Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Analyse af mineraler produceret af hFOB 1,19 og Saos-2 celler ved hjælp af transmissions elektronmikroskopi med Energy Dispersive X-ray mikroanalyser

doi: 10.3791/57423 Published: June 24, 2018

Summary

Vi præsenterer en protokol for at sammenligne tilstanden af mineraler i vesikler udgivet af to menneskelige knogler cellelinjer: hFOB 1,19 og Saos-2. Deres mineralisering profiler blev analyseret af Alizarin rød-S (AR-S) farvning, ultraviolet (UV) lys visualisering, transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) billeddannelse og energy dispersive X-ray mikroanalyser (EDX).

Abstract

Denne video præsenterer brugen af transmissions Elektron Mikroskopi med energy dispersive X-ray mikroanalyser (TEM-EDX) til at sammenligne tilstanden af mineraler i vesikler udgivet af to menneskelige knogler cellelinjer: hFOB 1,19 og Saos-2. Disse cellelinjer, efter behandling med ascorbinsyre (AA) og β-glycerophosphate (β-GP), underkastes komplet osteogenic transdifferentiation fra spredning til mineralisering og producere matrix vesikler (MVs) der udløser apatit Nukleering i den ekstracellulær matrix (ECM).

Baseret på Alizarin rød-S (AR-S) farvning og analyse af sammensætningen af mineraler i cellelysater ved hjælp af ultraviolet (UV) lys eller blærer ved hjælp af TEM imaging efterfulgt af EDX kvantitering og ion kortlægning, kan vi udlede at osteosarkom Saos-2 og osteoblastic hFOB 1,19 celler afslører særskilte mineralisering profiler. SAOS-2 celler mineralize mere effektivt end hFOB 1,19 celler og producerer større mineralforekomster, der ikke er synlige i UV-lys, men ligner hydroxyapatit (HA) i, at de har mere Ca og F erstatninger.

Resultaterne ved hjælp af disse teknikker tillader os at konkludere, at processen med mineralisering varierer afhængigt af hvilken celle. Vi foreslår, at på celleniveau, oprindelse og egenskaber af vesikler forudbestemme typen af mineraler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bone er en type af bindevæv består af to dele: økologisk (celler og kollagen fibre) og mineraler (calcium og fosfat forbindelser). De vigtigste mineralske bestanddele i knogler er apatit1. Forskellige typer af mineralisering-kompetente celler i knoglen (osteoblaster), tænder (odontoblasts) og brusk (chondrocytter) regulere de indledende trin i mineralisering af producerer proteiner i den ekstracellulære matrix (ECM) og frigive matrix vesikler (MVs) (figur 1). MVs er 100-300 nm diameter blærer, der ophobes calcium og fosfat lette apatit Nukleering og efterfølgende bindes til kollagen2,3. Derefter, MVs smuldre for at frigive apatit til den ekstracellulære medium. Apatit fortsætter med at vokse i kontakt med kollagen fibre og danne knoglematrix. Mineralisering er påført den konstant tilførsel af P,jeg og Ca2 + i den ekstracellulære medium. Nogle nyligt offentliggjorte data understøtter vores model4,5. Bløde væv ikke mineralize fysiologiske betingelser. Ektopisk kalcifikation kan dog forekomme patologiske betingelser såsom vaskulære forkalkning3. Vaskulære celler, at erhverver osteoblastdannelse Fænotypen kan producere MVs, der fremkalde Nukleering af apatit og indlede mineralisering i de mediale og intima lag i væggen af blodkar. Siden ektopisk kalcifikation ligner normale endochondral mineralisering3, forstå de molekylære mekanismer af mineralisering af ossøse celler og chondrocytter bør give nogle fingerpeg om ektopisk kalcifikation af bløde væv, der er dannet.

Udviklingen af skeletmuskulatur væv er reguleret af forskellige enzymer, vækstfaktorer, og projektledere eller hæmmere af mineralisering. Handlingen antagonistiske væv-uspecifik alkalisk fosfatase (TNAP) (figur 1) og ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase jeg (NPP1), sammen med ankyrin (ANK), kontrollerer uorganiske pyrofosfat, (PPjeg) koncentration 6. PPjeg, en potent hæmmer af dannelse af HA er hydrolyseret af TNAP; NPP1 hydrolyserer nukleotid triphosphates for at danne PP,jeg mens ANK eksport PPjeg fra cellen til ECM. Pi/PPi forholdet kan regulere apatit dannelse7,8 med mulige patologiske konsekvenser9.

