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Chemistry

Analisi di minerali prodotto da hFOB 1.19 e Saos-2 cellule mediante microscopia elettronica a trasmissione con microanalisi a raggi x dispersiva di energia

doi: 10.3791/57423 Published: June 24, 2018

Summary

Vi presentiamo un protocollo per confrontare lo stato di minerali in vescicole rilasciate da due linee di cellule di osso umano: hFOB 1,19 e Saos-2. I profili di mineralizzazione sono stati analizzati da Alizarin Red-S (AR-S) colorazione, ultravioletto (UV) luce visualizzazione, formazione immagine di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione e microanalisi a raggi x dispersiva di energia (EDX).

Abstract

Questo video presenta l'uso di microscopia elettronica di trasmissione con microanalisi a raggi x dispersiva di energia (TEM-EDX) di confrontare lo stato di minerali in vescicole rilasciate da due linee di cellule di osso umano: hFOB 1,19 e Saos-2. Queste linee cellulari, dopo il trattamento con acido ascorbico (AA) e β-glicerofosfato (β-GP), subiscono transdifferenziazione osteogenica completa dalla proliferazione di mineralizzazione e produrre vescicole di matrice (MVs) che attivano la nucleazione apatite nella matrice extracellulare (ECM).

Basato su Alizarin Red-S (AR-S) colorazione e analisi della composizione dei minerali in lisati cellulari utilizzando la luce ultravioletta (UV) o in vescicole usando la formazione immagine TEM seguita da EDX quantificazione e mappatura dello ione, possiamo dedurre che osteosarcoma Saos-2 e osteoblastica le cellule hFOB 1.19 rivelano profili distinti di mineralizzazione. Cellule Saos-2 mineralizzano in modo più efficiente rispetto alle cellule hFOB 1.19 e producono più grandi depositi di minerali che non sono visibili ai raggi UV, ma sono simili a idrossiapatite (HA) in quanto hanno le sostituzioni più Ca e F.

I risultati ottenuti con queste tecniche ci permettono di concludere che il processo di mineralizzazione è diverso a seconda del tipo di cella. Proponiamo che, a livello cellulare, l'origine e la proprietà delle vescicole predeterminare il tipo di minerali.

Introduction

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L'osso è un tipo di tessuto connettivo composto da due parti: organici (cellule e fibre collagene) e minerali (composti di calcio e fosfato). I componenti principali di minerali nelle ossa sono apatiti1. Diversi tipi di cellule competenti di mineralizzazione in osso (osteoblasti), nei denti (odontoblasti) e nella cartilagine (condrociti) regolano i passi iniziali di mineralizzazione di produrre proteine della matrice extracellulare (ECM) e rilasciare la matrice vescicole (MVs) (Figura 1). MVs sono 100-300 nm diametro vescicole che si accumulano di calcio e fosfato facilitando la nucleazione apatite e successivamente associare al collagene2,3. Quindi, MVs disintegrarsi per rilasciare apatiti al medium extracellulare. Le apatiti continuano a crescere a contatto con le fibre di collagene e formano la matrice dell'osso. La mineralizzazione è sostenuta dal costante rifornimento di Pio e Ca2 + nel mezzo extracellulare. Alcuni dati recentemente pubblicati supportano il nostro modello4,5. Tessuti molli non mineralizzare in condizioni fisiologiche. Tuttavia, la calcificazione ectopica può verificarsi in condizioni patologiche come calcificazione vascolare3. Le cellule vascolari che acquisiscono il fenotipo degli osteoblasti in grado di produrre MVs che inducono la nucleazione di apatiti e avviare mineralizzazione negli strati della parete mediale e intimale dei vasi sanguigni. Dal calcificazione ectopica assomigliano endochondral normale mineralizzazione3, comprendere i meccanismi molecolari della mineralizzazione delle cellule ossee e condrociti dovrebbero fornire alcuni indizi sulla calcificazione ectopica dei tessuti molli che sono formato.

Lo sviluppo di tessuti scheletrici è regolato da vari enzimi, fattori di crescita e promotori o inibitori della mineralizzazione. L'azione antagonistica di tessuto-non specifico fosfatasi alcalina (TNAP) (Figura 1) ed ectonucleotide pirofosfatasi/fosfodiesterasi ho (NPP1), insieme a ankyrin (ANK), controlla concentrazione pirofosfato inorganico (PPho) 6. PPho, un potente inibitore della formazione HA, è idrolizzato di TNAP; NPP1 idrolizza i trifosfati del nucleotide per formare PPho mentre ANK PPho Esporta dalla cella alla ECM. Il rapporto di Pi/PPi può disciplinare l'apatite formazione7,8 con possibili conseguenze patologiche9.

