Nikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D 		for movie recordings
Microphone MXL Mics Tempo for voice recordings

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References

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Química número 136 minerales vesículas osteoblastos osteosarcoma Ultravioleta luz TEM-EDX
Análisis de minerales producidos por hFOB 1.19 y Saos-2 células usando la microscopia electrónica transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía
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Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek,… More

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).

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