MV-membranen er beriget med ion transport proteiner, som letter den indledende udfældning af calcium og fosfat inde MVs under Nukleering processen (figur 1). Fosfat transporter 1 (PiT) hjælper med at indarbejde Pjeg genereret i perivesicular rum i MVs10,11. Annexins kan være involveret i bindingen og transport af Ca2 + og den biofysiske proces, der initierer mineralisering i MV lumen12,13. Vi favoriserer den hypotese, foreslog tidligere, for mineralisering inden intracytoplasmatisk blærer af indre Nukleering af apatit inde MV før dens formering i ECM14,15. In vitro modellering bekræftet induktion af Ca2 +/Pjeg komplekser dannelse i proteoliposomes af PS og AnxA516. Dette kan indikere at ophobning af Ca2 +, P,jeg, AnxA5 og PS komplekser i lipid rafts i microvilli-lignende membranesrepresent Nukleering core (NC) af apatit inden for Mvs Annexins og TNAP også besidder kollagen-bindende kapacitet, som kan være nyttige i at placere MVs langs kollagen fibre og stimulere udbredelsen af mineralisering i ECM. Fetuin A og osteopontin (OPN)17, er kendt som hæmmere af apatit formation, som kan bremse udbredelsen af mineralisering på kollagen skafottet. Nukleering og formering er forskellige begivenheder, den tidligere forud for de sidstnævnte, og begge kan være relevante for processen med patologisk mineralisering.

For at opdage, hvordan kemien i calciumphosphat komplekser kan ændre fysiologiske mineralisering og ektopisk kalcifikation, er det nødvendigt at identificere de mineraler, der er produceret af celler. Apatit er en gruppe af calcium og fosfat indeholder mineraler med generelle krystal enhed celle formel Ca10(PO4)6X2, hvor X = Cl, F, OH. De klassificeres som følger18: fluorapatite (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 og hydroxyapatit (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.

Valg af osteoblastdannelse cellelinjer til at fremkalde mineral dannelse er afgørende, da hver cellelinje udstiller en særskilt profil af mineralisering. I denne betænkning, vi sammenlignede Nukleering af mineraler af to valgte menneskelige cell modeller af mineralisering: osteoblastic hFOB 1,19 celler og osteosarkom Saos-2 celler. Osteosarkom-afledte celler er almindeligt anvendt som osteoblastic modeller og Saos-2 celler har bevaret de mest modne osteoblastic karakter19 , mens udifferentierede menneskelige føtal hFOB celler er almindeligt anvendt som en model for normal osteoblastic differentiering20. Deres mineralisering profiler blev analyseret ved hjælp af forskellige metoder: Alizarin rød-S (AR-S) farvning, ultraviolet (UV) lys visualisering, transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) imaging, energy dispersive X-ray mikroanalyser (EDX) kvantitering og ion kortlægning. Fordel af TEM-EDX over alternative teknikker, der anvendes i tidligere undersøgelser er, at det giver kvantitative og kvalitative resultater af ion udskiftning i apatit krystaller4,5,21. Det overordnede mål med hjælp af TEM-EDX var at finde en enkel metode til billedbehandling og kvantificering af distribution af Ca, F og Cl-ioner i forskellige mineraler fra forskellige typer af celler i forskellige faser af mineralisering proces. Denne metode har held været anvendt, for eksempel til overvågning af samspillet mellem zink nanopartikler med sameksisterende kemikalier og deres kombinerede virkninger på akvatiske organismer22. I en anden undersøgelse, en kobber photocatalyst på titanium materialer i vandige løsning var udstrakt grad karakteriseret ved hjælp af Induktivt koblet plasma optical emission massespektrometri (ICP-OES), N2 physisorption (BET), XRD, UV-vis DRS, FT-IR, Raman spektroskopi, TEM-EDX og photoelectrochemical målinger23. Vores mål var at sammenligne oprindelse og egenskaber af vesikler og mineraler i to cellelinjer til at forstå den mekanisme, der styrer mineralisering under ossøse differentiering.

Figure 1
Figur 1 . Ordningen af de indledende trin i mineralisering i ossøse celler der involverer syntesen af ekstracellulære matrix (ECM) proteiner og frigivelse af matrix vesikler (MVs) fra membranen. MVs ophobes calcium gennem handling af calcium-bindende proteiner, annexins og fosfat, gennem handling af en uorganisk fosfat transporter (PiT) efterfulgt af aktiviteten af væv uspecifikke alkalisk fosfatase (TNAP), som dephosphorylates PPjeg til Pjeg, dermed at lette apatit Nukleering. Derefter, MVs smuldre og frigive apatit til den ekstracellulære medium. Mineralisering er påført den konstant tilførsel af P,jeg og Ca2 + i den ekstracellulære medium4,5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. celle kultur og behandling