La membrana di MV è arricchita in proteine di trasporto dello ione che facilitano la precipitazione iniziale di calcio e fosfato all'interno la MVs durante il processo di nucleazione (Figura 1). Il trasportatore del fosfato 1 (PiT) consente di incorporare Pho generato nello spazio perivesicular nel MVs10,11. Annexins possono essere coinvolti nell'associazione e nel trasporto di Ca2 + e nel processo biofisico che avvia la mineralizzazione del MV lumen12,13. Favoriamo l'ipotesi, suggerito in precedenza, per mineralizzazione all'interno di vescicole intracitoplasmatiche di nucleazione interno di apatite dentro la MV prima della sua propagazione nell'ECM14,15. Modellazione in vitro hanno confermato l'induzione di Ca2 +/ pho complessi formazione nei proteoliposomi effettuata in PS e AnxA516. Ciò potrebbe indicare che accumulo di Ca2 +, Pho, complessi AnxA5 e PS in "lipid rafts" di membranesrepresent i microvilli-come il nucleo di nucleazione (NC) di apatite all'interno Mvs Annexins e TNAP possiedono anche collagene-associazione capacità che possono essere utili nel mettere MVs lungo le fibre di collagene e, nello stimolare la propagazione di mineralizzazione in ECM. Fetuina A e osteopontina (OPN)17, sono noti come inibitori della formazione di apatite che possono rallentare la propagazione della mineralizzazione sul patibolo collageno. Nucleazione e propagazione sono eventi distinti, il primo precede quest'ultimo, ed entrambi possono essere rilevanti per il processo di mineralizzazione patologico.

Per scoprire come la chimica dei complessi di fosfato di calcio può cambiare fisiologico mineralizzazione e calcificazione ectopica, è necessario identificare i minerali prodotti dalle cellule. Apatiti sono un gruppo di calcio e fosfato contenente minerali con cristallo generale unità cella formula Ca10(PO4) di6X2, dove X = Cl, F, OH. Essi sono classificati come segue18: fluorapatite (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 e idrossiapatite (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.

La scelta di linee cellulari di osteoblasti per indurre la formazione di minerali è fondamentale, poiché ogni linea cellulare esibisce un profilo distinto di mineralizzazione. In questo rapporto, abbiamo confrontato la nucleazione dei minerali da due modelli di cella selezionata umana di mineralizzazione: cellule osteoblastic hFOB 1.19 e cellule di osteosarcoma Saos-2. Cellule derivate da osteosarcoma sono comunemente usate come modelli osteoblastiche e cellule Saos-2 hanno conservato il carattere osteoblastic più maturo19 mentre le cellule indifferenziate hFOB fetale umano sono ampiamente usate come un modello per il normale osteoblastic differenziazione20. I profili di mineralizzazione sono stati analizzati con metodi diversi: Alizarin Red-S (AR-S) colorazione, ultravioletta visualizzazione luce (UV), formazione immagine di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione, quantificazione di energia dispersiva x-ray microanalisi (EDX) e dello ione mappatura. Il vantaggio di TEM-EDX su tecniche alternative utilizzate negli studi precedenti è che dà risultati quantitativi e qualitativi della sostituzione dello ione in cristalli di apatite4,5,21. L'obiettivo generale dell'utilizzo di TEM-EDX era di trovare un metodo semplice per l'imaging e quantificazione della distribuzione degli ioni Ca, F e Cl in vari minerali da diversi tipi di cellule durante fasi distinte del processo di mineralizzazione. Questo metodo è stato utilizzato con successo, ad esempio, per monitorare l'interazione delle nanoparticelle di zinco con i prodotti chimici coesistenti e loro effetti combinati su organismi acquatici22. In un altro studio, un photocatalyst rame su materiali di titanio in soluzione acquosa è stato ampiamente caratterizzato mediante spettrometria ad emissione ottica al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES), N2 physisorption (BET), XRD, DRS UV-vis, FT-IR, Raman spettroscopia, TEM-EDX e photoelectrochemical misure23. Il nostro obiettivo era di confrontare l'origine e la proprietà di vescicole e minerali in due linee cellulari per comprendere il meccanismo che controlla la mineralizzazione durante la differenziazione ossea.

Figure 1
Figura 1 . Schema delle fasi iniziali di mineralizzazione in cellule ossee che coinvolge la sintesi di proteine della matrice extracellulare (ECM) ed il rilascio delle vescicole della matrice (MVs) dalla membrana. MVs accumulare calcio attraverso l'azione di proteine leganti il calcio, annexins e fosfato, attraverso l'azione di un trasportatore di fosfato inorganico (PiT) seguita dall'attività del tessuto non specifico della fosfatasi alcalina (TNAP), che defosforila PPio Pho, quindi facilitante la nucleazione apatite. Quindi, MVs si disintegrano e rilasciare apatiti al medium extracellulare. La mineralizzazione è sostenuta dal costante rifornimento di Pio e Ca2 + in extracellulare media4,5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

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1. cultura e trattamento delle cellule

  1. Mettere tutti i materiali necessari sotto la cappa a flusso laminare e sterilizzarli sotto luce UV. Terreni di coltura sono: una miscela 1:1 di prosciutto di media F12 e DMEM con 2,5 mM L-Glutammina completati con 100 U/mL di penicillina, 100 U/mL di streptomicina, 0,3 mg/mL G418 e 10% siero bovino fetale (FBS) (v/v) per feto umano hFOB 1.19 grande T antigene SV40 transfettate osteoblasti e medio 5A di McCoy con 1,5 mM L-Glutammina completato con 100 U/mL di penicillina, 100 U/mL di streptomicina e 15% FBS (v/v) per le cellule di osteosarcoma umano Saos-2.
  2. Coltura di cellule hFOB 1.19 a 34 ° C in un'atmosfera di 5% CO2 e cellule Saos-2 a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO2. Trasferimento di colture cellulari, entrambi hFOB 1.19 o Saos-2 cellule, dall'incubatrice per la cappa a flusso laminare e cambiare il mezzo a 10 mL di terreno di coltura fresco con FBS.
  3. Incubare le cellule senza stimolatori (cellule quiescenti) o stimolarli con 50 µ g/mL di acido ascorbico (AA) seguita da 7,5 mM β-glicerofosfato (β-GP), preparato in precedenza in acqua ultrapura e filtrata attraverso filtri per siringa 0,22 µm. Aggiungere gli stimolatori da microcentrifuga plastica sulla superficie del terreno di coltura. Delicatamente mescolare il piatto di cultura e incubare per 7 giorni.

2. rilevazione di minerali di calcio

  1. Lavare le colture cellulari con tampone fosfato salino (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10mm Na2HPO4, 1mm KH2PO4, pH 7.0).
  2. Aggiungere 5 mL di 2% (g:100 mL) AR-S in PBS, pH 5.0 e incubare le piastre per 30 min a macchiare i minerali.
  3. Lavare 3 volte con PBS. Con attenzione aggiungere PBS al muro piatto, cercare di non distruggere i minerali.
  4. Osservare i minerali di calcio sotto un microscopio ottico invertito e prendere le immagini.

3. visualizzazione delle sonde ai raggi UV.

  1. Per lisati cellulari, colture cellulari, sia a riposo o stimolato per 7 giorni, un trattamento secondo il protocollo di digestione della collagenosi24.
  2. Raccogliere il mezzo dalle colture delle cellule e lavare le cellule con PBS.
  3. Digerire le cellule con 3 mL di collagenasi di U/mL 500 in una soluzione di 0,25 M saccarosio, 0,12 M di NaCl, KCl e buffer di 0,02 M Tris-HCl, pH 0,01 M 7,45, a 37 ° C per 3 h.
  4. Meccanicamente raschiare le cellule, trasferirli in plastica per microcentrifuga e farli passare 10 volte attraverso una siringa di U mL 40 1 con 0,5 × 16 ago.
  5. Centrifugare i campioni a 500 × g per 5 min.
  6. Scartare il surnatante e sospendere il pellet cellulare in 500 µ l di linfa sintetica di cartilagine (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1,83 mM NaHCO3, 0,57 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glucosio, saccarosio 63mm, 16,5 mM Hepes, pH 7.4).
  7. Trasferire l'idrossiapatite (HA), fluorapatite (FA) e chlorapatite (CA) polveri dalle bottiglie sul transilluminatore UV con una spatola e utilizzare come controlli.
  8. Trasferire i lisati cellulari dai tubi in plastica con punte di plastica e inserire con attenzione il transilluminatore UV.
  9. Prendere immagini sotto visibile e UV luce.