  1. Sætte alle de nødvendige materialer under laminar flow hood og sterilisere dem under UV-lys. Kultur medier er: en 1:1 blanding af skinke er F12 og DMEM medier med 2,5 mM L-glutamin suppleret med 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 0,3 mg/mL G418 og 10% føtal bovint Serum (FBS) (v/v) for menneskelige fosteret hFOB 1,19 SV40 store T antigen transfekteret osteoblaster og Mccoy's 5A medium med 1,5 mM L-glutamin supplere med 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin og 15% FBS (v/v) for menneskelige osteosarkom Saos-2 celler.
  2. Kultur hFOB 1,19 celler på 34 ° C i en atmosfære med 5% CO2 og Saos-2 celler ved 37 ° C i en atmosfære med 5% CO2. Overføre cellekulturer, enten hFOB 1,19 eller Saos-2 celler, fra rugemaskinen laminar flow hætte og ændre mediet 10 ml frisk næringssubstratet med FBS.
  3. Inkuber celler uden Stimulatorer (resting celler) eller stimulere dem med 50 µg/mL ascorbinsyre (AA) efterfulgt af 7.5 mM β-Glycerophosphate (β-GP), udarbejdet tidligere i ultrarent vand og filtreret gennem 0,22 µm sprøjte filtre. Tilføj Stimulatorer fra plastik microcentrifuge rør på overfladen af næringssubstratet. Blidt røre kultur parabol og Inkuber i 7 dage.

2. påvisning af Calcium mineraler

  1. Vaske cellekulturer med fosfat Buffer saltvand (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7,0).
  2. Der tilsættes 5 mL 2% (g:100 mL) AR-S i PBS, pH 5,0 og inkuberes plader for 30 min til at plette mineralerne.
  3. Vask 3 gange med PBS. Forsigtigt tilføje PBS til parabol væg, prøv ikke at ødelægge mineralerne.
  4. Observere calcium mineraler under en inverteret lysmikroskop og tage billeder.

3. visualisering af sonder i UV-lys

  1. Cellelysater, behandle cellekulturer, enten hvile eller stimuleret i 7 dage, ifølge collagenase fordøjelsen protokol24.
  2. Indsamle medium fra cellekulturer og cellerne vaskes med PBS.
  3. Fordøje celler med 3 mL 500 U/mL collagenase i en opløsning af 0,25 M saccharose, 0,12 M NaCl, 0,01 M KCl og 0,02 M Tris-HCl buffer, pH 7,45, ved 37 ° C til 3 h.
  4. Mekanisk skrabe cellerne, overføre dem til plast microcentrifuge rør, og videregive dem 10 gange gennem en 1 mL 40 U sprøjte med 0,5 × 16 nål.
  5. Der centrifugeres prøver på 500 × g i 5 min.
  6. Supernatanten og suspendere celle pellet i 500 µL af syntetiske brusk lymfeknuder (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0.57 mM MgCl2, 1,83 mM NaHCO3, 0.57 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glucose, 63 mM saccharose, 16,5 mM Hepes, pH 7,4).
  7. Overføre hydroxyapatit (HA), fluorapatite (FA) og chlorapatite (CA) pulver fra flasker på UV-transilluminator med en spatel og bruge som kontrol.
  8. Overføre cellelysater fra plasticrør med plastik tips og læg forsigtigt på UV transilluminator.
  9. Tage billeder under synligt og UV-lys.