4. preparazione delle sonde per TEM-EDX

  1. Preparazione di minerali per la macchiatura negativa
    1. Sospendere 2,5 mg di prodotto sinteticamente HA, CA e FA di minerali25 in 500 µ l di acqua deionizzata e incubare a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO2 per 1 h.
    2. Prendete griglie Formvar/carbonio 300 Mesh Ni dal box con una pinza antistatica, posto su un piatto di porcellana multi-pozzetto e rilasciare 10 µ l di sospensioni HA, CA e FA le griglie.
    3. Asciugare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti.
  2. Preparazione di riposo e hanno stimolato le cellule per l'incorporamento di 26
    1. Raccogliere medio da colture cellulari e lavare le cellule con il mezzo di desensibilizzazione fisiologico (PD) (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10mm NaHCO3, 1mm KH2PO4, glucosio di 10 mM, 20 mM HEPES, pH 7.4).
    2. Fissare le cellule con 5 mL di una miscela di glutaraldeide di 3% (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL) in tampone fosfato di sodio di 100 mM, pH 7,2 per 1 h a temperatura ambiente sotto la cappa.
    3. Lavare le cellule con 5 mL di tampone fosfato di sodio 100 mM e rimuovere delicatamente il buffer dopo il lavaggio.
    4. In camera oscura, postfix i campioni con 2 mL di 1% tetrossido di osmio (g:100 mL) in tampone fosfato di sodio di 100 mM, pH 7,2, per 20 min a temperatura ambiente sotto la cappa.
    5. Rimuovere il tetrossido di osmio e utilizzarlo.
    6. Lavare le cellule con 5 mL di tampone fosfato di sodio 100 mM.
    7. Quindi, disidratare i campioni in aliquote di 5 mL di una serie di soluzione di etanolo graduato a temperatura ambiente: 25% (vol.) per 5 min, 50% (vol.) per 10 min, 75% (vol.) per 15 min, 90% (in volume) per 20 min. Infine utilizzare etanolo assoluto due volte e incubare per 30 minuti e 12 ore.
    8. Meccanicamente raschiare le cellule dai piatti di cultura Petri in plastica, raccogliere in plastica per microcentrifuga e centrifugare i campioni a 130 x g per 1 min.
    9. Togliere i surnatanti e sospendere le cellule in 1 mL di una miscela di resina bianca di LR ed etanolo assoluto a un rapporto di volume di 1:2.
    10. Mescolare bene il contenuto delle provette di vetro prima dell'uso ed incubare per 30 min a temperatura ambiente.
    11. Centrifugare i campioni a 130 x g per 1 min.
    12. Rimuovere i surnatanti e ripetere il passaggio precedente con 1 mL di una miscela 1:1 di resina bianca di LR ed etanolo assoluto.
    13. Mescolare bene e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
    14. Centrifugare i campioni a 130 x g per 1 min.
    15. Rimuovere i sovranatante.
    16. Infine, aggiungere 1 mL di resina pura LR White ai campioni due volte e incubare per 1 h a temperatura ambiente in tubi di plastica.
    17. Posto 500 µ l di ciascun campione in capsule di gelatina.
      Nota: I campioni sono etichettati utilizzando un piccolo foglio di carta e una matita in modo che la resina non distrugge le etichette.
    18. Chiudere le capsule di gelatina, metterle in plastica per microcentrifuga e centrifugare a 130 x g per 1 min in un rotore.
    19. Rimuovere le capsule dai tubi plastica utilizzando una pompa a vuoto.
    20. Spostare i campioni al forno e polimerizzare a 56 ° C per 48 h.
    21. Preparare i blocchi di montarli nel supporto e li taglio alla piramide.
    22. Inserire il titolare l'ultramicrotomo, allegare il coltello di diamante Ultra 45° e riempirlo con acqua deionizzata; Ricordarsi di pulire la lama da bolle d'aria accidentale.
    23. Quindi tagliare sezioni (700 Å) utilizzando il coltello di diamante sul bagno di acqua deionizzata.
    24. Impostare gli scarti utilizzando bovina ciglia e posto che loro sul lato lucido del Formvar/carbonio 300 mesh Ni griglia e farle asciugare.
    25. Preparare il 2,5% (vol.) acetato di uranile in etanolo assoluto al buio sotto una cappa aspirante. Mantenere l'acetato di uranile in un contenitore di piombo e ricordate di non raccogliere il sedimento.
    26. In camera oscura, colorante di contrasto le griglie di apatiti sintetici e campioni di cellule con acetato di uranile 2.5% (vol.) in etanolo per 20 min a temperatura ambiente sotto la cappa.
    27. Lavare le griglie in etanolo al 50% (da Vol.), poi in acqua deionizzata e asciugare a temperatura ambiente per 24 h. Infine, mettere le griglie nella casella.

5. TEM-EDX Analysis

  1. Formazione immagine TEM di un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) attrezzata con microanalisi a raggi x dispersiva di energia di gamma completa (EDX) sistema e 11 Megapixel fotocamera
    1. Preparare un titolare di berillio per l'osservazione dei minerali e delle cellule. Utilizzare strumenti di antistatici.
    2. Rimuovere la coppia di viti e sollevare il piatto di berillio e rondella di berillio lontano dal resto del fermo.
    3. Montare la griglia, il lato lucido, sul supporto.
    4. Posizionare la rondella di berillio e la piastra di berillio e riavvitare le viti di fissaggio.
    5. Mettere la porta nella camera del vuoto e accendere la pompa del vuoto.
    6. Una volta raggiunto il vuoto, delicatamente inserire il supporto della camera di imaging e girare sulla trave.
    7. Sul monitor fluorescente, impostare i parametri di apertura del microscopio. Eseguire la correzione di astigmatismo di immagine; impostare lo zoom, messa a fuoco e telaio; e prendere le immagini TEM ad un ingrandimento di 50, 000 X.
  2. Imaging e microanalisi a raggi x per analisi spettrale e compositiva del gambo
    1. Inserire il rilevatore di raggi x (EDX) dispersiva di energia nella trasmissione scansione microscopia elettronica (STEM) imaging camera.
    2. Regolare la nitidezza dell'immagine in modalità messa a fuoco.
    3. Prendere immagini di staminali a un ingrandimento di 15, 000 X.
    4. Selezionare un punto nell'esempio per microanalisi a raggi x e raccogliere gli spettri.
    5. Ottenere dati sommando tutti i pesi atomici per tutti gli elementi della tavola periodica nel campione (come 100%) e che significa il contenuto degli elementi selezionati: Ca, F, Cl e P (come % atomica). Quindi, calcolare i rapporti di Ca, F o Cl a P per ogni campione.
  3. Mappatura dello ione
    1. Selezionare elementi quali calcio, fluoro, cloro e fosforo per rendere agli ioni mapping ed eseguire mappe EDX degli elementi selezionati nei campioni.
    2. Per ottenere dati che indica la localizzazione di elementi analizzati: Ca, F, Cl e P (come % atomica) e calcolare la co-localizzazione (in %) di Ca, F o Cl con P per ogni campione.

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Representative Results

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TEM-EDX consente per l'imaging in vitro delle vescicole di matrice (MVs) rilasciate da mineralizzante di cellule e di minerali prodotti da Mvs i risultati ottenuti con questa tecnica dimostrano che il processo di mineralizzazione può procedere in modo diverso in vari tipi di cellule. Le linee due cellulari ricevuto lo stesso trattamento di transdifferenziazione osteoblastica, ancora stimolato le cellule Saos-2 in modo più efficiente rispetto hFOB mineralizzata 1,19 osteoblasti, come evidenziato da AR-S colorazione (Figura 2). Questo potrebbe essere dovuto il fenotipo più maturo degli osteoblasti di Saos-2 cellule19 rispetto hFOB 1.19 cellule20. La visualizzazione dei campioni usando un transilluminatore UV reso chiaro che solo fluorapatites può essere osservato alla luce UV (Figura 3). Immagini TEM indicato che cellule Saos-2 stimolate producano altre vescicole contenenti sali minerali rispetto alle cellule stimolate hFOB o con cellule Saos-2 (Figura 4, pannelli di sinistro e centrali) a riposo. Apatiti sintetici hanno forme diverse di minerali (Figura 4, pannello di destra). Immagini TEM ha mostrato la presenza di vescicole in hFOB 1,19 e Saos-2 cellule sotto riposo e stimolato condizioni (Figura 5, pannello sinistro). Su EDX ione mappe, i punti rossi indicano calcio, punti verdi mostrano fosforo e punti blu indicano le distribuzioni di fluoro (Figura 5, pannello centrale). Condizioni stimolati, c'è una forte sovrapposizione tra le distribuzioni di calcio e fosforo in vescicole prodotte da cellule Saos-2 e tra fluoro e fosforo in vescicole prodotte da cellule hFOB 1.19 (Figura 5, pannello di destra).