4. forberedelse af sonder til TEM-EDX

  1. Forberedelse af mineraler for negative farvning
    1. Suspendere 2,5 mg af syntetisk fremstillet HA, CA og FA mineraler25 i 500 µL med deioniseret vand og inkuberes ved 37 ° C i en atmosfære med 5% CO2 for 1 h.
    2. Tage Formvar/Carbon 300 Mesh Ni gitre fra boksen med antistatisk pincet, sted på en porcelæn multi godt plade og drop 10 µL af HA, CA og FA suspensioner på Grid-net.
    3. Tørre prøver i 30 min. ved stuetemperatur.
  2. Forberedelse af hvile og stimuleret celler for indlejring 26
    1. Indsamle medium fra cellekulturer og cellerne vaskes med fysiologiske desensibilisering (PD) medium (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10 mM NaHCO3, 1 mM KH2PO4, 10 mM glukose, 20 mM HEPES, pH 7,4).
    2. Fix cellerne med 5 mL af en blanding af 3% (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL) glutaraldehyd i 100 mM natrium fosfat buffer, pH 7,2, i 1 time ved stuetemperatur under stinkskab.
    3. Cellerne vaskes med 5 mL af 100 mM natrium fosfat buffer og forsigtigt fjerne bufferen efter vask.
    4. I det mørke rum, postfix prøver med 2 mL 1% (g:100 mL) osmium dinitrogentetraoxid i 100 mM natrium fosfat buffer, pH 7,2, i 20 min. ved stuetemperatur under stinkskab.
    5. Fjerne osmium dinitrogentetraoxid og udnytte det.
    6. Cellerne vaskes med 5 mL af 100 mM natrium fosfat buffer.
    7. Derefter, dehydrere prøver i 5 mL alikvoter af en gradueret ethanol løsning serie ved stuetemperatur: 25% (af vol.) i 5 min, 50% (af vol.) i 10 min, 75% (af vol.) i 15 min., 90% (af vol.) i 20 min. Endelig bruger absolut ethanol to gange og Inkuber i 30 min. og 12 h.
    8. Mekanisk skrabe cellerne fra plast petriskåle kultur, samler ind plast microcentrifuge rør og centrifugeres prøver ved 130 x g i 1 min.
    9. Fjerne analysere og suspendere celler i 1 mL af en blanding af LR hvid harpiks og absolut ethanol på en volumen-forholdet på 1:2.
    10. Bland godt indhold af glasrør før brug og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur.
    11. Der centrifugeres prøver ved 130 x g i 1 min.
    12. Fjerne analysere og Gentag de forrige trin ved hjælp af 1 mL af en 1:1 blanding af LR hvid harpiks og absolut ethanol.
    13. Bland godt og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur.
    14. Der centrifugeres prøver ved 130 x g i 1 min.
    15. Fjerne supernatanter.
    16. Endelig tilsættes 1 mL ren LR hvid harpiks til prøverne to gange og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur i plasticrør.
    17. Placere 500 µL af hver prøve i gelatine kapsler.
      Bemærk: Prøverne er mærket ved hjælp af en lille ark papir og en blyant, så harpiksen ikke ødelægger etiketterne.
    18. Luk gelatine kapsler, sætte dem ind i plastic microcentrifuge rør og centrifugeres ved 130 x g i 1 min i en swing-out rotor.
    19. Fjerne kapslerne fra plast rør ved hjælp af en vakuumpumpe.
    20. Flytte prøverne at ovnen og polymerisere ved 56 ° C i 48 timer.
    21. Forbered blokke ved at montere dem i holderen og trimme dem til pyramiden.
    22. Sætte indehaveren i ultramicrotome, vedhæfte Ultra 45° diamantkniven og fyld den med deioniseret vand; Husk at rense klinge fra tilfældige luftbobler.
    23. Derefter skæres sektioner (700 Å) ved hjælp af diamantkniven på bad deioniseret vand.
    24. Sæt de scraps, ved hjælp af kvæg øjenvipper og Placer dem på den blanke side af Formvar/Carbon 300 mesh Ni gitter og tør dem.
    25. Forberede 2,5% (af vol.) uranyl acetat i absolut ethanol i mørke under et stinkskab. Holde uranyl acetat i en beholder, bly og husk ikke at afhente sedimentet.
    26. I det mørke rum, counterstain gitre af syntetiske apatit og celle prøver med 2,5% (af vol.) uranyl acetat i ethanol i 20 min. ved stuetemperatur under stinkskab.
    27. Vask gitre i 50% ethanol (af vol.), derefter i deioniseret vand og tør ved stuetemperatur i 24 timer. Endelig, sætte gitrene i boksen.