Figure 2
Figura 2 . AR-S colorazione dei minerali (rosso) prodotto da hFOB 1.19 (pannello superiore) e Saos-2 (pannello inferiore) cellule sia a riposo (R) o dopo 7 giorni di stimolazione con AA e β-GP (S). Bar: 25 µm. Un risultato tipico con n = 3 è presentato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Visible (pannello superiore) e visualizzazione di luce UV (pannello centrale) di sintetico HA, CA e FA minerali e minerali prodotte da hFOB 1.19 (pannello sinistro inferiore) e Saos-2 (pannello inferiore destra) cellule sia a riposo (R) o dopo 7 giorni di stimolazione con AA e β-GP (S) . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 4
Figura 4 . Immagini di TEM di vescicole e minerali prodotte da hFOB 1.19 (pannello di sinistra) e Saos-2 (pannello centrale) cellule sia a riposo (R) o dopo 7 giorni di stimolazione con AA e β-GP (S). Sintetico HA, CA e FA minerali vengono visualizzati come controlli (pannello di destra). Bar: bianco 500 nm, nero 250 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 5
Figura 5 . Immagini di TEM (pannello di sinistra) di hFOB 1.19 e Saos-2 cellule sia a riposo (R) o dopo 7 giorni di stimolazione con AA e β-GP (S). Ione maps for Ca (rosso), Cl (giallo), F (blu) e P (verde) da EDX (pannello centrale). Co-localizzazione di elementi (pannello di destra): calcio a fosforo (Ca), fluoro al fosforo (F), o cloro al fosforo (Cl) è stato quantificato basata sulle mappe EDX. Bar: 500 nm. Tre esperimenti indipendenti per entrambe le linee cellulari sono stati eseguiti. Dieci immagini da ciascuna variante (riposo e stimolato) sono state prese, poi da 2 a 6 di loro sono stati selezionati per ulteriore calcolo di co-localizzazione di elemento. Un risultato tipico è presentato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

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Discussion

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Nella carta attuale, abbiamo descritto i protocolli per la macchiatura, identificazione di luce UV di fluoroapatite AR-S e TEM-EDX in vitro la formazione immagine di MVs rilasciato da mineralizzante di cellule e di minerali prodotto da MVs. È possibile indirizzare tutti i metodi sopra indicati di seguito alcuni passaggi di risoluzione dei problemi comuni. Per ottenere risultati ottimali, diversi passaggi critici devono essere eseguite con attenzione. In primo luogo, è meglio aggiungere AA (che è acido) seguita da β-GP (che è alcalina) per mantenere il pH 7.4 nel terreno di coltura. In secondo luogo, dopo l'AR-S colorazione, i depositi di calcio macchiato sono molto fragili e le cellule devono essere lavate con grande cura per prevenire la distruzione dei cristalli all'aggiunta di PBS. In terzo luogo, tenere sempre l'acetato di uranile in un contenitore di piombo e non raccogliere il sedimento perché solo la frazione diluita deve essere utilizzata per la fissazione. In quarto luogo, ricordate che AA e uranile acetato sono sensibile alla luce e deve essere gestita in camera oscura. In quinto luogo, la miscela di bianco di LR con etanolo assoluto deve essere mescolata bene prima di essere aggiunti ai campioni. In sesto luogo, i campioni in capsule di gelatina dovrebbero essere etichettati utilizzando un piccolo foglio di carta e una matita in modo che la resina non distrugge le etichette. Settimo, la lama del coltello di diamante deve essere accuratamente pulita da eventuali bolle d'aria. Ottavo, i campioni devono trovarsi con cautela sul lato lucido della griglia dove è situato il film Formvar/carbonio. Nono, posizionare correttamente il punto in cui microanalisi a raggi x e dello ione viene eseguito il mapping all'immagine TEM per limitare possibili problemi con il riconoscimento di apatite.