5. TEM-EDX analyse

  1. TEM billeddannelse af et transmissions-elektronmikroskop (TEM) udstyret med hele spektret Energy Dispersive X-ray mikroanalyser (EDX) System og 11 Megapixel kamera
    1. Forberede en beryllium indehaveren for observation af mineraler og celler. Bruge antistatiske værktøjer.
    2. Fjerne to skruer og beryllium plade og beryllium skive fra resten af holderen.
    3. Montere gitteret, skinnende side op, på indehaveren.
    4. Omhyggeligt placere beryllium skive og beryllium plade og skrue fastgørelse skruer stramt.
    5. Sætte indehaveren i den vakuumkammer og tænde vakuumpumpen.
    6. Når en vakuum er opnået, forsigtigt indsætte indehaveren i den billeddiagnostiske afdeling og slå på bjælken.
    7. Indstille blænde parametre af mikroskopet på fluorescerende skærmen. Udføre bygningsfejl billedkorrektion; Indstil zoom, fokus og ramme; og tage TEM billeder ved en forstørrelse på 50, 000 X.
  2. STEM imaging og X-ray mikroanalyser spektrale og kompositoriske analyse
    1. Indsæt energy dispersive X-ray (EDX) detektor ind i scanning transmissions Elektron Mikroskopi (STEM) imaging kammeret.
    2. Juster skarpheden af billedet i fokus tilstand.
    3. Tag STILKEN billeder ved en forstørrelse af 15, 000 X.
    4. Vælg et punkt i eksemplet for X-ray mikroanalyser og indsamle spektre.
    5. Få data ved at summere alle atomic vægte for alle elementer i periodiske system i stikprøven (som 100%) og for indholdet af markerede elementer: Ca, F, Cl og P (som atomare %). Derefter beregne nøgletal Ca, F eller Cl til P for hver prøve.
  3. Ion kortlægning
    1. Vælg elementer såsom calcium, fluor, klor og fosfor til at gøre ion kortlægning og udføre EDX kort over de valgte elementer i prøverne.
    2. Få data ved at angive lokalisering af analyseres elementer: Ca, F, Cl og P (som atomare %) og beregne Co lokaliseringen (i %) af Ca, F eller Cl med P for hver prøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

TEM-EDX giver mulighed for in vitro- imaging af matrix vesikler (MVs) udgivet af mineralizing celler og mineraler produceret af Mvs resultaterne ved hjælp af denne teknik viser, at processen med mineralisering kan fortsætte anderledes i forskellige typer af celler. To cellelinier modtaget den samme osteoblastic transdifferentiation behandling, men stimuleret Saos-2 celler mineraliseret mere effektivt end hFOB 1,19 osteoblaster, som det fremgår af AR-S farvning (figur 2). Dette kan være på grund af de mere modne osteoblastdannelse Fænotypen af Saos-2 celler19 i forhold til hFOB 1,19 celler20. Visualisering af prøver ved hjælp af en UV transilluminator gjort det klart, at kun fluorapatites kan overholdes under UV-lys (figur 3). TEM billeder angivet at stimuleret Saos-2 celler producerer mere vesikler indeholdende mineraler i forhold til stimuleret hFOB celler eller hvilende Saos-2 celler (figur 4, højre og midterste paneler). Syntetisk apatit har forskellige former for mineraler (figur 4, højre panel). TEM billeder viste tilstedeværelsen af vesikler i hFOB 1,19 og Saos-2 celler under hvile og stimuleret betingelser (figur 5, venstre panel). På EDX ion maps, røde punkter angiver calcium, grønne Point Vis fosfor og blue point peg på fluor distributioner (figur 5, midterste panel). Stimuleret betingelser er der en stærk overlapning mellem calcium og fosfor distributioner i vesikler produceret af Saos-2-celler og mellem fluor og fosfor i vesikler produceret af hFOB 1,19 celler (figur 5, højre panel).

Figure 2
Figur 2 . AR-S farvning af mineraler (rød) produceret af hFOB 1,19 (øverste panel) og Saos-2 (nederste panel) celler enten hvile (R) eller efter 7 dages stimulation med AA og β-GP (S). Bar: 25 µm. En typisk resultat med n = 3 er præsenteret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Synlig (øverste panel) og UV (midterste panel) lys visualisering af syntetiske HA, CA og FA mineraler og mineraler produceret af hFOB 1,19 (nederste venstre panel) og Saos-2 (nederste højre panel) celler enten hvile (R) eller efter 7 dages stimulation med AA og β-GP (S) . Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 4
Figur 4 . TEM billeder af vesikler og mineraler produceret af hFOB 1,19 (venstre panel) og Saos-2 (midterste panel) celler enten hvile (R) eller efter 7 dages stimulation med AA og β-GP (S). Syntetisk HA, CA og FA mineraler er vist som kontrolelementer (højre panel). Bar: hvid 500 nm, sort 250 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 5
Figur 5 . TEM billeder (venstre panel) hFOB 1,19 og Saos-2 celler enten hvile (R) eller efter 7 dages stimulation med AA og β-GP (S). Ion kort til Ca (rød), Cl (gul), F (blå) og P (grøn) fra EDX (midterste panel). Co lokalisering af elementer (højre panel): calcium til phosphor (Ca), fluor til fosfor (F) eller klor til fosfor (Cl) var kvantificeret baseret på EDX maps. Bar: 500 nm. Tre uafhængige forsøg for begge cellelinjer blev udført. 10 billeder fra hver variant (hvile og stimuleret) blev taget, så fra 2 til 6 af dem blev udvalgt til videre beregning af element Co lokalisering. En typisk resultat præsenteres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I den nuværende papir, vi beskrevet protokollerne for AR-S farvning, UV lys identifikation af fluorapatite og TEM-EDX in vitro- imaging af MVs udgivet af mineralizing celler og mineraler produceret af MVs. Det er muligt at behandle alle metoder nævnt ovenfor ved at følge nogle fælles fejlfindingstrin. For at opnå optimale resultater, skal flere kritiske trin udføres omhyggeligt. For det første er det bedre at tilføje AA (som er sure) efterfulgt af β-GP (som er basisk) for at bevare pH 7,4 af næringssubstratet. For det andet efter AR-S farvning, de farvede kalkaflejringer er meget skrøbelige og cellerne vaskes med stor forsigtighed for at forhindre ødelæggelse af krystaller ved tilføjelse af PBS. For det tredje altid holde uranyl acetat i en beholder, bly og ikke afhente sedimentet fordi kun den fortyndede brøkdel bør anvendes til fiksering. Fjerde, Husk at AA og uranyl acetat er lysfølsomt og skal håndteres i det mørke rum. For det femte bør blanding af LR hvid med absolut ethanol blandes godt før den føjes til prøverne. Det sjette burde prøver i gelatine kapsler være mærket ved hjælp af en lille ark papir og en blyant, så harpiksen ikke ødelægger etiketterne. Syvende, blade af diamantkniven skal rengøres grundigt fra eventuelle luftbobler. Ottende, prøver bør lægges forsigtigt på den blanke side af gitteret hvor Formvar/Carbon film er beliggende. Niende, placere korrekt det punkt hvor X-ray mikroanalyser og ion kortlægning udføres på TEM billedet til at begrænse eventuelle problemer med apatit anerkendelse.

Selvom præsenteres protokollen viste sig for at være mest gunstig i vores eksperimentelle design, er det muligt at ændre det til at passe forskellige mål. Som med enhver anden teknik, har dette også sine begrænsninger. Supplerende teknikker, såsom FTIR, bør anvendes for at bekræfte eller kontrollere eksistensen af industrielt fremstillet forholdet mellem undersøgt elementer8,12,26. Metoden TEM-EDX præsenteres her er en betydelig forbedring med hensyn til den eksisterende metode, som er en kombination af mikro-Raman-baserede kortlægning og chemometric metoder og svarer til billeddannelse af sølv nanopartikler (AgNPs) distribution til forskellige overflader af mineralsk og mekanismen af deres molekylære interaktioner21. Raman-baseret tænkelig er blevet testet på to mineral modeller (makro - og mikro-størrelse). Raman kort lavet af n = 600-900 spektre for hver prøve/kontrol blev analyseret af Vespucci software og resultaterne blev bekræftet via andre metoder såsom ICP-OES, AFM og SEM-EDX. Vores TEM-EDX kort bestående af n = 30 frames og n = 6 spektre for hver prøve/kontrol blev også analyseret af mikroanalyser Suite-softwaren, og resultaterne blev bekræftet via andre metoder såsom FTIR, FM, TEM, SPM og 3D topografisk AFM4 , 5. den foreslåede TEM-EDX mikroanalyser, ligesom Raman-baserede billeddannelse, kræver kun minimal prøveforberedelse, er super-følsom, ikke-invasiv og omkostningseffektive og kan udvides til andre systemer, der er relevante for det menneskelige miljø.

Den præsenterede teknik kan anvendes i et bredt felt af forskning i fremtiden. Det kan ændres til undersøgelse af forskellige naturlige og syntetiske apatit. Det kan også justeres for at passe protokollerne til eksperimenter med biologiske og kemiske sonder. Derudover kan alle elementer fra den periodiske tabel analyseres for at visualisere ikke kun morfologi af mineraler, men også ændringer i deres ion sammensætning og udskiftninger. Ionbytning i apatit er en kendt procedure for biomedicinsk ansøgning27. Et muligt fysiologiske faktor, der styrer Ca, F og Cl-ioner eller Sr, Mg, Mn og Zn metal ion udskiftning i HA under mineral dannelse, som er et vendepunkt mellem fysiologiske og patologiske mineralisering, kan være Pederseni/PPi forhold7. Hvis den anvendes korrekt, denne teknik giver mulighed for til at udføre kortlægning af flere elementer i regionen af samme cellulære, vesikulære eller mineralsk flere gange i træk.

I de seneste år fremskridt meget vedrørende mekanismerne af knogle mineralisering28,29,30,31,32,33. Vi indså, at forskellige cellelinjer kan have særskilte profiler af vesikler og mineralske dannelse. I denne henseende vi valgt to menneskelige cellelinjer: osteoblastic hFOB 1,19 og osteosarkom Saos-2, som underkastes komplet osteogenic transdifferentiation fra spredning til mineralisering og producere MVs, der udløser apatit Nukleering i ECM 34 , 35.