Sebbene il protocollo presentato si è rivelata più favorevole nel nostro disegno sperimentale, è possibile modificarlo per soddisfare obiettivi diversi. Come con qualsiasi altra tecnica, anche questo ha i suoi limiti. Tecniche aggiuntive, quali FTIR, dovrebbero essere applicate per confermare o verificare l'esistenza del rapporto ottenuto degli elementi esaminati8,12,26. Il metodo di TEM-EDX presentato qui è un miglioramento significativo per quanto riguarda il metodo esistente, che è una combinazione di metodi di mappatura e chemiometrica basati su micro-Raman ed è simile all'imaging di nanoparticelle d'argento (AgNPs) distribuzione ai vari superfici del minerale e del meccanismo delle loro interazioni molecolari21. Acquisizione di immagini basata su Raman è stato testato su due modelli minerali (macro - e micro-imprese). Mappe di Raman di n = 600-900 spettri per ogni campione/controllo sono stati analizzati dal software di Vespucci e i risultati sono stati confermati tramite altri metodi quali ICP-OES, AFM e SEM-EDX. I nostri TEM-EDX Mappe: costituito da n = 30 fotogrammi e n = 6 spettri per ogni campione/controllo inoltre sono stati analizzati dal software Suite di microanalisi, e i risultati sono stati confermati tramite altri metodi quali FTIR, FM, TEM, SPM e 3D topografica AFM4 , 5. la microanalisi EDX TEM proposta, come l'imaging basato su Raman, richiede solo una preparazione minima del campione, è super sensibile, non invasivo e conveniente e può essere estesa ad altri sistemi rilevanti per l'ambiente umano.

La tecnica presentata potrebbe essere utilizzata in un ampio campo di ricerca in futuro. Può essere modificato per l'indagine sui diversi apatiti naturali e sintetici. Esso può anche essere regolato per adattarsi i protocolli degli esperimenti con biologico e chimico sonde. Inoltre, tutti gli elementi della tabella periodica possono essere analizzati al fine di visualizzare non solo la morfologia dei minerali, ma anche cambiamenti nella loro composizione dello ione e sostituzioni. Lo scambio ionico in apatiti è una procedura nota per applicazione biomedica27. Un possibile fattore fisiologico che controlla l'ioni Ca, F e Cl o Sr, Mg, Mn e Zn sostituzione di ioni metallici nell'HA durante la formazione del minerale, che è un punto di svolta tra mineralizzazione fisiologici e patologici, potrebbe essere la Pi/PPi rapporto7. Se applicata correttamente, questa tecnica permette di eseguire il mapping di più elementi della stessa regione cellulare, vescicolare o minerale più volte in una fila.

Negli ultimi anni, molto progressi riguardo ai meccanismi di osso mineralizzazione28,29,30,31,32,33. Ci siamo resi conto che diverse linee cellulari possono avere profili distinti di vescicole e formazione minerale. A questo proposito, abbiamo selezionato due linee cellulari umane: osteoblastic hFOB 1.19 e l'osteosarcoma Saos-2, che vengono sottoposte a completare transdifferenziazione osteogeniche da proliferazione di mineralizzazione e produrre MVs che attivano la nucleazione apatite in ECM 34 , 35.

AR-S la macchiatura dei giacimenti del calcio ha rivelato che cellule Saos-2 stimolate mineralizzata diversamente che hFOB 1.19 osteoblasti. Ciò è stata correlata con la produzione dei minerali dalle cellule Saos-2 che erano non rilevabili ai raggi UV in contrasto con quelle prodotte dalle cellule hFOB 1.19. I nostri dati di TEM-EDX ha rivelato che i minerali prodotti in vescicole delle cellule Saos-2 erano simili a sintetico HA dovuto la sovrapposizione in distribuzioni di calcio e fosforo. Al contrario, la sovrapposizione in fluoro e fosforo distribuzioni in vescicole dalle cellule hFOB 1.19 indicato la formazione di altri tipi di minerali oltre a apatiti.

In conclusione, i nostri risultati indicano che le vescicole sono elementi determinanti di nucleazione di minerali, soprattutto al livello cellulare5,25. Inoltre i nostri dati sono in accordo con una precedente teoria che MVs può essere considerato come una forma specializzata di microvescicole che sono in grado di avviare mineralizzazione sia all'interno che all'esterno della cella4. Il confronto delle vescicole rilasciate dalle cellule Saos-2, che mineralizzano in modo più efficiente, e vescicole rilasciate dalle cellule hFOB 1.19 utilizzando il metodo microanalitico TEM-EDX sostiene l'ipotesi che MVs sono vescicole piene di minerale. Questo lascia aperta la questione se la presenza di MVs è necessaria per indurre la nucleazione apatite, e come questo può alterare fisiologico alla patologico mineralizzazione.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