AR-S farvning af kalkaflejringer afslørede at stimuleret Saos-2 celler mineraliseret anderledes end hFOB 1,19 osteoblaster. Dette var korreleret med produktion af mineraler af Saos-2-celler, der var målbart under UV-lys i modsætning til dem, der produceres af hFOB 1,19 celler. Vores TEM-EDX data viste, at de mineraler, der er produceret i blærer af Saos-2-celler var ens til syntetiske HA på grund af overlapning i calcium og fosfor distributioner. Derimod angivet overlapning i fluor og fosfor distributioner i vesikler fra hFOB 1,19 celler dannelsen af andre typer af mineraler ud over apatit.

Afslutningsvis, viser vores resultater, at vesikler er vigtige determinanter af mineralske Nukleering, især på det cellulære niveau5,25. Vores data er desuden enig med en tidligere teori at MVs kan betragtes som en specialiseret form for microvesicles, der er i stand til at starte mineralisering inden for såvel som uden for celle4. Sammenligning af vesikler frigives fra Saos-2 celler, som mineralize mere effektivt, og vesikler frigives fra hFOB 1,19 celler ved hjælp af metoden TEM-EDX microanalytical støtter den hypotese, at MVs mineral-fyldt blærer. Dette efterlader åbent spørgsmål, om tilstedeværelsen af MVs er nødvendig for at fremkalde apatit Nukleering, og hvordan dette kan ændre fysiologiske til patologisk mineralisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

MK og Spørg udføres manuelle operationer og LB udarbejdet tegninger og lavede filmen. Spørg skrev manuskriptet, LB skrev manuskriptet og MK forberedt tabellen. SM, RB og SP læse kritisk tabellen, scriptet og manuskriptet. Forfatterne vil gerne takke Hanna Chomontowska for hendes fremragende hjælp med ultramikrotomi Szymon Suski og Henryk Bilski for deres fremragende hjælp med TEM-EDX analyse. Forfatterne vil gerne takke Dr. Patrick Lunde til professionel engelsk korrektion og Barbara Sobiak til optagelse af vejledningen.