MK e ASK eseguite operazioni manuali e LB preparato disegni e ha realizzato il film. ASK ha scritto il manoscritto, LB ha scritto la sceneggiatura e MK preparato il tavolo. SM, RB e SP leggere criticamente la tabella, la sceneggiatura e il manoscritto. Gli autori vorrei ringraziare Hanna Chomontowska per la sua eccellente assistenza con ultramicrotomia nonché Szymon Suski e Henryk Bilski per la loro eccellente assistenza con analisi TEM-EDX. Gli autori vorrei ringraziare dr Patrick Boschetti per correzione di lingua inglese professionale e Barbara Sobiak per le istruzioni di registrazione.

Questo lavoro è stato supportato da grant N N401 140639 del ministero polacco della scienza e dell'istruzione superiore per ASK, da sovvenzioni dal National Science Centre, Polonia 2016/23/N/NZ4/03313 LB e 2016/23/N/NZ1/02449 MK, EU FP7 progetto BIOIMAGINE : BIO-IMAGing in ricerca innovazione e formazione, GA n. 264173 e dai fondi statutari dell'Istituto Nencki di biologia sperimentale, Accademia polacca delle scienze.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture PAA E15-813 1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium PAA E82312-0025 for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin) Sigma P0781-100ML 100 U/mL each
G-418 Sigma 68168 0.3 mg/mL
FBS Gibco 10270 10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA Sigma A-5960 50 µg/mL
ß-GP Sigma G9422-100G 7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel Bio-Rad 130-0420 for HA
FA synthesized by us
CA synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture Sigma S7907/S8282 0.1 M, pH 7.2
PBS pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS Sigma A5533-25G 0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA Sigma C2674 500 U/mL
SCL buffer prepared by us
Deionized wather produced by us
Ethanol POCh BA6480111 absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol Polysciences Inc. 21447-25 0.25 g/10 mL
PD medium pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde) Sigma 158127/G-6257 3%:1%
Post-fixation OsO4 Sigma 75633 1%
LR White resin in ethanol Polysciences Inc. 17411-MUNC 500g 1:2, 1:1, 100%
Acetone CHEMPUR 111024800 pure
Tool
Cryogenic vials Corning Inc. 430487 1.2 mL
Plastic Petri culture dishes Falcon 353003 100 mm
Plastic tubes Falcon 352096 and 352070 15 and 50 mL
Serological pipettes Falcon and VWR 357521 and 612-3700 1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes Sigma Z688312 and Z628034 1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips VWR 613-0364, 613-0239 and 613-1050 0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks Light Labs A-7055-Z, A-7053-C green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save Thermo Scientific Co. KS12 HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell Thermo Scientific Co. 150 34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood POLON WCS-2 for TEM stainings
Glass bottles SIMAX 1632414501050 and 1632414501100 50 and 100 mL
Quartz glass tubes SIMAX 638422010100 Ø 10 mm, L 100 mm
Pump IBS Integra Biosciences VACUSAFE comfort for vacuum
Oven Memmert UNE 400 56°C
Porcelain multi-well plate Rosenthal technik 229/12 12 wells
Glass beakers SIMAX 632417010025 25 mL
Glass bottles Pocord DIN22 10 mL
Plastic box Agar Scientific Ltd. for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules Agar Scientific Ltd. G3741 size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box Agar Scientific Ltd. S162N3 film on the shiny side
Silicon cell scraper Sigma SIAL0010-100EA size 1.8/25 cm
Syringe with needle BogMark 007 syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe Chirana CH005L 5 mL
Centrifuge MPW Medical Instruments MPW-350R 130 x g and 500 x g
UV transluminator UVP M-20 for visible and UV light
Ultramicrotome LKB NOVA 700Å sections
Block holder LKB E6711 round shape
Diamond knife DiATOME Ultra 45° size 3
Eyelash holder bovine, prepared by us
Forceps ROTH 2855.1 antistatic for grids
Spatulas set ROTH E286.1 antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope Zeiss with Canon AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9 Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses Nikon Nikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D
for movie recordings
Microphone MXL Mics Tempo for voice recordings

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Analisi di minerali prodotto da hFOB 1.19 e Saos-2 cellule mediante microscopia elettronica a trasmissione con microanalisi a raggi x dispersiva di energia
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Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).More

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).

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