Dette arbejde blev støttet af tilskud Nielsen N401 140639 fra det polske ministerium for videnskab og videregående uddannelse med ASK, af tilskud fra National Science Centre, Polen 2016/23/Nielsen/NZ4/03313 til LB og 2016/23/Nielsen/NZ1/02449 til MK, EU RP7 projekt BIOIMAGINE : BIO-IMAGing forskning INnovation og uddannelse, GA No. 264173, og af de lovpligtige midler af Nencki Institut for eksperimentel biologi, Polish Academy of Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture PAA E15-813 1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium PAA E82312-0025 for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin) Sigma P0781-100ML 100 U/mL each
G-418 Sigma 68168 0.3 mg/mL
FBS Gibco 10270 10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA Sigma A-5960 50 µg/mL
ß-GP Sigma G9422-100G 7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel Bio-Rad 130-0420 for HA
FA synthesized by us
CA synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture Sigma S7907/S8282 0.1 M, pH 7.2
PBS pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS Sigma A5533-25G 0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA Sigma C2674 500 U/mL
SCL buffer prepared by us
Deionized wather produced by us
Ethanol POCh BA6480111 absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol Polysciences Inc. 21447-25 0.25 g/10 mL
PD medium pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde) Sigma 158127/G-6257 3%:1%
Post-fixation OsO4 Sigma 75633 1%
LR White resin in ethanol Polysciences Inc. 17411-MUNC 500g 1:2, 1:1, 100%
Acetone CHEMPUR 111024800 pure
Tool
Cryogenic vials Corning Inc. 430487 1.2 mL
Plastic Petri culture dishes Falcon 353003 100 mm
Plastic tubes Falcon 352096 and 352070 15 and 50 mL
Serological pipettes Falcon and VWR 357521 and 612-3700 1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes Sigma Z688312 and Z628034 1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips VWR 613-0364, 613-0239 and 613-1050 0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks Light Labs A-7055-Z, A-7053-C green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save Thermo Scientific Co. KS12 HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell Thermo Scientific Co. 150 34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood POLON WCS-2 for TEM stainings
Glass bottles SIMAX 1632414501050 and 1632414501100 50 and 100 mL
Quartz glass tubes SIMAX 638422010100 Ø 10 mm, L 100 mm
Pump IBS Integra Biosciences VACUSAFE comfort for vacuum
Oven Memmert UNE 400 56°C
Porcelain multi-well plate Rosenthal technik 229/12 12 wells
Glass beakers SIMAX 632417010025 25 mL
Glass bottles Pocord DIN22 10 mL
Plastic box Agar Scientific Ltd. for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules Agar Scientific Ltd. G3741 size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box Agar Scientific Ltd. S162N3 film on the shiny side
Silicon cell scraper Sigma SIAL0010-100EA size 1.8/25 cm
Syringe with needle BogMark 007 syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe Chirana CH005L 5 mL
Centrifuge MPW Medical Instruments MPW-350R 130 x g and 500 x g
UV transluminator UVP M-20 for visible and UV light
Ultramicrotome LKB NOVA 700Å sections
Block holder LKB E6711 round shape
Diamond knife DiATOME Ultra 45° size 3
Eyelash holder bovine, prepared by us
Forceps ROTH 2855.1 antistatic for grids
Spatulas set ROTH E286.1 antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope Zeiss with Canon AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9 Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses Nikon Nikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D
for movie recordings
Microphone MXL Mics Tempo for voice recordings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
  2. Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
  3. Anderson, H. C. Matrix vesicles and calcification. Curr Rheumatol. 5, (3), 222-226 (2003).
  4. Bolean, M., Simão, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Millán, J. L., Ciancaglini, P. Biophysical aspects of biomineralization. Biophys Rev. 9, (5), 747-760 (2017).
  5. Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Simão, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Millán, J. L., Buchet, R. Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models. Biochim Biophys Acta. 1862, (3), 532-546 (2018).
  6. Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, (14), 9445-9449 (2002).
  7. Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study. Bone. 38, (6), 811-817 (2006).
  8. Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles. Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).
  9. Terkeltaub, R. A. Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology. Am. J. Phys. 281, (1), 1-11 (2001).
  10. Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification. Bone. 27, (1), 69-74 (2000).
  11. Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Millán, J. L. Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice. J. Bone Miner. Res. 31, (6), 1275-1286 (2016).
  12. Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells. J. Proteome. 74, (7), 1123-1134 (2011).
  13. Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis. J. Biol. Chem. 278, (6), 3762-3769 (2003).
  14. Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis. Autophagy. 10, (11), 1965-1977 (2014).
  15. Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (35), 14170-14175 (2012).
  16. Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine. J. Biol. Chem. 282, (36), 26035-26045 (2007).
  17. Jahnen-Dechent, W., Schäfer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification. J. Mol. Med. (Berl). 86, (4), 379-389 (2008).
  18. Suchanek, W., Yoshimura, M. Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants. J. Miner. Res. 13, (1), 94-117 (1998).
  19. Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts. Anticancer Res. 24, (6), 3743-3748 (2004).
  20. Yen, M. -L., Chien, C. -C., Chiu, I. -M., Huang, H. -I., Chen, Y. -C., Hu, H. -I., Yen, B. L. Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors. Stem Cells. 25, (1), 125-131 (2007).
  21. Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces. Environ Sci Technol. (2018).
  22. Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO. Chemosphere. 196, 566-574 (2018).
  23. Tasbihi, M., Kočì, K., Troppová, I., Edelmannová, M., Reli, M., Čapek, L., Schomäcker, R. Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts. Environ Sci Pollut Res Int. (2017).
  24. Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells. J. Bone Miner. Res. 23, (11), 1798-1805 (2008).
  25. Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization. J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).
  26. Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. Matrix vesicles originate from apical membranę microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells. J. Cell. Biochem. 106, (1), 127-138 (2009).
  27. Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. Ion exchanges in apatites for biomedical application. J. Mater. Sci. Mater. Med. 16, (5), 405-409 (2005).
  28. Kraus, D. Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel® spreadsheet software. Med. Writ. 23, (1), 25-28 (2014).
  29. Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).
  30. Bonucci, E. Bone mineralization. Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).
  31. Veis, A., Dorvee, J. R. Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices. Calcif. Tissue Int. 93, (4), 307-315 (2013).
  32. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. J. Struct. Biol. 183, (2), 258-269 (2013).
  33. Alliston, T. Biological regulation of bone quality. Curr. Osteoporos. Rep. 12, (3), 366-375 (2014).
  34. Wang, W., Kirsch, T. Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization. J. Cell Biol. 157, (6), 1061-1069 (2002).
  35. Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes. Exp. Cell Res. 305, (1), 156-165 (2005).
Analyse af mineraler produceret af hFOB 1,19 og Saos-2 celler ved hjælp af transmissions elektronmikroskopi med Energy Dispersive X-ray mikroanalyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).More

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter